专利名称：α-甘露聚糖肽作为疫苗佐剂的应用及基于该应用制备的疫苗制剂的制作方法
技术领域：
本发明专利属于疫苗制剂技术领域，特别涉及α-甘露聚糖肽作为疫苗佐剂的应用及基于该应用制备的疫苗制剂。
背景技术：
佐剂是指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力或改变免疫反应类型的物质。理想的佐剂应具有有效性、安全性、稳定性和经济性等特点。目前，通过佐剂增强疫苗的免疫原性已经成为疫苗开发的一个关键领域。佐剂疫苗的主要优势在于减少保护性免疫所需的抗原量。这种剂量节约效应有助于增加可用疫苗剂量的数量，这一点在传染病流行期间因制药商的供货能力有限而不能满足需求时显得尤为重要。疫苗佐剂的另一个优点是能提高年幼人群和老年人免疫力的潜能，这是目前多数疫苗所缺乏的。目前常用的佐剂包括铝佐剂、脂质体、弗氏佐剂、粘膜免疫佐剂、CpG序列等，它们均能有效增强抗原的免疫性，但经美国FDA批准的上市人用疫苗佐剂仅有铝佐剂，而其促进细胞免疫应答的能力弱，并可诱发机体产生IgE抗体，引起不良过敏反应。据悉，诺华公司和葛兰素史克公司目前正在加快开发适用于老年人的流感疫苗新技术，这两家公司均已收到了欧盟批准他们分别用其水包油乳液MF59和AS03研发流感疫苗的申请。美国Juvaris生物治疗制剂公司(JuvarisBioTherapeuticsdnc.)是一家开发治疗感染性疾病和癌症的佐剂疫苗和免疫治疗制剂的公司，该公司开发的用于预防老年人流感的疫苗JVRS-100，目前正在为进行II期临床试验招募受试者。目前甲型(HlNl)流感的流行已重新激发了各国政府有关机构和疫苗研发人员对在流感疫苗中添加佐剂的重视， 现已有数个政府机构加大了疫苗佐剂研发的投资，多家疫苗研发公司也已启动对甲型流感疫苗的各种佐剂的潜在效果的临床实验。甘露聚糖肽是西安交通大学医学院(原西安医科大学)首创的一种生物反应修饰物，曾用名多抗甲素，是从正常人咽喉部分离的甲型溶血性链球菌33#株的深层培养液中经乙醇提取得到的一种甘露聚糖肽，是我国首创的新型免疫增强剂。研究表明低浓度的 α -甘露聚糖肽即可激活机体细胞免疫和体液免疫机能，具有免疫调节作用，能提升外周白细胞，增强网状内皮系统吞噬功能，活化巨噬细胞及淋巴细胞，诱导胸腺淋巴细胞产生活性物质，改善和增强机体免疫功能和应激能力；并可激活吞噬细胞、NK和Τ、B细胞亚群，具有诱生干扰素和白介素等作用，可诱生多种效应细胞和细胞因子产生“细胞因子鸡尾酒”效应。广谱杀灭病毒、致病菌以及广谱诱导瘤细胞凋亡。临床常用于治疗或辅助免疫功能低下导致的各种疾病，其对免疫功能的调节作用主要表现在以下几个方面1、对免疫细胞的作用α -甘露聚糖肽能增强腹腔单核一吞噬细胞的数量和一氧化氮的分泌。可使LDH、碱性磷酸酶活性增强，巨噬细胞吞噬活力和清除异物的能力增强。 对大鼠腹腔内分别注射不同浓度的甘露聚糖肽，结果发现，大鼠腹腔巨噬细胞数量、LDH和 ACP的活性、吞噬活力、NO的分泌以及细胞毒性均随着甘露聚糖肽剂量的增加而增加，同时大网膜乳斑的数量和面积也显著增加。表明腹腔内注射甘露聚糖肽增强了腹腔巨噬细胞的免疫功能。α -甘露聚糖肽还可激活T、B淋巴细胞，诱导胸腺淋巴细胞产生活性物质，促进T 淋巴细胞增殖及转化，改善和增强机体免疫功能和应激能力。低浓度甘露聚糖肽(I-IOmg/ L)可使淋巴细胞合成DNA及RNA功能增强；高浓度(30-100mg/L)作用相反。2、对外周血白细胞的影响α-甘露聚糖肽能促进骨髓造血干细胞造血功能、增强外周血细胞的计数，通过诱生白细胞介素而产生升白作用。研究发现其与中药配合有显著提高白细胞疗效的功能；并能有效预防白细胞下降，可作为原发性肝癌化疗的辅助用药。3、对免疫球蛋白和血清补体的影响α -甘露聚糖肽能使血清IgG、IgA增高、刺激补体生成，提高补体生成水平。用其治疗小儿反复呼吸道感染，用药3个月后血清IgG、 IgA水平显著提高。接种乙肝疫苗是人体抵抗HBV侵袭的卓有成效的方法。但是接种乙肝疫苗后，成人约有15% -30%接种者无免疫应答。刘锐等观察了甘露聚糖肽对促进乙肝疫苗接种者抗体形成的疗效，结果第一针免疫后3个月和第一针免疫后7个月抗-HBs阳转率明显增高；第一针后7个月时抗-HBs滴度试验组为(5 士89. 86)mIU/mL,对照组为 0观士98. 96)mIU/mL，两组比较有极显著性差异(P < 0. 01)，表明甘露聚糖肽能促进乙肝疫苗接种后免疫抗体的形成。
发明内容
本发明解决的问题在于提供α-甘露聚糖肽作为疫苗佐剂的应用及基于该应用制备的疫苗制剂，疫苗免疫效果表明α -甘露聚糖肽是一种有效、稳定、的新型疫苗佐剂。本发明是通过以下技术方案来实现α-甘露聚糖肽作为疫苗佐剂的应用。所述的α -甘露聚糖肽作为疫苗肌肉注射剂、疫苗滴鼻剂或疫苗口服剂的佐剂。α-甘露聚糖肽作为疫苗佐剂与抗原的质量比为α-甘露聚糖肽抗原=10 1000 1。α -甘露聚糖肽的使用量为1 1000mg/kg。优选α -甘露聚糖肽的使用量为5 10mg/kg。所述的α-甘露聚糖肽作为甲型流感疫苗、季节性流感疫苗、EV71手足口病疫苗、 肝炎疫苗、呼吸道类疫苗的佐剂。所述的α-甘露聚糖肽作为肝炎治疗性疫苗、癌症治疗性疫苗、自身免疫性疾病治疗性疫苗的佐剂。一种α -甘露聚糖肽作为佐剂的疫苗肌肉注射剂，以注射用水作为溶剂，在IOOml 疫苗制剂中包含1 50 μ g的抗原和1 IOOOmg的α -甘露聚糖肽。一种α -甘露聚糖肽作为佐剂的疫苗滴鼻剂，以纯水作为溶剂，在IOOml疫苗制剂中包含抗原1 50 μ g、α -甘露聚糖肽、蔗糖10 2000mg、谷氨酸钠1 lOOmg、水解胶原 10 lOOOrng、精氨酸10 lOOOrng、磷酸氢二钾10 IOOOmg和磷酸二氢钾5 500mg。一种α -甘露聚糖肽作为佐剂的甲型Hmi流感滴鼻剂疫苗，以纯水作为溶剂，在 IOOrnl疫苗制剂中包含HA抗原1 50 μ g、α -甘露聚糖肽1 lOOOrng、蔗糖10 2000mg、 谷氨酸钠1 100mg、水解胶原10 lOOOrng、精氨酸10 lOOOrng、磷酸氢二钾10 IOOOmg 和磷酸二氢钾5 500mg。
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与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果α -甘露聚糖肽作为疫苗佐剂具有安全、有效、稳定、价廉的优势，首先α -甘露聚糖肽已经作为免疫增强剂在临床应用，主要剂型为片剂、肌肉注射剂和口服液。因此其安全性已得到充分验证，在免疫用剂量范围内是安全可靠的；其次，α-甘露聚糖肽来源于微生物发酵产物，造价低廉，具有良好的经济效益；尤为重要的是α-甘露聚糖肽可以有效地减少保护性免疫所需要的抗原用量；在相同抗原用量下能够激发更强的免疫反应，特别是能够很好的诱导细胞免疫应答，产生良好的免疫保护作用，这一点是更优于铝佐剂。在不同的疫苗制剂中添加α-甘露聚糖肽作为佐剂之后，在相同抗原用量下能够激发更强的免疫反应，诱导包括体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫的免疫反应的提升，尤其是对粘膜免疫水平的提升具有显著的效果。不同浓度α -甘露聚糖肽与Hmi流感裂解苗配合使用后，血清IgG抗体水平、粘膜分泌型抗体slgA水平均有显著提高，脾淋巴细胞增值率亦大幅提升。
图1为不同浓度的佐剂和抗原配比的Hmi肌肉注射剂在免疫后血清抗体水平比较直方图；图2为不同浓度的佐剂和抗原配比的Hmi肌肉注射剂在免疫后脾淋巴细胞增殖率比较直方图；图3为不同浓度的佐剂和抗原配比的Hmi肌肉注射剂在免疫后粘膜分泌型抗体水平比较直方图；图4为不同浓度的佐剂和抗原配比的Hmi滴鼻剂在免疫后血清抗体水平比较直方图；图5为不同浓度的佐剂和抗原配比的Hmi滴鼻剂在免疫后脾淋巴细胞增殖率比较直方图；图6为不同浓度的佐剂和抗原配比的Hmi滴鼻剂在免疫后粘膜分泌型抗体水平比较直方图。
具体实施例方式本发明提供α -甘露聚糖肽作为疫苗佐剂的应用，是基于在相同抗原用量下添加 α -甘露聚糖肽作为佐剂，能够激发更强的免疫反应，特别是能够很好的诱导细胞免疫应答，产生良好的免疫保护作用；所诱导的免疫反应包括体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫。所述的α-甘露聚糖肽来源于微生物发酵液，包括溶血性链球菌等；菇类菌株发酵液，包括香菇、金针菇、猴头菇等；以及酶转化法，包括纤维素酶、中性细菌蛋白酶等所获得的糖肽。α -甘露聚糖肽作为疫苗佐剂可应用于甲型流感疫苗、禽流感疫苗、季节性多价流感疫苗；乙肝疫苗、丙肝疫苗、戊肝疫苗及其它肝炎疫苗；狂犬疫苗、EV71手足口病疫苗；多价肺炎疫苗、百日咳疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗及其它呼吸道类疫苗；
肝炎治疗性疫苗、癌症治疗性疫苗以及自身免疫性疾病治疗性疫苗及其它治疗性疫苗。下面结合具体的实施例，包括不同疫苗制剂及其免疫效果，对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。实施例1 α -甘露聚糖肽佐剂Hmi疫苗肌肉注射剂及其免疫效果检测1. 1 HlNl疫苗肌肉注射剂及对照制剂的配制疫苗溶液取含HA 420 μ g/mL的Hmi裂解疫苗液40 μ L，加入至360 μ L注射用水中，既10倍量稀释，得到400 μ L浓度为0. 042 μ g/ μ L的疫苗稀释液，记为药液①。Hmi 裂解疫苗由浙江天元生物制品有限公司惠赠。α -甘露聚糖肽溶液取15mga -甘露聚糖肽，溶解于ImL注射用水中，得到ImL浓度为15mg/mL的佐剂溶液，记为药液②。α _甘露聚糖肽购自国药集团川抗制药有限公司。不同配比的Hmi疫苗肌肉注射剂的配制如表1所示，其中，1 2为疫苗对照组， 3 5为不同剂量α -甘露聚糖肽作为佐剂，6为佐剂对照组，7为空白对照组。表1 Hmi疫苗肌肉注射剂的剂量配比表
权利要求
1. α-甘露聚糖肽作为疫苗佐剂的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，α-甘露聚糖肽作为疫苗肌肉注射剂、疫苗滴鼻剂或疫苗口服剂的佐剂。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，α-甘露聚糖肽作为疫苗佐剂与抗原的质量比为α -甘露聚糖肽抗原=10 1000 1。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，α-甘露聚糖肽的使用量为1 1000mg/kg。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，α-甘露聚糖肽的使用量为5 10mg/kg。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的α-甘露聚糖肽作为甲型流感疫苗、 季节性流感疫苗、EV71手足口病疫苗、肝炎疫苗、呼吸道类疫苗的佐剂。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的α-甘露聚糖肽作为肝炎治疗性疫苗、癌症治疗性疫苗、自身免疫性疾病治疗性疫苗的佐剂。
8.—种α-甘露聚糖肽作为佐剂的疫苗肌肉注射剂，其特征在于，以注射用水作为溶齐[J，在IOOml疫苗肌肉注射剂中包含1 50 μ g的抗原和1 IOOOmg的α -甘露聚糖肽。
9.一种α-甘露聚糖肽作为佐剂的疫苗滴鼻剂，其特征在于，以纯水作为溶剂，在 IOOml疫苗制剂中包含抗原1 50 μ g、α-甘露聚糖肽、蔗糖10 2000mg、谷氨酸钠1 lOOmg、水解胶原10 lOOOrng、精氨酸10 lOOOrng、磷酸氢二钾10 IOOOmg和磷酸二氢钾 5 500mg。
10.一种α-甘露聚糖肽作为佐剂的甲型Hmi流感滴鼻剂疫苗，以纯水作为溶剂，在 IOOrnl疫苗制剂中包含HA抗原1 50 μ g、α -甘露聚糖肽1 lOOOrng、蔗糖10 2000mg、 谷氨酸钠1 100mg、水解胶原10 lOOOrng、精氨酸10 lOOOrng、磷酸氢二钾10 IOOOmg 和磷酸二氢钾5 500mg。
全文摘要
本发明公开了α-甘露聚糖肽作为疫苗佐剂的应用。α-甘露聚糖肽作为疫苗佐剂具有安全、有效、稳定、价廉的优势，首先α-甘露聚糖肽已经作为免疫增强剂在临床应用，主要剂型为片剂、肌肉注射剂和口服液。因此其安全性已得到充分验证，在免疫用剂量范围内是安全可靠的；其次，α-甘露聚糖肽来源于微生物发酵产物，造价低廉，具有良好的经济效益；尤为重要的是α-甘露聚糖肽可以有效地减少保护性免疫所需要的抗原用量；在相同抗原用量下能够激发更强的免疫反应，特别是能够很好的诱导细胞免疫应答，产生良好的免疫保护作用，这一点是更优于铝佐剂。
文档编号A61K39/29GK102166356SQ20111009130
公开日2011年8月31日 申请日期2011年4月12日 优先权日2011年4月12日
发明者冯素玲, 张卉, 王冰 申请人:西安交通大学