专利名称：：低浓度peg脂质衍生物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及采用低浓度PEG-脂质衍生物/或与其他物质联合应用，消除或者减弱PEG化制剂的加速血液清除现象的配方组成和在药物传递系统中的应用。
背景技术：
：常规的普通(经典/传统)静脉给药系统，如普通脂质体，易被单核巨噬细胞系统(MPS)吞噬，静脉注射后迅速分布至肝、脾等器官，导致脂质体血液循环时间短、靶向性差。为了解决此类问题，研究人员利用聚こニ醇(PEG)类脂质衍生物对脂质体表面进行修饰，利用PEG兼有亲水性、柔顺性的特点，延长脂质体体内循环时间，减少MPS器官/组织的分布量，增加靶向性，也大大提高了载体及药物的物理、化学和生物学稳定性。此项技术被称为PEG化，利用该技术制备的脂质体为PEG化脂质体，亦称为空间稳定脂质体(StericallyStabilizedLiposomes)。以PEG化技术制备的阿霉素脂质体,极大地延长了阿霉素在血液中的循环时间，降低了心脏毒性，并增加其在肿瘤中的分布量，提高抑瘤率。该项研究成果在Nature杂志上发表(LasicDD.Doxorubicininstericallystabilizedliposomes[J].Nature,1996，380:561-562)，由此掀起PEG化脂质体研究的热潮，并取得了较好的成果，如PEG化阿霉素脂质体(Doxil)获得FDA批准用于卡氏肉瘤、卵巣癌等疾病的治疗；PEG化顺钼脂质体的半衰期由原来普通脂质体的20分钟延长至5天等，目前尚有多种PEG化脂质体制剂在临床试验中。鉴于PEG化给药系统具有独特的长循环性与靶向性，研究者们尝试各种方法/手段，在PEG化载体表面上连接配体(如RGD肽、APRPG肽、半乳糖配体、甘露糖配体、葡萄糖、低密度脂蛋白、转铁蛋白、叶酸、血管活性肠收缩肽、细胞膜穿透肽等)和/或抗体，达到主动祀向递药目的,在治疗、诊断(量子点、纳米金、纳米铁、磁流体、同位素、荧光、光化疗、放疗……碘油)、预防等领域中前景广阔。基于临床需要多次给药的考虑，Dams等(DamsETM,LavermanP,OyenWJG,et已丄.Acceleratedbioodclearanceandalteredbiodistributionofrepeatedinjectionsofstericallystabilizedliposomes[J].JPharmacolexpTherj2000，292:1071-1079)以99mTc标记脂质体，研究大鼠重复注射PEG化脂质体后的药动学参数和组织分布变化情況，结果发现第二次注射的脂质体血浆水平表现出极大降低(20分钟时的浓度约为首次注射的10%)，且肝摄取量从8.1±0.8%骤升至46.2±9.8%，此即为加速血液清除(AcceleratedBloodClearance，ABC)现象。2005年，Wang等正式提出ABC现象的定义，即“同一大鼠，以一定的时间间隔两次注射PEG化脂质体，二次注射的PEG化脂质体被快速清除的现象”(WangXY，Ishidai，IchiharaMjetal.Influenceofthephysicochemicalpropertiesofliposomesontheacceleratedbloodclearancephenomenoninrats[J].JControlRelease,2005，104:91-102)，此定义仅局限于大鼠。2008年，Ishida等将此定义修正为“当同一动物以一定时间间隔两次注射PEG化脂质体，二次注射的PEG化脂质体丧失长循环特性的现象，，(IshidaTjKashimaS，KiwadaH.Thecontributionofphagocyticactivityoflivermacrophagestotheacceleratedbloodclearance(ABC)phenomenonofPEGylatedliposomesinrats[J]·JControlRelease,2008,126(2):162-165)。迄今为止，有关ABC现象的研究文章集中在以下几方面。磷脂的剂量Ishida等发现PEG化脂质体的首剂量与ABC现象发生的程度存在M白勺iX才目^'cklshiciaΓ,MasudaK,IchikawaT,etal.AcceleratedclearanceotasecondinjectionofPEGylatedliposomesinmice[J」·IntJPharm,2003,255:167-174)。大鼠首次注射PEG化脂质体，磷脂剂量分别为O(HEPES盐缓冲液)、0.001、0·01、0·1、1、5μmol/kg，5天后注射放射标记的PEG化脂质体(磷脂剂量为5ymol/kg),结果表明二次注射PEG化脂质体的血液清除程度与肝聚集量随首剂量的降低而明显増加。当首剂量磷脂高于Iμmol/kg吋，二次注射的PEG化脂质体血液清除速度与肝聚集量不再继续增加。而Laverman等的研究与上述Ishida的结果存在一定矛盾首次注射磷脂剂量分别为0.05,0.5,5.0μmol/kg的PEG化脂质体，二次注射PEG化脂质体(磷脂剂量5.Oμmol/kg)时均能产生ABC现象(LavermanP,CarstensMG,Boerman0C,etal.Factorsaffectingtheacceleratedbloodclearanceoipolyethyleneglycol—liposomesuponrepeatedinjection[J]·JPharmacolExpTher,2001,298:607-612)。当固定首次注射剂量为5.OμmoI磷脂/kg，二次注射的PEG化脂质体剂量为15或50μmoI磷脂/kg时，产生的ABC现象比5.Oμmol磷脂/kg组明显减弱。最近文献(RepeatedInjectionofHighDosesofHemoglobin-EncapsulatedLiposomes(HemoglobinVesicles)inducesAcceleratedBloodClearanceinaHemorrhagicShockRatModelDRUGMETAB0LISMANDDISPOSITION2011,39(3):484-489)报道，即使高剂量也会产生ABC现象。的浓度目前能够诱导产生ABC现象的PEG化脂质体均以PEG-DSPE为长循环材料，因此有研究者专门对PEG-DSPE在处方中的比例对ABC现象的影响进行考察。首次注射PEG化脂质体中PEG-DSPE占处方脂质摩尔比分别为0、5、10、15%(磷脂剂量为0.001μmol/kg)，5天后注射PEG化脂质体(磷脂剂量为5.0μmol/kg,PEG-DSPE在处方中的摩尔比例为5%)，结果发现ABC现象发生的程度与PEG-DSPE的比例存在明显的反相关含有0%PEG-DSPE的脂质体(即普通脂质体)不产生ABC现象；含有5%PEG-DSPE的脂质体可以诱导产生明显的ABC现象，且伴随肝聚集量显著增加。进ー步增加PEG-DSPE的含量(10、15%)，与5%组相比，二次注射脂质体的清除速率与肝聚集呈现降低趋势，但仍显著高于对照组(P〈0.01)(IshidaT,HaradaΜ,WangXY,etal.AcceleratedbloodclearanceofPEGylatedliposomesfollowingprecedingliposomeinjection:EffectsoflipiddoseandPEGsurface-densityandchainlengthofthefirst-doseliposomes[J].JControlRelease,2005,105:305-317)。Ishida等也发现增加PEG-DSPE的比例能减弱PEG化脂质体对ABC现象的诱导。与首次剂量中PEG-DSPE含量低(小于5mol%)的脂质体相比，若首次注射脂质体中PEG-DSPE含量高(大于10mol%),则其后注射的PEG化脂质体的肝脏蓄积量减少(IshidaT,IchikawaT,IchiharaM,etal.EffectofthephysicochemicalpropertiesofinitiallyinjectedliposomesontheclearanceofsubsequentlyinjectedPEGylatedliposomesinmice[J].JControlRelease,2004,95:403-412)。的分子量有研究表明，首次注射摩尔比均为5%的PEG2000-DSPE和PEG5000-DSPE修饰脂质体(O.OOlμmol磷脂/kg)，5天后注射PEG2000-DSPE修饰的标记脂质体(5μmol磷脂/kg)，均产生明显的ABC现象(未考察二次注射PEG5000-DSPE修饰脂Mイ4·ノkisnidaT,MaedaR,IchiharaM,etal.AcceleratedclearanceofPEGylatedliposomesinratsafterrepeatedinjections[J].JControlRelease,2003,88:35-42)，因此认为PEG的分子量对诱导ABC现象没有影响。Ishida等的结论恰恰相反首次注射PEG5000-DSPE修饰脂质体诱导ABC现象的程度远远低于首次注射PEG2000-DSPE修饰脂质体，PEG5000-DSPE和PEG2000-DSPE修饰脂质体组的肝聚集量分别为35.3±3.8%和78.7±8.8%，表明首次注射脂质体中PEG分子量的増加可以减弱ABC现象。粒径Dams等的研究表明ABC现象与首次注射PEG化脂质体的粒径、表面性质和放射性标记均无关。未标记的小(85nm)或大(400nm)PEG化脂质体均会引起二次注射PEG化脂质体的血液清除速度显著增加，产生明显的ABC现象。注射时间间隔以及连续注射Dams等发现能够诱导ABC现象的两次注射最小时间间隔为5天；Ishida等证明两次注射间隔为7天时ABC现象最为強烈。另有研究报道，大鼠间隔35天第二次注射PEG化脂质体后，间隔4天或7天进行第三次注射PEG化脂质体，其血液清除速度虽略有増加，但无显著性差异，而肝脾聚集量没有变化，说明多次重复注射并不能继续引发ABC现象。而每天注射PEG化脂质体直至第四次均未产生ABC现象。不同动物模型已见报道的用于研究ABC现象的动物包括大鼠、小鼠与恒河猴。Dams等的研究表明，大鼠和恒河猴均可以产生ABC现象，小鼠则不能；而Ishida等的结果表明小鼠体内能够产生明显的ABC现象。近年来，鉴于PEG化载体/药物的独特优势，以及部分产品成功上市，取得了可观的社会效益和经济效益，世界各国政府都投入大量的人力、财ヵ和资源，进行诸如PEG化脂质体、PEG化树枝状(dendrimer)给药系统、PEG化纳米粒、PEG化胶束、PEG化药物、PEG化酶等方面的研究，特别是PEG化结合主动靶向配体、基因转染、细胞穿透肽、RNA干扰治疗等21世纪主攻方向的研究。ABC现象所引发的PEG化脂质体药动学特性的改变在其临床应用中是ー个严重问题，会造成药物或基因治疗效率的下降。Semple等(SempleSし，HarasymΓ0,ClowKA,etal.丄mmunogenicityandrapαbloodclearanceoiliposomescontainingpolyethyleneglycol—lipidconjugatesandnucleicacid[J].JPharmacolExpTher,2005,312:1020-1026)的研究表明，重复注射包封寡核苷酸(0DN)、pDNA或RNA核酶的PEG化脂质体会诱导強烈的免疫应答，导致制剂血液循环时间缩短和小鼠死亡率显著增加。而据复旦大学Lu等(LuW，WanJ,SheZJ,etal.Braindeliverypropertyandacceleratedbloodclearanceofcationicalbuminconjugatedpegylatednanoparticle[J].JControlRelease,2007,118:38-53)的研究报道重复注射阳离子牛血清白蛋白修饰的PEG与PLA交联形成的纳米粒(CBSA-NP)也能产生ABC现象，与PEG化脂质体诱导ABC现象的研究结论基本一致。丄snihara等(IshiharaT,i'akedaM,bakamotoH,etal.Acceleratedbloodclearancephenomenonuponrepeatedinjectionofpeg-modifiedpla-nanoparticles[J].PharmRes,2009,26:2270-2279)发现重复注射PEG修饰的PLA纳米粒引起ABC现象间隔时间为7天时ABC现象最明显，而抗PEG-IgM的量也是在注射7天后最高，这些关于PEG化纳米粒的研究与PEG化脂质体诱导ABC现象的研究结论基本一致。有研究人员采用较小的C14脂质锚定物増加PEG从粒子表面的解离，结果发现会使ABC现象减弱(JudgeAD,McClintockK,ShawJR,etal.Hypersensitivityandlossofdiseasesitetargetingcausedbyantibodyresponsestopegylatedliposomes[J],MolTher,2006,13:328-337)。因此，有研究者提出应用可交换的PEG脂质替换牢固结合于脂质体双分子层的PEG脂质可能是ー个比较好的策略(HeyesJ,HallK,i'aiIorV,etal.synthesisandcharacterizationofnovelpoly(ethyleneglycol)-lipidconjugatessuitableforuseindrugdeliveryPEG[J].JControlRelease,2006，112:280-290)。但脂质交换有可能引起脂质体双分子层膜缺陷，导致所载药物快速泄漏。另外，最近我们利用酷键能够在血浆/组织中酯酶作用下逐渐断裂/降解的性质，首次提出通过可断裂PEG脂质衍生物修饰脂质体来消除或减轻ABC现象(XuH,WangKQ,Dengffl,etal.EffectsotcleavabIePEG-cnoIesteroIderivativesontheacceleratedbloodclearanceofPEGylatealiposomes.Biomaterials,2010;31(17):4757-63.)，但在非胆固醇PEG衍生物方面的研究不详细，我们在国家自然科学基金资助下(No81072602)对MPEG-DSPE等PEG脂质类衍生物不同浓度诱发ABC现象进行较为全面研究，特别是采用低浓度PEG-脂质衍生物単独/或与其他物质联合应用，消除或者减弱PEG化制剂的ABC现象，及其配方组成和在药物传递系统中的应用。至今，有关ABC现象研究中采用的MPEG-DSPE浓度占总脂质浓度5%moL以上，未对低浓度MPEG-DSPE制剂ABC研究。
发明内容本发明的目的是提供低浓度PEG脂质衍生物处方组成在制备减轻或避免加速血液清除(以下简称ABC)PEG化制剂中的应用。—般而言，载体中加入mPEG-DSPE的量达到一定浓度才能产生长循环效果。在同ー动物体内重复注射高浓度PEG脂质衍生物修饰微粒制剂会产生加速血液清除(即ABC)，这对疾病的治疗显然是不利的。我们的实验发现，在乳剂处方组成中，mPEG2000-DSPE与MCT(中链甘油三酷)的质量比大于2%时，才有一定长循环性质，但连续多次注射时，第四次便产生ABC现象。因此，中国专利CN200910223205.5(静脉注射用前列地尔长循环脂微球制剂及其制备方法)与CN200710017685.O(ー种长循环脂肪乳丙泊酚制剂)，其权利要求PEG-磷脂含量分别为O.01%5%与O.02%8%，很显然是不合理的。前列腺素El的衍生物AS-013在治疗时需要隔周给药(改善下肢截肢手术的预后的治疗剂申请号200880006397.8)，这恰恰是获得性免疫反应最强的时间，如果制备成长循环制剂(乳剂、月旨质体)，则存在发生严重免疫反应的可能。本发明人通过大量试验研究发现，利用低浓度PEG脂质衍生物修饰微粒制剂(包括脂质体、囊泡、乳剤、微乳、胶束和纳米粒等制剂)，能够达到减轻或避免重复注射此类PEG化制剂产生ABC的目的，如我们在研究中意外发现，采用mPEG2000-DSPE与油质量百分比为1%的低浓度mPEG2000-DSPE修饰AS-013乳剂，未发生ABC现象。本发明专利所采用的PEG脂质衍生物中PEG与脂质链段通过酯键或酰胺键或者醚键相连。包括磷脂类，如PEG-DSPE、PEG-DPPE、PEG-DMPE、PEG-DLPE;杂化脂肪链类，如单甲氧醚聚こニ醇2000-棕榈酰油酰磷脂酰こ醇胺衍生物(mPEG2000-P0PE)等。所述PEG脂质衍生物中PEG与磷脂酰こ醇胺之间通过羧酸酯酰胺键、碳酸酯酰胺键相连。所述PEG脂质衍生物中PEG分子量为20020000道尔顿。所述PEG脂质衍生物中PEG与磷脂通过醚键相连，PEG分子量为20020000道尔顿。PEG衍生物尚包括Diacylglycerol-PEG(公司名称NOFAmericaCorporation),其结构式如下权利要求1.低浓度PEG脂质衍生物在制备减轻或避免加速血液清除PEG化制剂中的应用。2.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述PEG脂质衍生物中PEG与脂质链段通过酯键或酰胺键或者醚键相连。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述脂质链段为磷脂酰こ醇胺，磷脂酰こ醇胺通过羧酸酯酰胺键、碳酸酯酰胺键与PEG相连。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述脂质链段为磷脂，磷脂通过醚键与PEG相连。5.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述PEG脂质衍生物中PEG分子量为20020000道尔顿。6.如权利要求I所述的应用，其特征在于，所述PEG脂质衍生物的PEG端基是甲氧基、氣基、竣基、轻基、硫酸基、横酸基、憐酸基、疏基等；或连接各种配体、抗体。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的配体、抗体选自半乳糖、叶酸、葡萄糖、转铁蛋白、乳铁蛋白、RGD、细胞穿膜肽、单克隆抗体、多克隆抗体。8.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述PEG脂质衍生物修饰液体微粒制剂，所述的微粒制剂选自脂质体、囊泡、乳剂、微乳、纳米粒制剂；在PEG化乳剤、PEG化微乳、PEG化纳米粒制剂处方中PEG脂质衍生物与油脂的质量百分比小于等于I.5%;脂质体与囊泡处方中PEG-脂质衍生物的摩尔百分比应该小于等于I.5%。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于处方中加入吐温、TPGS,HS15、F68、CremophorRH40>Cremophor35、卖泽、维生素E琥拍酸酯、胆固醇琥拍酸酷、GM1、唾液酸类衍生物ー种及ー种以上混合使用；采用GM1、唾液酸类衍生物可进ー步延长循环时间，不产生ABC现象。全文摘要本发明属于医药
技术领域：
，涉及低浓度PEG脂质衍生物及其应用，具体涉及提供减轻或避免加速血液清除PEG化制剂中的处方组成及其应用。本发明是利用低含量PEG脂质衍生物修饰乳剂、脂质体、囊泡、微乳、胶束和纳米粒等液体微粒制剂，所述PEG脂质衍生物中PEG与脂质链段通过酯键或酰胺键或者醚键相连。PEG分子量为200～20000道尔顿。本发明制备的制剂经过重复注射仅引起轻微的或不能引起加速血液清除，即可以减轻或避免加速血液清除现象产生。且低浓度PEG未降低制剂的体外抗肿瘤活性，加入低浓度PEG脂质衍生物能够增加制剂稳定性，特别是拮抗乳剂的振摇不稳定性。文档编号A61K47/34GK102813929SQ20111015369公开日2012年12月12日申请日期2011年6月9日优先权日2011年6月9日发明者邓意辉,王龙,赵永雪,严米娜,王春玲,马艳玲,佘振南申请人:沈阳药科大学