专利名称：一种脑肿瘤磁共振对比剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于医疗检测试剂技术领域，具体涉及用于MRI (磁共振成像)对比增强的脑部肿瘤特异性对比剂及其制备方法。
背景技术：
脑部肿瘤是颅内常见的、严重危害人类健康、致残和死亡率高且疗效差的疾病。近20年来磁共振在临床上的运用使得中枢神经系统影像诊断技术大大提高和进步，它能安全有效地呈现人体组织及器官的结构及功能形态，在临床诊断中已经作为一种常规的检查手段得以应用。MRI检查病例中超过30%需使用对比剂来提高正常组织与病灶的成像对比度，从而提高软组织图像的分辨率使MRI能更敏感地检测微小病灶或特异性病灶。目前主要根据物质的磁化特性将对比剂分为顺磁性和超顺磁性对比剂，顺磁性对比剂一般是钆的 螯合物，超顺磁性对比剂一般是超顺磁性氧化铁对比剂。钆类对比剂有效地提高了磁共振成像MRI的诊断水平，但Gd-DTPA有弛豫率较低、非生物相容性、组织特异性低，渗透压较高，成像时间短、弥散快，选择性低，对肝胆道造影效果差，毒性与游离钆在体内的代谢过程相关，引起肾源性系统纤维化。超顺磁性对比剂被用作磁共振的对比剂可以提高病变组织与正常脑组织的对比度。与传统的钆螯合剂相比，它磁饱和强度高，弛豫率高，粒径小，具有良好的标记基团，可与配体结合提高特异性。而且它具有生物相容性，可以被细胞通过正常的生化代谢途径再利用或最终进入体内铁池，对组织无毒副作用。普通超顺磁性氧化铁对比剂主要被网状内皮系统所识别，例如在肝脏、脾脏及淋巴结等的显像，它们能有效地降低质子弛豫时间，增加弛豫率，使得含有对比剂区域的T2加权图像信号明显降低。但是目前在肝、脾这些系统成像都依赖于被动地标记，包括由正常组织及肿瘤细胞周边的网状内皮细胞摄取而不是直接对肿瘤细胞进行标记。
发明内容
本发明的任务是提供一种脑肿瘤磁共振对比剂，使其具有特异性高、选择性好、对比效果强、毒副作用低、组织浓度足够活体成像等特点特，本发明还提供了这种脑肿瘤磁共振对比剂的制备方法。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种脑肿瘤磁共振对比剂是偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒。用生理可接受的稀释剂将偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒稀释，即可作为脑肿瘤磁共振对比剂使用，所述的稀释剂可以是PBS缓冲液或生理盐水，用生理可接受的稀释剂稀释偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒时，偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒与稀释剂重量mg/体积mL比为10 20 I。所述的超顺磁性氧化铁纳米粒可以是超顺磁性三氧化二铁纳米粒或超顺磁性四氧化三铁纳米粒。所述的超顺磁性氧化铁纳米粒的粒径大小为10 20纳米。
本发明提供的脑肿瘤磁共振对比剂的制备方法，包括以下步骤步骤一、制备活化的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液；步骤二、将转铁蛋白溶解于缓冲液中得到转铁蛋白溶液；步骤三、将转铁蛋白溶液加入活化的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液中得到偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒混悬液；步骤四、去除步骤三得到的偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒混悬液中未反应的转铁蛋白和吸附在超顺磁性氧化铁纳米粒表面的转铁蛋白转铁蛋白。上述步骤一所述的制备活化的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液的方法是取超顺磁性氧化铁纳米粒，分散于pH = 5. O的lmol/L醋酸钠缓冲液中，加入1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(简称EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(简称NHS)(终浓度分别为5mM和12. 5mM)，振荡15分钟，用磁铁除去未反应的EDC和NHS，再按2mg 200ul的比例 加入pH = 7. 4的O. lmol/L PBS缓冲液重新分散超顺磁性氧化铁纳米粒，获得活化后的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液；上述步骤二中所述的将转铁蛋白溶解于缓冲液中制备转铁蛋白溶液的方法是按重量体积比mg/ul为O. 2 : 200的比例将转铁蛋白溶解于pH = 7. 4的
O.lmol/LPBS缓冲液中，得到转铁蛋白溶液；上述步骤三所述的将制备的转铁蛋白溶液加入活化的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液中得到偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒混悬液的方法是将转铁蛋白溶液加入活化的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液中，转铁蛋白溶液与活化的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液的重量用量比为O. Img lmg，室温条件下放置过夜，获得偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒混悬液。上述步骤四所述的去除步骤三得到的偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒混悬液中未反应的转铁蛋白和吸附在超顺磁性氧化铁纳米粒表面的转铁蛋白转铁蛋白的具体方法是用磁铁去除步骤三得到的偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒混悬液中未反应的转铁蛋白，经磁分离得到偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的沉淀，用PBS缓冲液清洗偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的沉淀三至五次，去除吸附在超顺磁性氧化铁纳米粒表面的转铁蛋白，再加入PBS缓冲液重新分散偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒，使其充分混合均匀，得到偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的对比剂。偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的体外表征⑴偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的粒径大小利用透射电镜测定。偶联转铁蛋白前后超顺磁性氧化铁纳米粒的粒径分别为9纳米和14纳米，见图2、图3。(2)偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的弛豫率曲线将偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒用水稀释成不同浓度，加入96孔板中，利用Magnetom A Trio Tim 3. O测定不同浓度的偶联超顺磁性氧化铁纳米粒的T2值，得到偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的弛豫系数(r2)为64. SmT1S'本发明的有益效果通过以下动物实验表明实验动物=Wistar大鼠，湖北预防医学科学院提供，体重在250_300g之间，雄性。设备西门子 MagnetomATrio Tim 3. O(I)肿瘤动物模型的制备在大鼠前因右偏3毫米，前偏I毫米的的位置将颅骨钻开，利用立体定位仪将10μ I含IO6个大鼠胶质瘤细胞(C6细胞)注入该位置，约10天后瘤直径达到(5_X5mm)用于动物成像实验。(2)实验动物成像大鼠肿瘤模型8只，随机分为2组，一组为实验组，尾静脉注射经PBS稀释的偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒对比剂，按12mg/kg 组为对照组，尾静脉注射相同剂量的超顺磁性氧化铁纳米粒对比剂，在2分钟内注射完毕，分别在2小时、24小时、48小时扫描，观察肿瘤部位信号的变化。(3)MR信号值测量方法尽量取相同层面瘤体最大径上的5个圆形区域为感兴趣区(ROI)，面积为2mm2，测其T2WI图像信号强度(Signal intensity, SI)值，然后计算其平均值。(4)数据处理采用SPSS13. O版本统计软件，用随机区组设计资料的方差分析方法对数据进行处理，之后用SNK-q检验进行两两间比较。结果发现，瘤体信号值在注射转铁蛋白偶联的超顺磁性氧化铁纳米粒后，信号呈明显改变，见图7 ;并随着观察时间的延长，试剂转铁蛋白偶联的超顺磁性氧化铁纳米粒有向瘤体四周扩散的趋势，最大改变为50. 86%，见表I。
表I注射超顺磁性氧化铁纳米粒对比剂与注射偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒对比剂的瘤体信号强度值变化率对比
权利要求
1.偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒在制备脑肿瘤磁共振对比剂中的应用。
2.一种脑肿瘤磁共振对比剂，其特征在于它是偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒。
3.根据权利要求2所述的脑肿瘤磁共振对比剂，其特征在于含有生理可接受的稀释剂。
4.根据权利要求3所述的脑肿瘤磁共振对比剂，其特征在于所述的稀释剂可以是PBS缓冲液或生理盐水。
5.根据权利要求4所述的脑肿瘤磁共振对比剂，其特征在于，偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒与稀释剂的重量/体积用量比为10-20mg lmL。
6.据权利要求2所述的脑肿瘤磁共振对比剂，其特征在于，所述的超顺磁性氧化铁纳米粒可以是超顺磁性三氧化二铁纳米粒或超顺磁性四氧化三铁纳米粒。
7.根据权利要求2或6所述的对比剂，其特征在于，所述的超顺磁性氧化铁纳米粒的粒径大小为10 20纳米。
8.一种脑肿瘤磁共振对比剂的制备方法，包括以下步骤 步骤一、制备活化的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液； 步骤二、将转铁蛋白溶解于缓冲液中得到转铁蛋白溶液； 步骤三、将转铁蛋白溶液加入活化的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液中得到偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒混悬液； 步骤四、去除步骤三得到的偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒混悬液中未反应的转铁蛋白和吸附在超顺磁性氧化铁纳米粒表面的转铁蛋白转铁蛋白。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于， 步骤一所述的制备活化的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液的方法是取超顺磁性氧化铁纳米粒，分散于pH = 5. O的lmol/L醋酸钠缓冲液中，加入1_ (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，终浓度分别为5mM和12. 5mM,振荡15分钟，用磁铁除去未反应的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，再按2mg 200ul的比例加入pH = 7. 4的O. ImoI/LPBS缓冲液重新分散超顺磁性氧化铁纳米粒，获得活化后的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液；步骤二中所述的将转铁蛋白溶解于缓冲液中制备转铁蛋白溶液的方法是按重量体积比mg/ul为O. 2 : 200的比例将转铁蛋白溶解于pH = 7. 4的O. lmol/L PBS缓冲液中，得到转铁蛋白溶液；步骤三所述的将制备的转铁蛋白溶液加入活化的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液中得到偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒混悬液的方法是将转铁蛋白溶液加入活化的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液中，转铁蛋白溶液与活化的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液的重量用量比为O. Img lmg，室温条件下放置过夜，获得偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒混悬液；步骤四所述的去除步骤三得到的偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒混悬液中未反应的转铁蛋白和吸附在超顺磁性氧化铁纳米粒表面的转铁蛋白转铁蛋白的具体方法是用磁铁去除步骤三得到的偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒混悬液中未反应的转铁蛋白，经磁分离得到偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的沉淀，用PBS缓冲液清洗偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的沉淀三至五次，去除吸附在超顺磁性氧化铁纳米粒表面的转铁蛋白，再加入PBS缓冲液重新分散偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒，使其充分混合均匀，得到偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的对比剂。
10.根据权利要求I所述的偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒在制备脑肿瘤磁共振对比剂中的应用，其特征在于，所述的偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒按权利要求8或9所述的方法制得。
全文摘要
本发明提供了一种脑肿瘤磁共振对比剂，它是偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒，可含有生理可接受的稀释剂，其稀释剂可以是PBS缓冲液或生理盐水，偶联转铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒与稀释剂的重量/体积用量比为10-20mg∶1mL，所述的超顺磁性氧化铁纳米粒可以是超顺磁性三氧化二铁纳米粒或超顺磁性四氧化三铁纳米粒，超顺磁性氧化铁纳米粒的粒径大小为10～20纳米。本发明对比剂利用转铁蛋白与表面表达转铁蛋白受体的细胞的高亲和力来实现靶向性显影，具有特异性高、选择性好、对比效果强、毒副作用低、组织浓度足够活体成像等特点。
文档编号A61K49/18GK102784400SQ201110129500
公开日2012年11月21日 申请日期2011年5月18日 优先权日2011年5月18日
发明者刘芳, 姜冬玲, 尚亚雷, 尹明媛, 徐海波, 朱艳红, 李欢, 杨祥良, 石浩军, 蒋玮丽, 谢辉, 赵彦斌 申请人:华中科技大学同济医学院附属协和医院