一种阳离子脂质体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种阳离子脂质体及其制备方法和应用，所述阳离子脂质体由以下重量份的组分采用逆向蒸发法制备而成：1重量份DOPE、1重量份DC-Chol、2.5重量份OQCMC；所述阳离子脂质体复合体以阳离子脂质体为包封层，所述包封层内包封有药物载体、基因载体或基因与药物共载载体中的至少一种。本发明阳离子脂质体由于脂质体成分与细胞膜成分较接近，所以具有更好的生物降解性、生物相容性、低的免疫性、较低的细胞毒性；又由于脂质为两性物质，决定了脂质体既可包载极性化疗药物或非极性化疗药物或同时包载极性与非极性药物。
【专利说明】一种阳离子脂质体及其制备方法和应用
【【技术领域】】
[0001]本发明涉及一种阳离子脂质体及其制备方法和应用。
【【背景技术】】
[0002]非病毒基因载体是基因治疗中目前最有潜力的载体之一，特别是阳离子脂质体，具有相对于病毒基因载体由于其可以大批量生产且生产成本低、可重复、安全性高、低免疫源性、生物相容性好，同时可以载入大小达52kb的外源基因片段等优点。目前该载体已成为基因治疗的研究热点之一。
[0003]虽然目前阳离子脂质体主要由于带较高电荷，可致细胞发生如胞质收缩、抑制正常细胞分裂、抑制蛋白激酶活性、在胞质中产生空泡等毒性，但是通过对阳离子脂质体进行修饰或加入阴性高聚物、辅脂、寻找最佳N/P等手段可以获得高转染率、高的靶向性、低细胞毒性的阳离子脂质体。其在临床上已得到越来越多的应用。其中以阳离子脂质体DMRIE/DOPE为基因载体，将囊性纤维化基因(PGT21)转运至靶细胞，现已处于临床I期研究阶段；目前在德国载有紫杉醇的DOTAP阳离子脂质体已进入临床II期试验。
[0004]至今癌症仍然是不可治愈之症，无论在发达国家还是发展中国家均成为生命的主要杀手。在癌症诱发、促发、恶化的整个过程中，由于其为扩张性、弥漫性侵蚀生长模型，同时整个过程发生机制极其复杂，目前尚未找到一种有效治疗方法。传统癌症治疗方法，如外科、化疗、放疗等， 在大多情况下治疗效果仍然是不理想，因为癌症外科手术后有很大复发可能性，化疗的毒副作用及超过一半的癌症都会产生多药耐药性，放疗对正常组织会有严重杀伤作用，这些均是传统癌症治疗所面临的主要挑战，因此新型、有效的癌症治疗策略亟待出现。阳离子脂质体(cationicliposome, CLP)常由荷正电的磷脂(cationiclipids)与中性辅助磷脂(co-lipids)共同组成。由于带正电的脂质与荷负电的核酸(DNA、RNA、寡聚核苷酸(AODNS))静电作用形成阳离子脂质体-基因复合物(lipoplexes)，再与化疗药物可形成阳离子脂质体-基因-化疗药物三元复合体，通过皮下注射或是腹腔注射，进行血液循环进入靶器官，并与荷负电的细胞膜表面作，通过内吞作用或细胞融合作用过进入胞内，经过一系列运输，最后进入细胞核，进行相关基因表达、沉默(敲除)与药物治疗作用。目前常用的基因载体分为病毒基因载体与非病毒基因载体两类。常见的非病毒基因载体如阳离子高聚物、磷酸钙、阳离子多肽及阳离子脂质体等。其中发展最为成熟的是阳离子脂质体。但缺点是其转染效率仍然低于病毒基因载体，因此有必要研制安全性与转染活性更佳的新型脂质体，采用阳离子脂质体共载基因与化疗药物进行联合治疗，以发挥更好治疗效果。
[0005]联合治疗模型即共载化疗药物与基因，无论在体内还是体外实验中均已证明该模型能够有效抑制肿瘤长、繁殖、扩散。特别是在多药耐(multidrug-resistant,MDR)癌症中发挥更明显作用。近三年来，阳离子脂质体被研究学者广泛用于共载基因与化疗药物进行癌症的联合治疗。
[0006]目前，本领域已有试图通过联合多基因进行癌症治疗的报道，并在体外实验取得一定效果。但是基因干扰技术的瓶颈之一为基因本身的毒性，因此有必要将基因与化疗药物进行共载，特别是在MDR肿瘤模型中，共载基因与药物载体体内外实验结果表明:共载基因与化疗药物阳离子脂质体比单包载基因或化疗药物阳离子脂质体进行治疗，疗效更佳，表现出协同增效作用。
【
【发明内容】
】
[0007]本发明要解决的技术问题之一，在于提供一种阳离子脂质体，其稳定性与转染基因后的转染效率得到了很大的提高。
[0008]本发明是这样实现上述技术问题之一的:
[0009]一种阳离子脂质体，所述阳离子脂质体由以下重量份的组分采用逆向蒸发法制备而成:1重量份D0PE、1重量份DC-Chol、2.5重量份0QCMC。
[0010]本发明要解决的技术问题之二，在于提供一种阳离子脂质体的制备方，该方法制备的阳离子脂质体稳定性与转染基因后的转染效率得到了很大的提高。
[0011]本发明是这样实现上述技术问题之二的:
[0012]一种阳离子脂质体的制备方法，包括以下步骤:
[0013]步骤10 、按配比取I重量份DOPE、I重量份DC-Chol、2.5重量份OQCMC溶于三氯甲烧溶剂中；
[0014]步骤11、将步骤 10得到的溶液拌匀，加入超纯水共混，探头超声IOmin ；
[0015]步骤12、将步骤步骤11得到产物在旋转蒸发仪将残留溶剂去除，真空状态，即得；所述旋转蒸发仪的蒸发温度为35°C。
[0016]本发明要解决的技术问题之三，在于提供一种阳离子脂质体复合体，其能大大减少化疗药物的使用剂量，减少病人的给药次数，大大增加病人的顺延性。
[0017]本发明是这样实现上述技术问题之三的:
[0018]一种阳离子脂质体复合体，其特征在于:所述阳离子脂质体复合体以阳离子脂质体为包封层，所述包封层内包封有药物载体、基因载体或基因与药物共载载体中的至少一种；所述阳离子脂质体由以下重量份组分制备而成:1重量份D0PE、1重量份DC-Chol、2.5重量份OQCMC。
[0019]进一步地，所述基因载体或基因与药物共载载体所载的基因为siRNA中的至少一种。
[0020]进一步地，所述siRNA为MRPl或是Bcl_2基因。
[0021]进一步地，平均每I μ L阳离子脂质体可以包封0.1~3.0μ L的siRNA为10~30 μ Μ。
[0022]进一步地，平均每I μ L阳离子脂质体包封siRNA为2.0~3.0 μ g。
[0023]本发明要解决的技术问题之四，在于提供一种阳离子脂质体复合体制备方法，其便于操作，适用于大规模连续生产。
[0024]本发明是这样实现上述技术问题之四的:
[0025]一种阳离子脂质体复合体的制备方法，包括以下步骤:
[0026]在容器中加入空白阳离子脂质体或载有PTX紫杉醇的阳离子脂质体，然后与基因siRNA混匀，孵化20~30min，即可得到CLP-siRNA复合体或是CLP_PTX_siRNA复合体。
[0027]进一步地，所述的一种阳离子脂质体复合体在制备共载基因与化疗药物中用途。[0028] 本发明要解决的技术问题之五，在于提供一种基因药物制剂，使得阳离子脂质体复合体能够以各种形式进行更好的给药。
[0029]本发明是这样实现上述技术问题之五的:
[0030]一种基因药物制剂，所述基因药物制剂是由阳离子脂质体复合体添加药学上可以接受的辅助性成份制备而成的。
[0031]本发明具有如下优点:
[0032]本发明阳离子脂质体配方独特，通过在传统DC-Cho 1-DOPE中加入适当比例0QCMC，很好地提高了阳离子脂质体的稳定性及粒径分布，球形度，表面形态；并与传统DC-Chol-DOPE相比，其稳定性与转染基因的后的转染效率得到了提高。
[0033]本发明中的待包封物质是阳离子脂质复合体中被脂质体所静电吸引部分及所被包进脂质体的部分。本发明阳离子脂质体复合体是将上述阳离子脂质体作为包封材料，将待包封物质包封后形成复合体，还可同时添加药学上可以接受的辅料并按照本领域公知制剂方法制备药物复合体。
[0034]本发明阳离子脂质体可以包封一般的药物活性成份制成阳离子脂质体制剂，也可以包封相关基因制成阳离子脂质体转染制剂，也可以共载基因与化疗药物制成共载基因药物载体。而这个共载基因与化疗药物载体是本领域已公知的，经过转染进入细胞，可以抑制相关肿瘤蛋白的表达或促肿瘤细胞凋亡，同时本发明的共载载体克服了传统化疗缺点，可以大大减少化疗药物的使用剂量，减少病人的给药次数，大大增加病人的顺延性。
[0035]本发明的阳离子脂质体的制备方法，不仅改进了所用原料及用量，并优化了制备参数，还便于操作，适用于大规模连续生产。该方法能得到较窄的粒径分布的阳离子脂质体，且具有良好的稳定性，易与基因及化疗药物形成三元复合体，基因、PTX包封率高，特别是基因与载体结合牢固，并能延长载体在体内的半衰期用提高基因药物的生物利用度。
[0036]用本发明的阳离子脂质体共载基因与化疗药物所形成三元复合体，能显著提高其对多药耐药癌症细胞的转染率，还能避免体内免疫系统对载体的清除，提高其作用效果，降底临床药物使用剂量，同时也降低阳离子脂质体本身的毒副作用。总的说来，本发明脂质体的稳定性和包封率，转染率均得到提高，具有很好的应用价值。本发明共载基因与化疗药物用于肿瘤治疗，可以有效抑制肿瘤的生长，药物的使用剂量也大大降低，并可用于静脉注射以治疗肺癌，卵巢癌，乳腺癌，肝癌等多药耐药性癌症，非常适于临床使用。本发明制备方法简单高效，适合大规模连续生产，具有良好的应用情景。
【【专利附图】
【附图说明】】
[0037]下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0038]图1为本发明阳离子脂质体CLP红外光谱图。
[0039]图2为本发明阳离子脂质体CLP-siRNA的粒径与电位图。
[0040]图3为本发明阳离子脂质体空白CLP与CLP-siRNA的TEM图。
[0041 ]图4为本发明空白CLP与CLP-siRNA的AFM图。
[0042]图5为本发明CLP-s iRNA凝胶阻滞图。
[0043]图6为本发明CLP及其复合物抑制肿瘤细胞活性图。
[0044]图7为本发明CLP复合物CLSM抗癌效果图。[0045]图8为本发明CLP复合物FCM抗癌效果图。
[0046]图9为本发明共载体系示意图。
【【具体实施方式】】
[0047]请参阅图1~9所示，对本发明的实施例进行详细的说明。
[0048]本发明涉及一种阳离子脂质体，其特征在于:所述阳离子脂质体由以下重量份的组分采用逆向蒸发法制备而成:1重量份D0PE、1重量份DC-Chol、2.5重量份0QCMC。
[0049]本发明还涉及一种阳离子脂质体的制备方法，包括以下步骤:
[0050]步骤10、按配比取I重量份DOPE、I重量份DC-Chol、2.5重量份OQCMC溶于三氯甲烧溶剂中；
[0051]步骤11、将步骤10得到的溶液拌匀，加入超纯水共混，探头超声IOmin ；[0052]步骤12、将步骤步骤11得到产物在旋转蒸发仪将残留溶剂去除，真空状态，即得；所述旋转蒸发仪的蒸发温度为35°C。
[0053]本发明还涉及一种阳离子脂质体复合体，所述阳离子脂质体复合体以阳离子脂质体为包封层，所述包封层内包封有药物载体、基因载体或基因与药物共载载体中的至少一种；所述阳离子脂质体由以下重量份组分制备而成:1重量份D0PE、1重量份DC-Chol、2.5重量份OQCMC。
[0054]所述基因载体或基因与药物共载载体所载的基因为SiRNA中的至少一种。
[0055]较优的，所述siRNA为MRPl或是Bcl-2基因；平均每I μ L阳离子脂质体可以包封0.1~3.0 μ L的SiRNA为10~30 μ M ;平均每I μ L阳离子脂质体包封siRNA为2.0~
3.0 μ go
[0056]一种阳离子脂质体复合体的制备方法，包括以下步骤:
[0057]在容器中加入空白阳离子脂质体或载有PTX紫杉醇的阳离子脂质体，然后与基因siRNA混匀，孵化20~30min，即可得到CLP-siRNA复合体或是CLP_PTX_siRNA复合体。
[0058]所述一种阳离子脂质体复合体在制备共载基因与化疗药物中用途。
[0059]本发明还涉及一种基因药物制剂，所述基因药物制剂是由权利要求3~7任一项所述的阳离子脂质体复合体添加药学上可以接受的辅助性成份制备而成的。
[0060]以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0061]实施例一本发明阳离子脂质体配方和制备工艺优选
[0062]选择阳离子脂质体作为目标脂质体类型，初步筛选试验后，选择十八烷基季铵盐羧甲基壳聚糖(0QCMC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和3-β-N-N' -N' - 二甲基氨基乙基-氨甲酰基胆固醇(DC-Chol)，作为基本成分，然后进行配方的优化。
[0063]本发明阳离子脂质体制备方法及CLP及siRNA用量按一定比例进行优选，见如表I (二者质量比所引起复合体粒径与电位变化)=CLP-SiRNA随着siRNA质量增加，其尺寸大小与荷电情况发生变化，呈现粒径不断增加，而电位不断下降。这间接说明siRNA与CLP发生静电结合作用，吸附于CLP上。
[0064]表1阳离子脂质体与siRNA比例优选实验
【权利要求】
1.一种阳离子脂质体，其特征在于:所述阳离子脂质体由以下重量份的组分采用逆向蒸发法制备而成:1重量份D0PE、1重量份DC-Chol、2.5重量份0QCMC。
2.一种阳离子脂质体的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤10、按配比取1重量份DOPE、1重量份DC-Cho1、2.5重量份OQCMC溶于三氯甲烷溶剂中； 步骤11、将步骤10得到的溶液拌匀，加入超纯水共混，探头超声10min ； 步骤12、将步骤步骤11得到产物在旋转蒸发仪将残留溶剂去除，真空状态，即得；所述旋转蒸发仪的蒸发温度为35°C。
3.一种阳离子脂质体复合体，其特征在于:所述阳离子脂质体复合体以阳离子脂质体为包封层，所述包封层内包封有药物载体、基因载体或基因与药物共载载体中的至少一种；所述阳离子脂质体由以下重量份组分制备而成:1重量份D0PE、1重量份DC-Chol、2.5重量份 OQCMC。
4.根据权利要求3所述的一种阳离子脂质体复合体，其特征在于:所述基因载体或基因与药物共载载体所载的基因为siRNA中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的一种阳离子脂质体复合体，其特征在于:所述siRNA为MRPl或是Bcl-2基因。
6.根据权利要求5所述的一种阳离子脂质体复合体，其特征在于:平均每1μ L阳离子脂质体可以包封0.1~3.0 μ L的SiRNA为10~30 μ Μ。
7.根据权利要求6所述的一种阳离子脂质体复合体，其特征在于:平均每1yL阳离子脂质体包封siRNA为2.0~3.0 μ g。
8.一种阳离子脂质体复合体的制备方法，其特征在于:所述阳离子脂质体复合体为权利要求3~7任一项所述的阳离子脂质体复合体； 包括以下步骤: 在容器中加入空白阳离子脂质体或载有PTX紫杉醇的阳离子脂质体，然后与基因siRNA混匀，孵化20~30min，即可得到CLP-siRNA复合体或是CLP_PTX_siRNA复合体。
9.根据权利要求3~7任一项所述的一种阳离子脂质体复合体在制备共载基因与化疗药物中用途。
10.一种基因药物制剂，其特征在于:所述基因药物制剂是由权利要求3~7任一项所述的阳离子脂质体复合体添加药学上可以接受的辅助性成份制备而成的。
【文档编号】A61P35/00GK103933579SQ201410134762
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月3日 优先权日:2014年4月3日
【发明者】王士斌, 陈伟光, 陈爱政, 刘源岗, 吴文果 申请人:华侨大学