专利名称：结合人白介素-18的抗体及制备和使用方法
结合人白介素-18的抗体及制备和使用方法本申请是申请号为“01807735. 8”，发明名称为“结合人白介素-18的抗体及制备和使用方法”的发明专利申请的分案申请。相关申请本申请要求于2000年2月10日申请的、题目是“结合人白介素-18的抗体及制备和使用方法”的美国临时专利申请顺序号60/181，608的非临时专利申请的优先权，该专利申请的内容通过引用结合到本文中。另外，整个本申请引用的包括参考文献、授予的专利和公布的专利申请的所有引用参考文献的内容均通过引用结合到本文中。
背景技术：
白介素-18(IL-18)最早于1989年被描述为干扰素-γ诱导因子(IGIF)，它是除了能够诱导干扰素Y外还具有各种功能的促炎细胞因子。这些生物学特性包括激活 NF-Kb, Fas配体表达、诱导CC趋化因子和CXC趋化因子以及增加产生感受态人免疫缺陷病毒。由于IL-18能够诱导T细胞和巨噬细胞内产生干扰素Y，因此它在Thl型免疫应答中起重要作用且参与先天性免疫和获得性免疫。IL-18在结构和功能上与IL-I家族有关。有关IL-18结构、功能和生物活性的综述，参见例如Dinarello，C.等(1998) J. Leukoc. Biol. 63 658-654 ；Dinarello, C. A. (1999)Methods 121-132 和 Dinarello，C. Α. (1999) J. Allergy Clin. Immunol. 103 :11_24。特别需要调节各种各样的人免疫应答中的IL-18。具体来说，与IL-18结合并中和IL-18的抗体是特别理想的。此外，由于存在小鼠抗体给予人体的相关问题，例如血清半寿期短、不能触发某些人类效应子功能并且在人体内诱发针对小鼠抗体不需要的免疫应答 (“人抗小鼠抗体”(HAMA)反应)，因此小鼠IL-18抗体的体内应用受到限制。一般而言，尝试克服与将完全小鼠抗体用于人类相关的问题，已经涉及对所述抗体进行基因工程改造以使其更“人样化(human-like)”。例如，已经制备出这样的嵌合抗体其中所述抗体链的可变区来源于小鼠，而所述抗体链的恒定区来源于人(Junghans等 (1990)Cancer Res. 50 1495-1502 ；Brown 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. 88 :2663_2667 ； Kettleborough 等(1991)Protein Engineering. 4 :773_783)。然而，因为这些嵌合人源化抗体仍保留某些小鼠序列，所以它们仍可能诱发不需要的免疫反应、人抗嵌合抗体(HAMA) 反应，当长期给予时情况尤其如此。针对小鼠抗体或其衍生物(例如嵌合抗体或人源化抗体)的优选IL-18抑制剂将完全是人抗IL-18抗体，由于这样的药物不会诱发HAMA反应，因此即使长期应用也不会诱发HAMA反应。然而，这样的抗体本领域尚未见介绍，因此仍然需要这样的抗体。发明概述本发明涉及结合人IL-18的诸如抗体的化合物以及制备和应用这类化合物或抗体的方法。一方面，本发明涉及能够结合人IL-18氨基酸序列或其部分的化合物，其中所述氨基酸包含SEQ ID NO 70或SEQ ID NO 71提供的人IL-18的N末端部分或C末端部分。
4在一个实施方案中，所述化合物是一种小分子、肽、多肽、抗体或抗体片段，例如完全人抗体或片段。另一方面，本发明涉及能够与人IL-18结合的人单克隆抗体或其抗原结合部分。 在其它实施方案，根据表面等离子体共振(surfaceplasmon resonance)测定，所述抗体或其片段与人IL-18解离的koff速率常数为0. Is-I或以下、Ix 10E-2 s_l或以下、Ix 10E-3s-l或以下、Ix 10E-4s-l或以下、Ix 10E_5s_l或以下、Ix 10E-6s_l或以下；或者抑制人IL-18活性的IC50为Ix 10E-6或以下、Ix 10E-7或以下、Ix 10E-8或以下、Ix 10E-9 或以下、Ix 10E-10或以下、或Ix 10E-11或以下。另一方面，本发明涉及这样的分离抗体或其抗原结合部分它结合包含氨基酸 PLFEDMTDSDCRDNA (SEQ ID NO 1) ,VIRNLNDQVLFIDQ (SEQ ID NO :33)或二者任何一个的一部分的人IL-18表位。所述抗体最好是中和抗体。所述抗体最好是人抗体。在各种实施方案中，所述抗体是重组抗体(例如单链抗体(scFv))或单克隆抗体。在其它实施方案中，所述分离抗体或其抗原结合部分与人IL-18表位或二者任何一个的一部分结合，其中根据表面等离子体共振测定，所述抗体或其抗原结合部分与人 IL-18解离的k。ff速率常数为0. Is"1或以下；或者其抑制人IL-18活性的IC5tl为Ix 10_6M 或以下。或者，根据表面等离子体共振测定，所述抗体或其抗原结合部分与人IL-18解离的 k。ff速率常数为Ix KT2iT1或以下；或者抑制人IL-18活性的IC5tl为Ix 10_7M或以下。或者， 根据表面等离子体共振测定，所述抗体或其抗原结合部分可以与人IL-18解离，其k。ff速率常数为Ix ΙΟ、—1或以下；或者可以抑制人IL-18活性，其IC5tl为Ix 10_8M或以下。或者， 根据表面等离子体共振测定，所述抗体或其抗原结合部分与人IL-18解离的< 速率常数为Ix ICT4iT1或以下；或者抑制人IL-18活性的IC5tl为Ix 10_9M或以下。或者，根据表面等离子体共振测定，所述抗体或其抗原结合部分与人IL-18解离的k。ff速率常数为Ix IO-5S-1 或以下；或者抑制人IL-18活性的IC5tl为Ix ΙΟ,Μ或以下。或者，根据表面等离子体共振测定，所述抗体或其抗原结合部分与人IL-18解离的k。ff速率常数为Ix ΙΟ、—1或以下；或者抑制人IL-18活性的IC50为IxlO-11M或以下。本发明的另一方面涉及含有能够结合IL-18表位的至少一个可变区⑶R结构域的分离的人抗体或其抗原结合部分。在相关实施方案中，所述分离抗体或其抗原结合部分的可变区含有如表6或表9所示的重链和/或轻链CDRl结构域、CDR2结构域或CDR3结构域， 所述结构域可以在表7-8和表10-11中所示的任一 Kabat位置上或邻近所述位置具有例如一个或多个氨基酸取代或插入。在一个优选实施方案中，所述分离抗体或其抗原结合部分含有一个含氨基酸序列SEQ IDNO 29的轻链可变区(LCVR)和一个含氨基酸序列SEQ ID N0:26的重链可变区(HCVR)。在另一个优选实施方案中，所述分离抗体或其抗原结合部分含有一个具有氨基酸序列SEQ ID NO 29的轻链可变区(LCVR)和一个具有氨基酸序列SEQ ID NO 27的重链可变区(HCVR)。本发明的另一方面涉及包含本发明的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的药用组合物。在一个实施方案中，所述药用组合物还包含至少一种另外的治疗其中 IL-18活性是有害的疾病的治疗药物。本发明的另一方面涉及制备结合人白介素-18(IL_18)的抗体的方法。本发明提供的方法包括将抗体库(antibody repertoire)暴露于包含含氨基酸
5PLFEDMTDSDCRDNA (SEQ ID NO 1) ,VIRNLNDQVLFIDQ (SEQ ID NO :33)或二者任何一个的一部分的人IL-18表位的抗原；并且从所述抗体库选择结合包含氨基酸PLFEDMTDSDCRDNA(SEQ IDNO :1)、VIRNLNDQVLFIDQ(SEQ ID NO 33)或者二者任何一个的一部分的人IL-18表位的抗体。在一个实施方案中，所述抗体库是动物体内的体内抗体库，所述方法包括用包含以下组分的抗原免疫所述动物包含氨基酸PLFEDMTDSDCRDNA (SEQ ID NO :1)、 VIRNLNDQVLFIDQ (SEQID NO 33)的人IL-18表位、人IL-18的N末端部分或C末端部分(SEQID NO 70-71)或这些表位中任一表位的一部分。在另一个实施方案中，所述抗体库是重组抗体文库，所述方法包括用含有以下组分的抗原筛选所述文库具有氨基酸 PLFEDMTDSDCRDNA (SEQ ID NO 1)、VIRNLNDQVLFIDQ (SEQ ID NO 33)的人 IL-18 表位、SEQ ID N0:31-32和SEQ ID NO :34_60表示的肽或任一前述组分的一部分。所述文库最好是人抗体文库。另一方面，本发明提供编码任一上述方面的抗体(例如重链和/或轻链可变区) 或其部分的分离核酸。在相关实施方案中，所述编码抗IL-18抗体或其部分的分离核酸位于重组表达载体中，例如在宿主细胞中表达。因此，另一方面，本发明涉及采用已经导入所述重组表达载体中的前述宿主细胞合成结合人IL-18的抗体的方法，所述方法包括在培养基中培养所述宿主细胞直到所述细胞合成结合人IL-18的抗体。本发明的另一方面涉及抑制人IL-18活性的方法，所述方法包括将人IL-18与本发明的抗体或其抗原结合部分接触，使得人IL-18活性被抑制。本发明的再一方面涉及抑制罹患其中人IL-18活性是有害的疾病的病人体内的人IL-18活性的方法，所述方法包括给予所述病人本发明的抗体或其抗原结合部分，使得所述病人体内的人IL-18活性被抑制。在一个实施方案中，可以例如在给予另外的药物之前、同时或之后，给予所述抗IL-18抗体，所述另外的药物例如抗IL-12抗体或其抗原结合片段、氨甲蝶呤、抗TNF抗体或其抗原结合片段、皮质类固醇、环孢菌素、雷帕霉素、Π(506或非甾体消炎药。附图简述
图1显示与IL-I β (左)和ILlRA(右)相比的IL_18(中间)的结构模型。图2显示与IL-18受体复合的IL-18的结构模型，其中IL-18的包含氨基酸 PLFEDMTDSDCRDNA (SEQ ID NO 1)的肽表位以深灰色表示。该肽表位被抗IL-18抗体2E1结
口 O图3显示与IL-18受体复合的IL-18的结构模型，其中IL-18的包含氨基酸 VIRNLNDQVLFIDQ (SEQ ID NO 33)的肽表位以深灰色表示。该肽表位被抗IL-18抗体LT28
纟口口。图4显示与IL-18受体复合的全长IL-18的结构模型。球形浅灰色和深灰色表位代表IL-18的N末端和C末端接触表位(分别为SEQID NO :70和71)。图5显示三种不同的抗IL-18抗体中和IL-18的生物效应的效价与抑制KGl细胞内IFN-Y诱导作用的关系。抗体125H(方框)和2ElIgG抗体(圆形)或2E1单链抗体 (三角形)的 IC50 值分别为 2. 1E-10、9· 0E-10 和 3. 3E—9。
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发明详述本发明涉及选择能够对IL-18介导的信号转导产生中和作用的抗体的肽表位、制备抗这些表位的抗体以及这些抗体的应用，包括用来治疗涉及IL-18的疾病。选择表位的策略必须构建IL-18蛋白及其相应的受体的同源性模型。然后组合应用目测和计算估计选择用于合成和抗体产生的代表性肽区段。本文所示的氨基酸序列运用标准单字母缩写代码。IL-18表位的诜择运用程序Modeler (Sali, Α.等，通过MODELLER评价比较性蛋白质建模 (Evaluation of comparative protein modeling by MODELLER)。Proteins :Struct., Funct.，Genet. (1995)，23 (3)，第 318-26 页。CODEN =PSFGEY ；ISSN 0887-3585)产生用于 IL-18和IL-18受体两者的同源性模型。IL-I β (Priestle,J.等，人白介素_1 β的三维结构精石角至Ll 2. 0. ANG.分彭争率(The three-dimensional structure of human interleukin-1. beta, refined to 2. 0. ANG. resolution)。Prog. Clin. Biol. Res. (1990), 349 (Cytokines Lipocortins Inflammation Differ.),第 297-307 页)和 IL-1RA(Schreuder，H.等， 白介素-1受体拮抗剂的精细晶体结构二硫键和顺式脯氨酸的存在(Refined crystal structure of the interleukin-1 receptorantagonist :presence of a disulfide link and a cis-proline)。Eur. J. Biochem. (1995)，227 (3)，第 838-47 页)的 X 射线晶体结构是可得到的并且用作IL-18模型构建的参考坐标。应用IL-I受体结构(Viger， G.等，与白介素-I β复合的I型白介素-I受体的晶体结构(Crystal structure of the type-1interleukin-l-receptor complexed with interleukin_l· beta)。Nature(London) (1997)，386 (6621)，第 190-194 页)对 IL-18 受体建模。下文进一步描述IL-18和IL-18受体的结构模型建立。IL-18模型建立与所述两种蛋白质(即IL-I β和IL-18)的总体序列同源性低，然而，令人信服的证据是IL-18是IL-I家族成员(参见Dinarello，C. A. IL-18 一种THl诱导型促炎细胞因子及 IL-I 家方矣新成员(IL-18 :aTHl-inducing, proinflammatory cytokine and new member of the IL-lfamily)。J.Allergy Clin. Immunol. (1999),103 (1, Pt.1),第 11-24页)，并且总体蛋白质折叠非常相似。和IL-Ιβ —样，IL-18最初以前体形式分泌出来。前体 IL-I β (pro-IL-1 β )和前体 IL-18 (pro_IL_18)两者均被 IL-I β 转化酶(ICE) 激活(Fantuzzi, G.和 Dinarello，C. Α.白介素-18 和白介素-1 β :ICE(caspase-1)的两种细胞因子底物(Interleukin-18 andlnterleukin-l β :two cytokine substrates for ICE (caspase-1))。J. Clin. Immunol. (1999)，19 (1)，第 1-11 页)。还知道 IL-1 受体和IL-18受体相似(Dinarello，C. Α.等，白介素-18的综述不止是一种干扰素、诱导因子(Overview of interleukin-18 :more than an interferon- y inducingfactor)。 J. Leukocyte Biol. (1998)，63 (6)，658-664)。IL-I β 能够与 IL-18 受体结合。虽然这两种蛋白质间的总体序列同源性和IL-18的序列同源性相同，但是作为最终论证，IL-I β和 IL-IRA显示出相同的折叠。对这三种蛋白质(即IL-18、IL-li3和IL1-RA)间的序列比对运用程序InsightII人工进行。该序列比对可以参见表1 表1 JL-18与IL-I β和IL-IRA的序列比对
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IL-18 YFGK-LESKLS-VIRMLNDQVLH*IDQGNRPLFE--DMT-DSDCRD--NAP IL-Ιβ AP-VRS-LNCTLRDSQQKSLVMS-G—P-YELKALHLQGQ--D--MEQ IL-1RA: SSKMQA-FR~IWDVNQKTFYLR-N~N—QLVAGYLQGP—NVNLEE
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IL一 18 RTIFIISMY-KDSQPRG-MAVTISVKCEK]:STLSC----ENK-IISFKEM
IL-Ιβ QWFSMS-FVQGEESNDKIPVALGLK-EKNLYLSCVLK-DDKPTLQLESV IL-1RA: KI--DV——VP-IBPH——ALFLGIH-GG细CLSCV-KSGDETRLQLEAV
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IL-18 NPPDNI-KDTKSDIIF-FQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACE-KERDL IL-Ιβ DPKNYP-KK-KMEKRFVFNK-I-EINNKLEFESAQFPNWYISTS-QAENM IL-IRA NITDLSENR-KQDKRFAFIR-S-DSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQ-
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IL-18:FKLILKKED-ELGDRSIM-FTVQNED(SEQIDNO:4)IL-Ιβ:-PVFL—GG-TKGGQDITDFTMQFVSS(SEQIDNO:5)IL-1RA:-PVSL--TNMPDEGVMVTKFYFQBD(SBQIDNO:6)这些序列之间的序列同源性在表2中列出。向上三角形为严格序列同一性百分率，向下三角形为保守序列同源性百分率。仅表1中报道的完整序列中的部分序列在表2 中考虑。如上所述，所述家族间的总体同源性低但稳定。表2 IL-I家族成员间的序列同源性
分子IL-18IL-I βIL-IRAIL-IRecIL-18RecIL-1820. 021. 8IL-Ib53. 527. 5IL-IRA50. 654. 4IL-IRec26. 1IL-18Rec50. 5所得IL-18结构连同IL-I β和IL-IRA 一起图示于图1中。程序What_ Check (Hooft, R. W.等，蛋白质结构中的错误(Errors in ProteinStructures) NatUre(1996)381，第272页)评价的总体质量是合理的，但是稍微有点低(参见下表3)。表3 :ffhat_Check的结构Z-分值(正值优于平均值)
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权利要求
1.能够结合人IL-18的人单克隆抗体或其抗原结合部分。
2.权利要求1的抗体，其中根据表面等离子体共振测定，所述抗体或其抗原结合部分与人IL-18解离的k。ff速率常数为0. Is"1或0. Is"1以下；或者它抑制人IL-18活性的IC5tl 为 Ix ICT6M 或 Ix ICT6M 以下。
3.权利要求1的抗体，其中根据表面等离子体共振测定，所述抗体或其抗原结合部分与人IL-18解离的k。ff速率常数为Ix IO-2S-1或IxKT2iT1以下；或者它抑制人IL-18活性的 IC50 为 Ix ICT7M 或 Ix ICT7M 以下。
4.权利要求1的抗体，其中根据表面等离子体共振测定，所述抗体或其抗原结合部分与人IL-18解离的k。ff速率常数为Ix IO-3S-1或IxKT3iT1以下；或者它抑制人IL-18活性的 IC50 为 Ix ICT8M 或 Ix ICT8M 以下。
5.权利要求1的抗体，其中根据表面等离子体共振测定，所述抗体或其抗原结合部分与人IL-18解离的k。ff速率常数为Ix ΙΟ、—1或IxlO-4S-1以下；或者它抑制人IL-18活性的 IC50 为 Ix ICT9M 或 Ix ICT9M 以下。
6.权利要求1的抗体，其中根据表面等离子体共振测定，所述抗体或其抗原结合部分与人IL-18解离的k。ff速率常数为Ix IO-5S-1或lxlO、—1以下；或者它抑制人IL-18活性的 IC50 为 Ix IiT10M 或 Ix IiT10M 以下。
7.权利要求1的抗体，其中根据表面等离子体共振测定，所述抗体或其抗原结合部分与人IL-18解离的k。ff速率常数为Ix ICTfV1或IxliTfV1以下；或者它抑制人IL-18活性的 IC5tl 为 Ix IiT11M 或 Ix IiT11M 以下。
8.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是中和抗体。
9.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是重组抗体。
10.分离的核酸，所述核酸编码权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合部分。
11.权利要求10的分离核酸，所述核酸位于重组表达载体内。
12.宿主细胞，所述宿主细胞内已经导入了权利要求11的重组表达载体。
13.合成结合人IL-18的人抗体的方法，所述方法包括在培养基中培养权利要求12的宿主细胞，直到所述细胞合成结合人IL-18的人抗体为止。
14.药用组合物，所述组合物包含权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。
15.权利要求14的药用组合物，所述组合物还包含至少一种另外的治疗药物。
16.权利要求15的药用组合物，其中所述另外的药物选自能够结合人IL-12的抗体或其片段、氨甲蝶呤、抗TNF、皮质类固醇、环孢菌素、雷帕霉素、Π(506和非留体消炎药。
17.用于治疗自身免疫病症的权利要求14-16中任一项的药用组合物。
18.制备结合人白介素-18(IL-18)的人抗体的方法，所述方法包括将人抗体库暴露于包含人IL-18表位或其部分的抗原；从所述人抗体库选择结合人IL-18表位或其部分的人抗体。
19.权利要求18的方法，其中所述抗体库是动物体内抗体库，并且所述方法包括用包含人IL-18表位或其部分的抗原免疫所述动物。
20.权利要求19的方法，其中所述体内抗体库是整合入所述动物基因组中的完全人免疫球蛋白库。
21.在体外降低人IL-18活性的方法，所述方法包括将人IL-18与权利要求1_9中任一项的抗体或其抗原结合部分接触，使得人IL-18活性被降低的步骤。
22.权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗罹患自身免疫病的人个体的药物中的用途。
23.权利要求23的用途，其中所述自身免疫病选自哮喘、系统性红斑狼疮、骨关节炎、 牛皮癣性关节炎和牛皮癣。
24.权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合部分在制备用于抑制人IL-18活性的药物中的用途。
25.权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗罹患自身免疫病的患者的药物中的用途，其中权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合部分在给予第二种药物之前、同时或之后给予，其中所述第二种药物选自抗IL-12抗体或其抗原结合片段、 氨甲蝶呤、抗TNF抗体或其抗原结合片段、皮质类固醇、环孢菌素、雷帕霉素、FK506和非甾体消炎药。
26.权利要求25的用途，其中所述自身免疫病选自哮喘、SLE、骨关节炎、牛皮癣性关节炎和牛皮癣。
全文摘要
本发明涉及结合人白介素-18的抗体及制备和使用方法。本发明提供了结合人白介素-18(hIL-18)的抗体、尤其是结合人IL-18表位的抗体。所述抗体可以是例如完整的人抗体、重组抗体或单克隆抗体。优选抗体对hIL-18具有高亲和力并且在体外和体内均中和hIL-18活性。本发明的抗体可以全长抗体或其抗原结合部分。本发明也提供本发明抗体的制备方法和应用方法。本发明的抗体或抗体部分可用来检测hIL-18和可用来抑制hIL-18活性，例如抑制罹患其中hIL-18活性是有害的疾病的病人体内的hIL-18活性。
文档编号A61K45/00GK102206277SQ20111008840
公开日2011年10月5日 申请日期2001年2月9日 优先权日2000年2月10日
发明者A·R·敦坎, B·拉布科夫斯基, C·P·索尔罗克, J·E·汤普森, J·曼科维奇, J·萨菲尔德, M·怀特, M·罗古斯卡, R·W·迪克松, S·M·布洛克勒胡尔斯特, S·N·伦纳德, T·哈于尔 申请人:雅培制药有限公司