LukS-PV蛋白在制备诱导白血病细胞分化药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种LukS-PV蛋白在制备诱导白血病细胞分化药物中的应用，本发明的白血病细胞为人早幼粒细胞白血病细胞HL-60或人单核细胞白血病细胞THP-1。本发明的LukS-PV蛋白可使用基因工程技术大量表达，可特异性与靶细胞结合，但不引起靶细胞溶解，分子量小，易于进行基因改造和化学修饰，并可望通过基因改造增强其诱导活性，减小毒副作用；实验显示LukS-PV在体外可以诱导HL-60细胞向髓单核细胞分化，诱导THP-1细胞向巨噬细胞分化；LukS-PV在体内可以抑制白血病细胞生长，减少白血病细胞对肝脏、脾脏和外周血浸润，有望成为一种新的白血病治疗药物，为细菌毒素开拓新的应用领域。
【专利说明】LukS-PV蛋白在制备诱导白血病细胞分化药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药【技术领域】，尤其涉及的是一种LukS-PV蛋白在制备诱导白血病细胞分化药物中的应用。
【背景技术】
[0002]白血病是一种全身性的疾病，因而不能像其他实体肿瘤一样采取手术切除或放射治疗。化学药物是治疗白血病的主要方法。但由于化疗药物的非特异性细胞毒性及不可避免的耐药性，最终大部分病人会死于治疗相关的凝血障碍、细菌感染或对药物耐药导致的疾病复发。探索白血病新的靶向化学治疗药物是临床医学研究的热点。
[0003]白血病发病的分子生物学机制与细胞分化异常密切相关。诱导分化是治疗白血病的新策略，该方法与传统化学药物治疗的不同点在于不杀伤肿瘤细胞，而是诱导其向正常或接近正常的细胞分化，同时逆转肿瘤细胞增殖、浸润、转移等恶性表型。全反式维甲酸(ATRA)为应用较为广泛的分化诱导剂之一，已成功地应用于白血病的治疗，但该药在应用中可出现维甲酸综合症、缓解后易复发及药物耐受等问题，所以亟待寻找新的白血病治疗诱导剂。
[0004]细菌毒素能够与靶细胞特异性结合，一些毒素已被研究证明具有抗肿瘤的活性，如白喉毒素可用于治疗T-细胞淋巴瘤，大肠杆菌产生的ST毒素能明显抑制结肠和直肠肿瘤细胞的生长，产气荚膜梭菌毒素可用于治疗胰腺癌等。细菌毒素的药物应用已引起人们的关注，这些毒素的抗肿瘤机制主要是诱导肿瘤细胞凋亡，抑制细胞增殖，有关细菌毒素诱导肿瘤细胞分化的研究尚未见报道。
[0005]金黄色葡萄球菌分泌的杀白细胞素，首先由Panton-Valetine发现并命名，故称为 PV-杀白细胞素(Panton-Valetine leukocidin, PVL)，该毒素由 S 组分(LukS-PV)和 F组分(LukF-PV)组成。PVL属于穿孔毒素，其靶细胞是中性粒细胞和巨噬细胞，作用机制是LukS-PV首先与靶细胞膜上特异的位点结合，LukF-PV再与LukS-PV结合，依次进行，形成一个环状的八聚体结构，并插入靶细胞膜上，形成一个直径大约为2nm的穿膜孔，使细胞穿孔溶解。前期有关PVL的大量研究均集中于细胞毒性及致病机制，显示低浓度PVL可诱导靶细胞凋亡，高浓度可引起靶细胞溶解坏死。有关PVL是否可以诱导白血病细胞分化，并在体内具有抑制白血病细胞生长、浸润和转移的作用国内外尚未见报道。
[0006]诱导白血病细胞向正常细胞分化是治疗白血病的新策略，但目前可用于临床治疗的分化诱导剂种类较少，主要为一些小分子化合物(维甲酸类，二甲基亚砜)和细胞因子。小分子化合物作用单一，如ATRA主要用于急性早幼粒细胞白血病的治疗，对于其它类型的白血病疗效较差，且部分患者在使用ATRA治疗过程中可出现维甲酸综合症、缓解后复发及药物耐受等问题。细胞因子类分化诱导剂价格昂贵，难以用于临床。
[0007]常文娇等在Panton-Valentine杀白细胞素原核表达、纯化及生物学活性鉴定,安徽医科大学学报，2011Jan, 46 (I)中，以及高玉录等在Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL) IukS-PV基因的克隆、原核表达及初步鉴定，安徽医科大学学报，20080ct，43 (5)中，成功构建了 LukS-PV基因的表达载体BL21-pET28a-LukS-PV，经IPTG诱导表达和亲和层析法获得重组蛋白LukS-PV。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种LukS-PV蛋白在制备诱导白血病细胞分化药物中的应用，从而开拓LukS-PV蛋白应用的新领域。
[0009]本发明是通过以下技术方案实现的，本发明LukS-PV蛋白在制备诱导白血病细胞分化药物中的应用。
[0010]作为本发明的优选方式之一，所述白血病细胞为人早幼粒细胞白血病细胞HL-60。
[0011]作为本发明的优选方式之一，所述白血病细胞为人单核细胞白血病细胞THP-1。
[0012]所述LukS-PV蛋白在体外抑制白血病细胞增殖，诱导白血病细胞定向分化。
[0013]所述LukS-PV蛋白在体内抑制白血病细胞生长，抑制白血病细胞向肝脏、脾脏及外周血浸润。
[0014]本发明相比现有技术具有以下优点:本发明的LukS-PV蛋白分子量小，易于大量生产，易于进行基因改造和化学修饰，可特异性与靶细胞结合，但不引起靶细胞溶解，并可望通过基因改造增强其诱导活性，减小毒副作用；LukS-PV可以在体外抑制白血病细胞增殖，诱导细胞分化，在体内可以抑制白血病细胞生长，减少白血病细胞对肝脏、脾脏和外周血浸润，实验显示LukS-PV可以诱导HL-60细胞向髓单核细胞分化，诱导THP-1细胞向巨噬细胞分化；LukS-PV在体内可以抑制白血病细胞生长，减少白血病细胞对肝脏、脾脏和外周血浸润，有望成为一种新的白血病治疗药物，为细菌毒素开拓新的应用领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是LukS-PV对HL-60细胞生长抑制作用的示意图；
[0016]图2是LukS-PV对HL-60细胞形态学影响的示意图；
[0017]图3是LukS-PV对THP-1细胞形态学影响的示意图；
[0018]图4是LukS-PV刺激后HL-60细胞表面分化抗原检测结果示意图；
[0019]图5是LukS-PV刺激后THP-1细胞表面分化抗原检测结果示意图；
[0020]图6是各组小鼠肝脏HE染色检测结果示意图；
[0021]图7是各组小鼠脾脏HE染色检测结果示意图；
[0022]图8是各组小鼠肝脏免疫组化染色检测结果示意图；
[0023]图9是各组小鼠脾脏免疫组化染色检测结果示意图；
[0024]图10是各组小鼠肝细胞悬液中⑶33+细胞比例示意图；
[0025]图11是各组小鼠脾细胞悬液中⑶33+细胞比例示意图；
[0026]图12是各组小鼠外周血中⑶33+细胞比例示意图。
【具体实施方式】
[0027]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。[0028]实施例1
[0029]本实施例取处于对数生长期的HL-60细胞，调节细胞浓度至2X 105/ml，加入六孔板，每孔2 X IO5个细胞。分别用O、0.50、1.00 μ M浓度的LukS-PV处理HL-60细胞3、6、9、12h后，采用MTS法检测细胞生长情况。
[0030]如图1所示，结果显示，正常对照组细胞生长抑制曲线呈水平状，未见生长抑制现象。LukS-PV能够显著抑制HL-60细胞的生长，并呈时间-剂量依赖性，即剂量加大、时间延长，抑制作用更为明显。
[0031]本实施例的人早幼粒细胞白血病细胞株HL-60细胞，购于中科院上海细胞研究所。
[0032]实施例2
[0033]本实施例取处于对数生长期的HL-60细胞调节细胞浓度至2 X 105/ml，加入六孔板，每孔2 X IO5个细胞。分别经0、0.50 μ MU.00 μ M的LukS-PV作用细胞48h后，细胞悬液离心涂片，光镜下观察细胞形态学变化。
[0034]如图2所示,采用Wright-Giemsa染色观察LukS-PV对HL-60细胞形态学的影响，放大400倍，结果显示，LukS-PV作用细胞48h后，光镜下观察，细胞形态学发生明显变化。表现为细胞体积缩小，核仁消失，细胞核也明显缩小，胞浆增多，染色质浓缩增粗，核浆比例缩小，核偏于一侧。
[0035]其他实施方式和实 施例1相同。
[0036]实施例3
[0037]本实施例取处于对数生长期的THP-1细胞调节细胞浓度至2 X 105/ml，本实施例的人单核细胞白血病细胞株THP-1细胞，购于中科院上海细胞研究所。其他实施方式和实施例2相同。
[0038]如图3所示，采用直接镜检观察LukS-PV对THP-1细胞形态学的影响，放大400倍，LukS-PV作用细胞48h后，光镜下直接观察细胞形态学发生明显变化。表现为细胞由圆形、悬浮变为梭形、粘附，呈贴壁生长。
[0039]实施例4
[0040]本实施例取处于对数生长期的HL-60细胞调节细胞浓度至2 X 105/ml，加入六孔板，每孔2 X IO5个细胞。分别经0,0.50 μ MU.00 μ M的LukS-PV作用细胞48h后，收集细胞悬液并用PBS缓冲液洗涤3遍，75%乙醇固定，过夜。固定后的细胞经PBS离心洗涤2次后重悬。之后细胞分别与⑶Ilb-FITC和⑶14-PE在4oC避光孵育25min，孵育后PBS洗涤I次，适量PBS重悬后，上流式细胞仪测定，cellquest软件分析HL-60表面抗原阳性细胞的比例。
[0041]如图4所示，用LukS-PV刺激细胞48h后，细胞表面⑶IIb和⑶14的表达率上升。LukS-PV主要诱导HL-60细胞向⑶Ilb+髓单核细胞系分化，LukS-PV具有诱导白血病细胞分化的作用，但是具体诱导分化方向与白血病细胞类型相关。
[0042]其他实施方式和实施例1相同。
[0043]实施例5
[0044]本实施例中，取处于对数生长期的THP-1细胞调节细胞浓度至2 X 105/ml，其他实施方式和实施例4相同。[0045]如图5所示，LukS-PV主要诱导THP-1向⑶14+巨噬细胞系分化。
[0046]实施例6
[0047]本实施例取SCID小鼠，雄性，18~20g，连续两天腹腔注射环磷酰胺(CTX，IOOmg/kg)后，将小鼠随机分成5组(8只/组)，包括:正常对照组、模型组和3个LukS-PV治疗组(5 μ g/day, 10 μ g/day, 20 μ g/day)。第三天，将处于对数生长期的HL-60细胞通过腹腔注射接种于模型组和各个LukS-PV治疗组小鼠，每只小鼠注射100μ I (8X106+细胞/只)。正常对照组小鼠给予等体积的PBS缓冲液。
[0048]在细胞接种后第3天开始，正常对照组与模型组小鼠腹腔注射PBS缓冲液，治疗组腹腔注射LukS-PV,剂量分别为5 μ g/day, 10 μ g/day, 20 μ g/day,每天给药一次,连续3天。在治疗后第3周，处死小鼠，观察HL-60细胞在小鼠体内的生长情况。
[0049]结果显示，处死小鼠时，模型组小鼠已形成明显的肉眼可见的腹腔肿瘤。5yg/dayLukS-PV组小鼠形成的腹腔肿瘤体积较小。10 μ g/day>20 μ g/day LukS-PV组小鼠未形成腹腔肿瘤。结果表明LukS-PV在小鼠体内能够显著抑制肿瘤细胞的生长。
[0050]实施例7
[0051]本实施例中，在治疗后第3周，每组各处死小鼠2只，取肝、脾及外周血，使用HE染色、免疫组化染色及流式细胞术等方法检测HL-60在小鼠体内浸润和转移情况。其他实施方式和实施例6相同。
[0052]如图6和图7所示，放大400倍后，HE染色检测发现模型组小鼠肝细胞索排列紊舌L肝脏组织内可见散在和灶状白血病细胞浸润；脾小结结构不完整，红髓破坏，可见大量粒系细胞浸润且侵犯脾小结。LukS-PV治疗后，肝、脾组织结构的破坏程度较小，白血病细胞浸润明显减少。如图8~12所示，放大400倍后，免疫组化及流式细胞术检测显示小鼠肝、脾组织及外周血中⑶33+细胞比例下降。
[0053]由上述实施例可以看出，LukS-PV可以诱导HL-60细胞表面特异性抗原⑶I Ib表达增加，核浆比例缩小，向髓单核细胞分化；诱导THP-1细胞表面特异性抗原CD14表达增加，细胞呈梭形、贴壁生长，向巨噬细胞分化。LukS-PV可针对不同系白血病细胞诱导其向各自成熟的细胞系分化，显示出了其诱导分化的细胞特异性，也暗示了其诱导分化的高效性，因此，LukS-PV在诱导白血病细胞分化治疗中显示出了巨大的应用潜力。
[0054]LukS-PV在体内可抑制肿瘤细胞生长、增殖、浸润和转移，其作用可能是通过诱导分化、促进凋亡等多种途径、多个靶点完成。
[0055]LukS-PV可通过基因工程技术重组表达，分子量小，易于进行基因改造和化学修饰，可与特定的靶细胞结合，特异性强，效应稳定。
【权利要求】
1.LukS-PV蛋白在制备诱导白血病细胞分化药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白血病细胞为人早幼粒细胞白血病细胞HL-60。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白血病细胞为人单核细胞白血病细胞 THP-1。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LukS-PV蛋白在体外抑制白血病细胞增殖，诱导白血病细胞定向分化。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LukS-PV蛋白在体内抑制白血病细胞生长，抑制白血病细胞向肝脏、脾脏及外周血浸润。
【文档编号】A61K38/16GK103877563SQ201410134597
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】马筱玲, 常文娇, 单武林, 章成芳 申请人:安徽省立医院