具有改进性能的抗-C5aR抗体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有改进性能的抗-C5aR抗体，其结合至C5aR并且用于诊断和治疗方法中。
【专利说明】具有改进性能的抗-C5aR抗体
[〇〇〇1] 本申请是申请日为2007年8月22日的题为"具有改进性能的抗-C5aR抗体"的 中国专利申请号200780031002. 5的分案申请。 【技术领域】
[0002] 本发明涉及改进的抗体，其结合于C5aR并且在诊断和治疗方法中很有用。 【背景技术】
[0003] 补体蛋白C3-C5中的每一个的蛋白分解产生具有称为过敏毒素（6-9)的信号分子 的氨基末端阳离子片段。这些氨基末端阳离子片段中最有效的C5a引起最宽的响应。考虑 到作为白细胞的着边（即炎症初期白细胞附集于血管壁，margination)和渗透的炎性响应 的成分，颗粒结合的蛋白水解酶的释放、活化氧和氮衍生的自由基的产生改变了血流和毛 细血管渗漏以及收缩平滑肌的能力，C5a分子是"完全"促炎介质。在亚纳摩尔至纳摩尔水 平，C5a分子引发所有髓系(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞、巨噬细胞和单核 细胞)的趋化性，并引起血管通透性(通过前列腺素和循环粒细胞使其可能性显著加强)。更 高的纳摩尔浓度引发NADPH氧化酶的脱粒和活化。这种宽度的生物活性与其他炎性介质形 成对比。C5a牵涉到类风湿性关节炎、银屑病、败血症、再灌注损伤和成人呼吸窘迫综合征的 发病机制（Gerard 和 Gerard, 1994;Murdoch 和 Finn, 2000)。
[0004] C5a的活性由C5a与其受体（C5aR)的结合介导。C5aR属于七次跨膜G-蛋白偶联 受体的家族。C5aR是C5a的高亲和力受体，具有?InM的Kd，并且位于大量不同的细胞型， 包括白细胞上。每个细胞的受体的数量极高，高达每个白细胞200, 000个位点。受体的生 物学活化发生在整个使结合饱和的范围内。
[0005] C5aR结构与该七次跨膜受体家族一致，其中胞外N-末端后是通过作为胞内和胞 外环交替的螺旋间结构域连接的七次跨膜螺旋，并以胞内C-末端结构域终止。C5aR包含扩 展的N-末端胞外结构域。这种大的N-末端结构域是典型的G-蛋白偶联受体，其结合包 括IL-8和fMet-Leu-Phe (FMLP)受体家族的肽。
[0006] 利用C5aR拮抗剂对C5a响应的抑制应减少经由C5a介导的急性炎性应答，而不影 响其他补体成分。为此，在之前已经描述过C5aR肽拮抗剂和抗_C5a受体抗体（Watanabe et al. , 1995;Pellas et al. , 1998;Konteatis et al.，1994;Kaneko et al. , 1995;Morgan et al·，1993)。例如，W095/00164 (Scripps Research Inst.)描述了针对 C5a 受体的 N-末 端肽(残基9-29)的抗体。
[0007] W003/062278 (G2疗法）描述了针对C5aR的胞外环而不是N-末端结构域的抗 体，这在抑制C5a与C5aR结合中是有效的。在该申请中披露的具体单克隆抗体是MAb7F3、 MAbl2D4和MAb6C12。在这些单克隆抗体中，MAb7F3对C5aR具有最高的结合亲和力。
【发明内容】
[0008] 现在，本发明的发明人开发了新型单克隆抗体，当相比于MAb7F3时，其对C5aR具 有实质性改进的结合亲和力并且在小鼠关节炎模型中逆转炎症是高度有效的。
[0009] 因此，本发明提供了一种抗体，包含与SEQ ID N0:3[3C5Vh]中示出的可变重链 ⑶R1XDR2或⑶R3环序列共有至少80%同一性的至少一个⑶R环序列，其中该抗体减少或 抑制C5a与C5aR的结合。
[0010] 在一种优选的实施方式中，该抗体包含与SEQ ID NO: 3 [3C5Vh]中示出的可变重链 ⑶R1、⑶R2或⑶R3环序列共有至少80%同一性的至少两个⑶R环序列。
[0011] 在一种进一步优选的实施方式中，该抗体进一步包含与SEQ ID NO: 4 [3C5V1]中示 出的可变轻链⑶R1、⑶R2或⑶R3环序列共有至少80%同一性的至少一个⑶R环序列。
[0012] 在一种进一步优选的实施方式中，该抗体包含与SEQ ID NO: 4 [3C5V1]中示出的可 变轻链⑶R1、⑶R2或⑶R3环序列共有至少80%同一性的至少两个⑶R环序列。
[0013] 在一种进一步优选的实施方式中，该抗体包含分别与SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4 中示出的重链和/或轻链序列共有至少80%同一性的序列，其中该抗体减少或抑制C5a与 C5aR的结合。
[0014] 在一种优选的实施方式中，该抗体结合于人类C5aR或其片段，其中
[0015] (i)当在相同条件下确定时，其IC5Q值比MAb7F3低至少1. 5倍；或
[0016] (ii)当在相同条件下确定时，其缔合常数（Kon)比MAb7F3高至少1. 5倍；或
[0017] (iii)当在相同条件下确定时，其KD亲和常数比MAb7F3低至少1.3倍。
[0018] 优选地，当在相同条件下确定时，该抗体以比MAb7F3低至少1. 4倍的KD亲和常数 与人类C5aR或其片段结合。
[0019] 在一种进一步优选的实施方式中，该抗体结合至人类C5aR或其片段，其中
[0020] (i) IC5(I值小于500pM，优选小于300pM，并且更优选小于200pM ;或
[0021] (ii)缔合常数（Kon)为至少6· βΧΙΟΜ? ;或
[0022] (iii)KD 亲和常数小于 1·4ηΜ。
[0023] 优选地，该抗体结合于人类C5aR或其片段，其中
[0024] (ii)缔合常数（Kon)为至少106Μ? ;或
[0025] (^^心亲和常数小于。』!^。
[0026] 优选地，C5aR 的片段是包含序列 LYRVVREEYFPPKVLCGVDYSHDKRRERAVAIV(SEQ ID NO :2)的肽。
[0027] 本发明还提供了一种抗体，包含与SEQ ID NO: 5 [7H3Vh]中示出的可变重链CDR1、 ⑶R2或⑶R3环序列共有至少80%同一性的至少一个⑶R环序列，其中该抗体减少或抑制 C5a与C5aR的结合。
[0028] 在一种进一步优选的实施方式中，该抗体包含与SEQ ID NO: 5 [7H3Vh]中示出的可 变重链⑶R1、⑶R2或⑶R3环序列共有至少80%同一性的至少两个⑶R环序列。
[0029] 在一种进一步优选的实施方式中，该抗体进一步包含与SEQ ID NO: 6 [7H3V1]中示 出的可变轻链⑶R1、⑶R2或⑶R3环序列共有至少80%同一性的至少一个⑶R环序列。
[0030] 在一种进一步优选的实施方式中，该抗体包含与SEQ ID NO: 6 [7H3V1]中示出的可 变轻链⑶R1、⑶R2或⑶R3环序列共有至少80%同一性的至少两个⑶R环序列。
[0031] 在一种进一步优选的实施方式中，该抗体包含分别与SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6 中示出的重链和/或轻链序列共有至少80%同一性的序列，其中该抗体减少或抑制C5a与 C5aR的结合。
[0032] 本发明进一步提供了一种抗体，包含与SEQ ID N0:7[8G7Vh]中示出的可变重链 ⑶R1XDR2或⑶R3环序列共有至少80%同一性的至少一个⑶R环序列，其中该抗体减少或 抑制C5a与C5aR的结合。
[0033] 在一种进一步优选的实施方式中，该抗体包含与SEQ ID NO: 7 [8G7Vh]中示出的可 变重链⑶R1、⑶R2或⑶R3环序列共有至少80%同一性的至少两个⑶R环序列。
[0034] 在一种进一步优选的实施方式中，该抗体进一步包含与SEQ ID NO: 8 [8G7V1]中示 出的可变轻链⑶R1、⑶R2或⑶R3环序列共有至少80%同一性的至少一个⑶R环序列。
[0035] 在一种进一步优选的实施方式中，该抗体包含与SEQ ID NO: 8 [8G7V1]中示出的可 变轻链⑶R1、⑶R2或⑶R3环序列共有至少80%同一性的至少两个⑶R环序列。
[0036] 在一种进一步优选的实施方式中，该抗体包含分别与SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8 中示出的重和/或轻链序列共有至少80%同一性的序列，其中该抗体减少或抑制C5a与 C5aR的结合。
[0037] 在本发明的优选实施方式中，该抗体与人类C5aR的第二胞外环(残基175?206) 是反应性的。
[0038] 在进一步优选的实施方式中，该抗体与包含人类C5aR的残基179-184的表位 (EEYFPP)是反应性的。
[0039] 在本发明的一种进一步优选的实施方式中，该抗体是单克隆、重组抗体，嵌合或人 源化抗体。
[0040] 该抗体可以是任何同种型。然而，在本发明的一种进一步优选的实施方式中，该抗 体是IgG2a类或IgG3类抗体。
[0041] 在本发明另一优选的实施方式中，该抗体是选自由MAb3C5、MAb8G7和MAb7H3构成 的组中的单克隆抗体。
[0042] 本发明还提供了一种杂交瘤，以登录号06081801保藏在ECACC。
[0043] 本发明还提供一种了杂交瘤，以登录号06081802保藏在ECACC。
[0044] 本发明还提供了一种杂交瘤，以登录号06081803保藏在ECACC。
[0045] 应当理解，也可以生产本发明这些抗体的各种化学衍生物。例如，由本发明的 抗体结合到标签如放射性同位素或其他示踪剂分子构成的免疫交联物(免疫共轭物， immunoconjugate)可以通过本领域已知的技术制备。可替换地，所述抗体可以结合于治疗 有用的分子，该分子借助于抗体的结合特异性而靶向其期望的作用部位。
[0046] 因此，本发明还提供了一种包含本发明的抗体和治疗剂的结合物（conjugate)。
[0047] 应当理解，在本发明的内容中可以使用一个范围的治疗剂。优选的治疗剂包括介 导细胞死亡或蛋白失活的试剂。治疗剂可以是本领域已知的大量毒素中的任一种。该毒素 可以是假单胞菌外毒素 （Pseudomonas exotoxin)或其衍生物。在一种优选的实施方式中， 该毒素是PE40。
[〇〇48] 本发明还提供了 一种包含本发明的抗体和可检测标签的结合物。
[0049] 该可检测标签可以是本领域已知的任何合适标签。例如，该标签可以是放射性标 签、荧光标签、酶促标签或造影剂。
[0050] 本发明还提供了一种分离的核酸分子，该核酸分子包含编码本发明的抗体的序 列。
[0051] 本发明还提供了一种组合物，包含根据本发明的抗体和药用载体。
[0052] 本发明还提供了本发明的抗体作为药剂的应用。
[0053] 本发明还提供了一种用于诊断受试者体内涉及白细胞或嗜中性粒细胞移行的紊 乱的方法，该方法包括使从受试者获得的样品与本发明的结合物在体外接触，以及检测该 结合物与样品之间的免疫特异性结合。
[0054] 本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗涉及白细胞或中性白细胞移行的 紊乱的药剂中的应用。
[0055] 本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗免疫病理学疾病的药剂中的应用。
[0056] 在本发明的一个优选实施方式中，C5aR是人类C5aR。
[0057] 本发明还提供了一种用于抑制带有C5aR的细胞与其配体的相互作用的方法，该 方法包括使该细胞暴露于本发明的抗体。
[0058] 本发明还提供了一种用于抑制细胞中C5aR活性的方法，该方法包括使该细胞暴 露于本发明的抗体。
[0059] 本发明还提供了一种治疗受试者体内涉及中性白细胞移行的紊乱的方法，该方法 包括给予该受试者本发明的抗体。
[0060] 本领域技术人员应当理解，本发明的这些抗体也可以用来检测、定量和/或局部 化（localise)表达C5aR的细胞。
[0061] 因此，本发明还提供了一种用于诊断受试者体内涉及中性白细胞移行的紊乱的方 法，该方法包括使从该受试者获得的样品与本发明的结合物接触，以及检测该结合物与样 品之间的免疫特异性结合。
[0062] 许多种免疫测定可以用于这些诊断方法中。这样的免疫测定包括利用如放射免 疫测定、ELISA、"夹心"免疫测定、沉淀素反应、凝胶分散沉淀素反应、免疫分散测定、凝集测 定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定等技术的竞争性和非竞争性测定系统。可 利用体外和体内测定。
[〇〇63] 从受试者获得的样品可以包括任何体液，如外周血、血浆、淋巴液、腹膜液、脑脊 液、或胸膜液，或者任何身体组织。体外测定可以利用组织或流体的组织学样本或亚部分来 实施。体内结合可以通过借助于本领域已知的任何方式(如静脉内、腹膜内、动脉内等）给 予所述结合物以便可以检测免疫特异性结合而实现。
[〇〇64]另外，可以使用成像技术，其中将本发明的抗体结合至合适的成像标签。标记的抗 体可以体内给予以确定C5aR在受试者体内的定位。
[〇〇65] 因此，本发明还提供了一种用于诊断受试者体内涉及中性白细胞移行的紊乱的方 法，该方法包括在一定条件下向该受试者给予用成像剂(显像剂）标记的本发明的抗体以便 在受试者体内在抗体和表现C5aR的细胞之间形成复合体(复合物)，以及使该复合体成像。 [0066] 在本发明的一种优选实施方式中，涉及中性白细胞移行的紊乱是C5aR介导的紊 舌L。优选地，该紊乱是免疫病理学紊乱。
[〇〇67] 本发明还提供了一种用于将治疗剂递送到受试者体内的炎症部位的方法，该方法 包括向受试者给予本发明的结合物。
[0068] 本发明还提供了一种用于将遗传物质引入到表现C5aR的细胞内的方法，该方法 包括使这些细胞与本发明的抗体接触，其中所述抗体附着于遗传物质或与其相关。
[0069] 在一种优选的实施方式中，表现C5aR的细胞选自由粒细胞、白细胞(如单核细胞、 巨噬细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)、肥大细胞以及淋巴细胞，淋巴细胞包括T细胞、 树突细胞、以及非髓系细胞(如内皮细胞和平滑肌细胞)。
[0070] 本发明还涵盖鉴定结合C5aR的其他配体或其他物质的方法，所述结合C5aR的其 他配体或其他物质包括哺乳动物C5aR功能的抑制剂和/或促进剂。例如，与本发明抗体或 其功能片段具有相同或类似结合特异性的试剂可通过利用所述抗体或片段的竞争性测定 加以鉴定。因此，本发明还涵盖鉴定结合C5aR的配体或其他物质的方法，该结合C5aR的配 体或其他物质包括受体功能的抑制剂(例如拮抗剂)或促进剂(例如激动剂)。在一种实施方 式中，在测定中使用天然表达C5aR的细胞或已被遗传改造成表达C5aR的合适宿主细胞或 由引入到所述细胞内的核酸编码的变体，来鉴定和评估受体功能的配体、抑制剂或促进剂 的效能。这样的细胞在评估表达的受体蛋白或多肽的功能中也是有用的。 【专利附图】
【附图说明】
[0071] 图1 :由用LI. 2/hC5aR细胞免疫的小鼠产生的抗-人类C5aR mAb不同程度地抑 制125I-C5a与人嗜中性粒细胞的结合。误差棒指示SD。
[0072] 图2 :用于构建hC5aR敲入（knock-in)小鼠的野生型小鼠的C5aR基因座和革巴向 载体的图。用靶向载体中的人类C5aR基因外显子3⑶S精确地替代小鼠 C5aR基因外显子 3⑶S。小鼠 C5aR基因侧翼序列允许同源重组。利用Cre将由ΙοχΡ位点侧挂的选择标记物 PGKneo从第一敲入小鼠中删除。用3'和5'探针来确认已正确地重组到小鼠 C5aR基因座 中的靶向载体。X，XbaI;V，EcoRV。
[0073] 图3 :来自杂合hC5aR敲入小鼠（hC5Rl+/〇之间的杂交（cross)的小鼠尾部的 EcoRV消化的基因组DNA的DNA印迹（Southern blot)。该印迹与3'探针杂交，其将小鼠 C5aR等位基因（10. Okb)和hC5aR敲入等位基因（8. lkb)相区别。
[0074] 图4 :C5aR在hC5Rl+/+、hC5Rl+/_和野生型小鼠嗜中性粒细胞上的表达。中性白细 胞用FITC结合的抗-人类C5aR mAb (7F3)或抗-小鼠 C5aRmAb20/70染色。
[0075] 图5 :由hC5Rl+/+小鼠的嗜中性粒细胞产生的抗体表明广谱的125I_C5a结合抑制， 范围从完全抑制到部分或很少的抑制，这取决于mAb克隆。结果代表对于每一个抗体的至 少两个独立实验的结果，并且误差棒指示s. e. m.。
[0076] 图6 :抗-C5aR mAb具有亚纳摩尔IC5Q值。利用hC5Rl+/+小鼠嗜中性粒细胞（3C5、 7H3和8G7)产生的抗体表现出比利用LI. 2/hC5aR转染子（7F3)产生的最佳mAb低5-10倍。 IC5Q值由3或4个独立的竞争性125I-C5a配体结合实验来确定。
[0077] 图7 :竞争性配体结合测定表明从具有7F3或3C5的hC5aR转染的L1. 2细胞上的 hC5aR的125I-C5a替代。EC5Q值由2或3个独立实验确定。
[0078] 图8 :C5aR特异性mAb与嵌合人/小鼠 C5aR受体的相对结合。不意性不出了嵌合 体受体(来源于hC5aR的区域以红色示出，而来源于mC5aR的区域以黑色示出）。四个胞外 结构域的起源由4-字母代码指代（HHHH是野生型人类C5aR，mHHH具有小鼠 N-末端胞外结 构域和人类第一、第二、以及第三胞外环等)。表达嵌合受体的瞬时转染L1. 2细胞用不同的 抗-C5aR mAb染色。所有抗-hC5aR mAb表现出不同的、结构域限制的结合外形，结合至包 含人类C5aR N-末端的受体或第二胞外环。抗-小鼠 C5aRmAb20/70结合至包含小鼠 C5aR 第二胞外环的嵌合受体。
[0079] 图9 :表示每一单个抗_hC5aR mAb抑制C5a与人嗜中性粒细胞结合的程度的点阵 图。根据mAb识别的受体结构域对其进行分组。所有最有效的阻遏(阻断）mAb (抑制C5a 结合>90%的那些）对hC5aR的第二胞外环作图。
[0080] 图10 :通过肽ELISA对hC5aR第二胞外环上的抗体结合位点作图。mAb7F3和3C5 结合至来自包含序列179EEYFPP 184的hC5aR第二胞外环的所有重叠肽。
[0081] 图11 (a):利用鉴定由mAb7F3和3C5识别的hC5aR上的关键残基的12肽的丙氨 酸突变体对抗体接触残基的作图。图11 (b):利用鉴定由mAb8G7和7H3识别的hC5aR上 的关键残基的12肽的丙氨酸突变体对抗体接触残基的作图。
[0082] 图12 :在Biacore测定中，mAb7F3、3C5、8G7和7H3对于肽23的缔合和离解速率以 及结合亲和力。
[0083] 图13 :抗_hC5aR mAb的治疗效果的比较。在炎症发展后的第5天，hC5Rl+/+小鼠 用7F3、3C5或8G7 (以在PBS中的lmg/kg或3mg/kg)腹腔内（i. ρ·)注射一次。对照组接 受PBS。图示出了从第0天的脚爪(踝部）大小的变化。组平均值（n=5-7/组)。
[0084] 图14 :抗-hC5aR mAb的治疗效果的比较。hC5Rl+/+小鼠用7F3、3C5或8G7 (以在 PBS中的lmg/kg或3mg/kg)腹腔内（i. p.)注射一次。对照组接受PBS。图示出了临床评 分。组平均值（n=5-7/组)。
[0085] 序列表说明
[0086] SEQ ID NO: 1 人类 C5aR 蛋白序列
[0087] SEQ ID N0:2 人类 C5aR 肽
[0088] SEQ ID NO: 33C5可变重链（蛋白）序列
[0089] SEQ ID NO: 43C5可变轻链（蛋白）序列
[0090] SEQ ID NO: 57H3可变重链（蛋白）序列
[0091] SEQ ID N0:67H3可变轻链(蛋白）序列
[0092] SEQ ID NO: 78G7可变重链（蛋白）序列
[0093] SEQ ID NO: 88G7可变轻链（蛋白）序列
[0094] SEQ ID N0:9经修饰的人类C5aR肽
[0095] SEQ ID N0:10-25用于构建嵌合小鼠/人类C5aR的引物
[0096] SEQ ID N0:26生物素化的人类C5aR肽(第二胞外环）
[0097] SEQ ID N0:27人类C5aR第二胞外环的残基179?184
[0098] SEQ ID N0:28-50来自包含序列EEYFPP的人类C5aR第二胞外环的重叠12肽
[0099] SEQIDN0:51-62肽序列VREEYFPPKVLC的丙氨酸突变体
[0100] SEQ ID N0:63 乱序的 VREEYFPPKVLC 肽 【具体实施方式】
[0101] C5aR 结构
[0102] 人类C5aR的氨基酸序列在SEQ ID NO: 1中提供。
[0103] 人类C5aR的不同结构域限定如下：
[0104] 氨基酸1-37 胞外结构域-N末端
[0105] 氨基酸38-61 跨膜结构域
[0106] 氨基酸62-71 胞内结构域
[0107] 氨基酸72-94 跨膜结构域
[0108] 氨基酸95-110 胞外结构域-胞外环1
[0109] 氨基酸111-132跨膜结构域
[0110] 氨基酸133-149胞内结构域
[0111] 氨基酸150-174跨膜结构域
[0112] 氨基酸175-206胞外结构域-胞外环2
[0113] 氨基酸207-227跨膜结构域
[0114] 氨基酸228-242胞内结构域
[0115] 氨基酸243-264跨膜结构域
[0116] 氨基酸265-283胞外结构域-胞外环3
[0117] 氨基酸284-307跨膜结构域
[0118] 氨基酸308-350胞内结构域-C末端
[0119] 微牛物保藏详情
[0120] 产生名为杂交瘤3C5-L12的单克隆抗体的杂交瘤于2006年8月18日保藏在 ECACC，登记号为 06081801。
[0121] 产生名为杂交瘤7H3-N9的单克隆抗体的杂交瘤于2006年8月18日保藏在ECACC， 登记号为06081802。
[0122] 产生名为杂交瘤8G7-M6的单克隆抗体的杂交瘤于2006年8月18日保藏在ECACC， 登记号为06081803。
[0123] 这些保藏是根据《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》的规定 进行的。这保证从保藏日起保持培养物存活30年。有机体可以根据布达佩斯条约通过 ECACC(保藏单位地址：英国索尔兹伯里）获得，该条约保证在相关专利公布后，公众可持久 且不受限制地获得该培养物。
[0124] 本专利申请的受让人同意，当在合适条件下进行培养时，如果培养物保藏死亡或 丧失或损坏，则将根据通知用相同培养物的存活样本及时进行替换。保藏的菌株的可获得 性并不被解释为违反任何政府管理机构依据其专利法授予的权利而实施本发明的许可。
[0125] 抗体
[0126] 本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、双特异性抗体、以及异 源偶联抗体（heteroconjugate antibody)。
[0127] 如在本发明中所使用的，术语"抗体"包括完整分子及其片段，如能够结合表位决 定子的Fab、F(ab'）2和Fv。这些抗体片段保留一些选择性地与其抗原或受体结合的能力， 并限定如下：
[0128] (l)Fab，包含抗体分子的一价抗原结合片段的片段，可通过用木瓜蛋白酶消化整 个抗体以生成完整轻链和一个重链的一部分而产生；
[0129] (2) Fab'，抗体分子的片段，可通过用胃蛋白酶处理完全抗体，接着还原，以生成完 整轻链和重链的一部分而获得；每个抗体分子获得两个Fab'片段；
[0130] (3) (Fab'）2，抗体的片段，可通过用胃蛋白酶处理完全抗体(没有随后的还原）而 获得；F(ab)2是通过两个二硫键保持在一起的两个Fab'片段的二聚体；
[0131] (4) Fv，限定为包含轻链的可变区和重链的可变区的遗传设计片段，以两个链表示；
[0132] (5)单链抗体("SCA")，限定为包含轻链可变区、重链可变区的遗传设计分子，由合 适的多肽连结子连接成遗传融合的单链分子；以及
[0133] (6)单域抗体，通常是缺少轻链的可变重(链）结构域。
[0134] 本发明的优选抗体包含基本上与MAb3C5、7H3或8G7相同的可变区或者一个或多 个CDR环。
[0135] MAb3C5、7H3或8G7的可变区的序列在SEQ ID N03?8中列出。这些可变区中的 每一个的⑶R环限定如下：
[0136] MAb3C5
[0137] CDR HI :SEQ ID NO:3 的残基 26-36 (包括端值）；
[0138] CDR H2 : SEQ ID NO :3 的残基 51-66 (包括端值）；
[0139] CDR H3 :SEQ ID N0:3 的残基 97-108 (包括端值）；
[0140] CDR LI : SEQ ID NO :4 的残基 24-39 (包括端值）；
[0141] CDR L2 : SEQ ID NO :4 的残基 55-61 (包括端值）；
[0142] CDR L3 :SEQ ID N0:4 的残基 94-102 (包括端值）。
[0143] MAb7H3
[0144] CDR HI :SEQ ID NO:5 的残基 26-35 (包括端值）；
[0145] CDR H2 : SEQ ID NO :5 的残基 50-68 (包括端值）；
[0146] CDR H3 :SEQ ID N0:5 的残基 99-108 (包括端值）；
[0147] CDR LI : SEQ ID NO :6 的残基 24-39 (包括端值）；
[0148] CDR L2 : SEQ ID NO :6 的残基 55-61 (包括端值）；
[0149] CDR L3 :SEQ ID N0:6 的残基 94-102 (包括端值）。
[0150] MAb8G7
[0151] CDR HI :SEQ ID NO:7 的残基 26-36 (包括端值）；
[0152] CDR H2 : SEQ ID NO :7 的残基 51-66 (包括端值）；
[0153] CDR H3 :SEQ ID N0:7 的残基 97-108 (包括端值）；
[0154] CDR LI : SEQ ID NO :8 的残基 24-39 (包括端值）；
[0155] CDR L2 : SEQ ID NO :8 的残基 55-61 (包括端值）；
[0156] CDR L3 :SEQ ID N0:8 的残基 94-102 (包括端值）。
[0157] L1、L2、L3和H2CDR由Kabat定义。HI和H3CDR的限定修改自Kabat定义并在它 们的N-末端处包括另外的残基。扩展⑶R H1以包括由Chothia定义为⑶R-H1的一部分 的残基。扩展⑶R H3以包括2个"接触（contact)"残基。关于Kabat标号、定义Ab和抗 原之间的⑶R和接触残基的信息参见http://www. bioinfo, org. uk/abs〇
[0158] 感兴趣地注意到，MAb3C5和8G7的⑶R环共有以下水平的序列同一性：
[0159] V。同一性 |CDR1 ICDR2 ICDR3 .3C5 对 8G7|lO/1191% 丨13/1681% 丨10/1283%
[0160] 应当理解，可将序列表中示出的可变区或⑶R环加以修饰以用于本发明。通常，进 行修饰以保持序列的结合特异性。例如可以在不影响抗体结合特异性的情况下进行保守置 换。本发明涵盖这样的抗体，其包含与SEQ ID N0:3?8中的任一个中的⑶R环具有至少 80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少95%，更优选至少98%同一性的至少一个 CDR环。例如，为了使修饰的序列保持基本上相同的结合特异性，可以在该CDR环内进行1、 2、3或4个氨基酸置换。
[0161] 在一种可替换的实施方式中，可以有意地对本发明抗体的氨基酸序列进行修饰， 以降低该抗体的生物学活性。例如，保持能够结合至C5aR但缺少功能效应子结构域的修饰 抗体可以用作C5aR的生物学活性的抑制剂。
[0162] 氨基酸置换也可以包括使用非天然存在的类似物，例如，增加治疗给予的抗体的 血浆半衰期。
[0163] 一般地，相比于序列表中所示的相应可变区或⑶R环，优选少于20%、10%或5%的 变异体或衍生物的氨基酸残基被改变。
[0164] 在本发明的内容中，与序列表所示的可变区之一"基本上相同"的序列可以包含这 样的氨基酸序列，其与该可变区在超过至少20,优选至少50个氨基酸的氨基酸水平上至少 80%、85%或90%是相同的，优选至少95%或98%是相同的。同源性通常是相对于已知的对于 结合特异性必需的序列而不是非必需相邻序列的那些区域加以考虑的。
[0165] 同源性比对可通过肉眼，或更通常地利用易于获得的序列比对程序来进行。这些 商业上可获得的计算机程序可计算两个或多个序列之间的％同源性。
[0166] 百分比同源性可在连续序列上计算，S卩，一个序列与其他序列对准并将一个序列 中的每一个氨基酸直接与另一序列中的相应氨基酸进行比对，一次一个残基。这称为"无空 位"对准。通常，这样的无空位对准仅对相对较少数量的残基(例如，少于50个连续氨基酸） 实施。
[0167] 尽管这是非常简单并且一致的方法，但是它没有考虑到，例如，在其他方面相同的 一对序列中，一个插入或缺失将使得后续氨基酸残基的比对失效，因此当进行全局比对时， 可能导致％同源性的较大减少。因此，大多数序列比对方法被设计成产生考虑到可能的插 入和缺失的最佳对准，同时没有过度地对全部同源性评分罚分。这通过在序列比对中插入 "空位"以试图使局部同源性最大化而实现。
[0168] 大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当利用这样的软件进行序列比对时，优 选使用缺省值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包(参见以下）时，氨基酸序列的 缺省空位罚分对于一个空位为-12而对与每一个延伸为-4。
[0169] 因此，考虑到空位罚分，最大％同源性的计算首先需要产生最佳对准。用于实 施这样的对准的合适计算机程序是GCG Wise onsin Bestfit软件包（University of Wisconsin, U.S. A. ;Devereux等，1984, Nucleic Acids Researchl2:387)。可实施序列比对 的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见，Ausubel等，1999同上-Chapterl8)、 FASTA (Atschul 等，1990, J. Mol. Biol.，403-410)和比对工具的 GENEW0RKS 套装。BLAST 和FASTA可用于离线和在线检索(参见Ausubel等，1999同上，第7-58至7-60页)。然而， 优选使用GCG Bestfit程序。
[0170] 尽管最终％同源性可依照同一性进行测量，但比对过程本身通常不是基于全有或 全无（all-or-nothing)的成对比对。相反，通常使用成比例的类似性评分矩阵，基于化学 类似性或进化距离（evolutionary distance),将评分分配给每一对比对。通常使用的这样 的矩阵的实例是BL0SUM62矩阵-BLAST程序套装的缺省矩阵。GCG Wisconsin程序通常利 用公共缺省值或定制符号比对表(如果提供的话）（进一步的细节参见用户手册)。对于GCG 软件包优选使用公共缺省值，或在使用其他软件的情况下，优选使用缺省矩阵如BL0SUM62。
[0171] 一旦所述软件已经产生了最佳比对，就可以计算％同源性，优选计算％序列同一 性。软件通常完成这作为序列比对的一部分并产生数字结果。
[0172] 多克隆抗体
[0173] 本发明的抗体可以是多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法对于本领域技术人员是 已知的。多克隆抗体可在哺乳动物中建立，例如，通过一次或多次注射表达来源于转基因 哺乳动物的第一物种的多肽的细胞和如果需要的佐剂。通常，通过多次皮下或腹腔内注射 将这些细胞和/或佐剂注入到哺乳动物中。可以采用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和 MPL-TDM佐剂（单磷酰类脂A，合成的海藻糖二霉菌酸脂)。免疫方案可以通过本领域技术 人员在无需过度实验的情况下进行选择。
[0174] 单克隆抗体
[0175] 通过本发明方法生产的抗体可以可替换地是单克隆抗体。单克隆抗体可以利用杂 交瘤方法，如由Kohler和Milstein, Nature, 256:495 (1975)描述的那些方法来制备。在一 种杂交瘤方法中，通常利用表达来源于转基因哺乳动物的第一物种的多肽的细胞对小鼠、 仓鼠、或其他适当的宿主动物进行免疫，以引发产生或能够产生将特异性地结合至该第一 物种的多肽的抗体的淋巴细胞。
[0176] 一般地，如果期望得到人源的细胞，则使用外周血淋巴细胞("PBL")，或者如果期 望得到非人哺乳动物源的细胞，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后利用合适的融合剂(如 聚乙二醇）将淋巴细胞与永生化细胞系进行融合，以形成杂交瘤细胞（Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, Academic Press, (1986)ρρ· 59-103)。永生化细胞 系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠 或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在合适的培养基中进行培养，该培养基优选包含一 种或多种抑制未融合的、永生化细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺少次黄 嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常会包括次黄嘌 呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷("HAT培养基")，该物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
[0177] 优选的永生化细胞系是有效地融合、支持通过所选抗体产生细胞的抗体的高水平 表达的那些，并且对如HAT培养基之类的培养基敏感。更优选的永生化细胞系是鼠类杂交 瘤系，其可从例如加利福尼亚州圣地亚哥的索尔克研究院细胞分配中心（Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.)以及弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典 型培养中心（American Type Culture Collection，Manassas，Va.)获得。也已经有关 于人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系用于生产人类单克隆抗体的描述（K 〇zb〇r，J. Immunol., 133:3001 (1984);Brodeur et al. , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc.，New York, (1987)pp. 51-63)。
[0178] 然后可以测定在其中培养杂交瘤细胞的培养基是否存在针对第一物种的多肽 的单克隆抗体。优选地，通过杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀 或通过体外结合测定如放射免疫测定（RIA)或酶联免疫吸附测定（ELISA)加以确定。这 样的技术和测定在本领域是已知的。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson和 Pollard, Anal. Biochem.，107:220 (1980)的 Scatchard 分析法来确定。
[0179] 在鉴定了需要的杂交瘤细胞之后，克隆体可以通过有限稀释程序进行亚克隆并 通过标准方法生长。用于此目的的合适培养基包括例如杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)和RPMI-1640培养基。可替换地，杂交瘤细胞可以 在哺乳动物内作为腹水在体内生长。
[0180] 由亚克隆体分泌的单克隆抗体可以通过常规的免疫球蛋白纯化程序例如蛋白质 A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、渗析或亲和色谱，从培养基或腹水流体分离或纯化。
[0181] 单克隆抗体也可以通过重组DNA方法，如在美国专利第4, 816, 567号中描述的那 些方法制备。编码本发明的单克隆抗体的DNA可以利用常规程序(例如，通过利用能够特异 性地结合至编码鼠类抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针）而容易地分离和测序。本 发明的杂交瘤细胞用作这样的DNA的优选来源。一旦分离，可将该DNA可以置入表达载体， 然后将其转染到宿主细胞内，如猿猴C0S细胞、中华仓鼠卵（CH0)细胞、或不会另外产生免 疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以获得在重组宿主细胞中的单克隆抗体的合成。也可以通过例如 用于人类重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源性鼠类序列（美国专利第4, 816, 567 号）或通过将免疫球蛋白的编码序列共价结合至全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列 对DNA进行修饰。可以用本发明的抗体的恒定结构域，或者本发明抗体的一个抗原组合位 点的可变结构域替代这样的非免疫球蛋白多肽，以生成嵌合双价抗体。
[0182] 这些抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法是本领域已知的。例如，一 种方法涉及免疫球蛋白轻链和经修饰的重链的重组表达。通常在Fc区中的任意点处将该 重链截断以防止该重链交联。可替换地，用另一氨基酸残基替代相关半胱氨酸残基或删除 相关半胱氨酸残基以防止交联。
[0183] 体外方法也适合于制备单价抗体。抗体消化产生其片段，尤其是Fab片段，可利用 本领域已知的常规技术完成。
[0184] 人类和人源化抗体
[0185] 本发明的抗体可以是人源化抗体或人类抗体。非人类(例如鼠类）抗体的人源 化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab'）2或抗体的 其他抗原结合序列)，其包含来源于非人类免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人 类免疫球蛋白（受体抗体)，其中来自受体的互补决定区（CDR)的残基被具有期望的特异 性、亲和力和能力的来自非人类物种(供体抗体）如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替代。在 一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人类残基替代。人源化抗体也 可以包含在受体抗体以及输入（import)⑶R或框架序列中均未发现的残基。一般地， 人源化抗体将包括基本上所有的至少一个、并且通常是两个可变结构域，其中所有或基 本上所有对应于非人类免疫球蛋白的CDR区域以及所有或者基本上所有的FR区域都是 人类免疫球蛋白共有序列。人源化抗体最优地还将包括免疫球蛋白恒定区（Fc)的至少 一部分，通常是人类免疫球蛋白的至少一部分（Jones et al.，Nature, 321:522-525(1 986);Riechmann et al·，Nature, 332:323-329(1988);以及 Presta，Curr· 0ρ· Struct. Biol.，2:593-596(1992))。
[0186] 使非人类抗体人源化的方法是本领域公知的。通常，人源化抗体具有从非人类来 源引入到其内的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为"输入（import)" 残基，其通常取自"输入"可变结构域。人源化可实质上依照Winter和其同事的方法实施 (Jones 等，Nature, 321:522-525(1986) ;Riechmann 等，Nature, 332:323-327(1988) ;Verho eyen等，Science, 239:1534-1536 (1988))，通过用啮齿动物CDR或CDR序列代替人类抗体 的相应序列。因此，这样的"人源化"抗体是嵌合抗体(美国专利第4, 816, 567号)，其中显 著小于完整人类可变结构域已被来自非人物种的相应序列替代。在实践，人源化抗体通常 是人类抗体，其中一些CDR残基以及可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体的同源位点 的残基替代。
[0187] 人类抗体也可利用本领域已知的各种技术生产，包括噬菌体展示文 库（Hoogenboom 和 Winter, J. Mol. Biol. ,227:381 (1991); Marks et al.，J. Mol. Biol.，222:581 (1991))。也可利用Cole等人和Boerner等人的技术制备人单克隆抗体 (Cole et al. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985)以 及Boerner et al.，J. Immunol.，147 (1) :86-95 (1991))。类似地，人类抗体可以通过将人免 疫球蛋白基因座引入到内源性免疫球蛋白基因已部分地或全部失活的例如小鼠的转基因 动物中而制得。经激发后，观察到产生人类抗体，其所有方面都非常类似于在人类中观察到 的，包括基因重排、组合、以及抗体谱。这种方法在例如美国专利第5, 545, 807、5, 545, 806、 5, 569, 825、5, 625, 126、5, 633, 425、5, 661，016 号以及以下科学出版物：Marks 等，Bio/Tech no logy 10, 779-783 (1992) ; Lonberg 等，Nature368856_859 (1994) ;Morri son, Nature368, 81 2-13(1994);Fishwild等，Nature Biotechnologyl4, 845-51(1996);Neuberger, Nature Bi otechnologyl4, 826 (l"6) ; Lonberg 和 Huszar, Intern. Rev. Immunol. I365-93 (I995)中有 描述。
[0188] 这些抗体也可以是利用已知的选择和/或如本领域已知的诱变方法亲和力成熟 的。优选的亲和力成熟抗体具有比制备该成熟抗体的起始抗体(通常是鼠类、人源化或人 类）大5倍，更优选大10倍，甚至更优选大20或30倍的亲和力。
[0189] 双特异性抗体
[0190] 双特异性抗体是对于至少两个不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优选人类 或人源化抗体。例如，这些结合特异性之一可以是对C5aR的结合特异性，而另一个可以是 对于任何其他抗原的结合特异性，并且优选地是对于细胞表面蛋白或受体或受体亚单位的 结合特异性。
[0191] 用于制备双特异性抗体的方法在本领域是熟知的。传统地，双特异性抗体的重 组生产基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两个重链具有不同的特异性 (Milstein和Cuello, Nature, 305:537-539(1983))。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机分 配，所以这些细胞杂交瘤（quadroma)产生十种不同抗体分子的可能的混合物（potential mixture)，其中只有一种具有正确的双特异性结构。该正确分子的纯化通常通过亲和 层析步骤来完成。1993年5月13日公开的W093/08829以及Traunecker et al.，EMB0 J.，10:3655-3659(1991)中披露了类似的程序。
[0192] 可将具有期望的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合部位）融合于 免疫球蛋白恒定结构域序列。该融合优选与免疫球蛋白重链恒定结构域，包括铰链、CH2 和CH3区域的至少一部分融合。优选具有第一重链恒定区（CH1)，其包含对于在所述融 合的至少一种中存在的轻链结合所必需的部位。将编码免疫球蛋白重链融合的DNA， 以及如果期望的话，将免疫球蛋白轻链插入到分离的表达载体中，并共转染进合适宿主 有机体中。对于产生双特异性抗体的进一步的细节，参见，例如Suresh等，Methodsin Enzymology，121:210(1986)。
[0193] 根据W096/27011中描述的另一种方法，可以对一对抗体分子之间的界面进行改 造以使从重组细胞培养物回收的杂二聚体的百分比最大化。优选的界面包括抗体恒定结构 域的CH3区的至少一部分。在这种方法中，用较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代来自第 一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或 苏氨酸）替代大氨基酸侧链而在第二抗体分子的界面上形成与该较大侧链相同或类似大小 的互补"空腔"。这提供了一种增大杂二聚体的产率超过其他不需要的最终产物(例如同二 聚体）的机制。
[0194] 双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(例如，F(ab'）2双特异性抗体)。在 文献中已经描述过由抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，双特异性抗体可利用化学 键合来制备。Brennan等，Science229:81(1985)描述了一种程序，其中完整的抗体被蛋白 水解地切割以产生F(ab'） 2片段。这些片段在二硫醇复合试剂亚砷酸钠的存在下被还原， 以稳定邻位的二硫醇并防止分子间二硫化物形成。然后，所产生的Fab'片段转化成硫代硝 基苯甲酸盐（thionitrobenzoate，TNB)衍生物。然后Fab' -TNB衍生物之一通过用巯基乙 胺还原而再转化成Fab' -硫醇，并与等摩尔量的另一 Fab' -TNB衍生物混合以形成双特异 性抗体。生产的该双特异性抗体可用作用于酶的选择性固定的试剂。
[0195] Fab'片段可以直接从大肠杆菌（E. coli)回收并化学偶联以形成双特异性抗体。 Shalaby等，J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)描述了完全人源化双特异性抗体F (ab'）2分子 的生产。每一个Fab'片段分别由大肠杆菌分泌并经受体外直接化学偶联以形成双特异性 抗体。由此形成的双特异性抗体能够结合至过表达ErbB2受体的细胞和正常人类T细胞， 以及触发人细胞毒性淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶标的溶胞活性。
[0196] 用于直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术 也已被描述过。例如，已利用亮氨酸拉链产生双特异性抗体（Kostelny等，J. Immunol. 148 (5) : 1547-1553 (1992))。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽 连接至两个不同抗体的Fab'部分。抗体同二聚体在铰链区被还原形成单体，然后被再氧化 形成抗体杂二聚体。这种方法也可用于生产抗体同二聚体。由Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448 (1993)描述的"双特异抗体"技术提供了一种用于制备双特异 性抗体片段的可替换机制。这些片段包含通过连接子连接至轻链可变结构域（')的重链可 变结构域（V H)，该连接子太短以致于不允许相同链上的两个结构域之间配对。因此，一个片 段的VH和 '结构域被迫与另一个片段的互补\和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合 部位。也已经报道了通过利用单链Fv (sFv)二聚体来制备双特异性抗体片段的另一种策 略，参见 Gruber 等，J. Immunol. 152:5368 (1994)。
[0197] 考虑了具有多于两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体（Tutt等，J. Immunol. 147:60(1991))。
[0198] 异源偶联抗体（Heteroconjugate Antibody)
[0199] 异源偶联抗体也属于本发明的范围。异源偶联抗体由两个共价结合的抗体构 成。例如，已使这样的抗体使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利第4, 676, 980 号），并用于治疗HIV感染（W091/00360; W092/200373; EP03089)。考虑了这些抗体可以 利用合成蛋白质化学中的已知方法进行体外制备，包括涉及交联剂的那些方法。例如，可 以利用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的合适试剂的 实例包括亚氨基硫醇盐(或亚氨基硫羟酸盐，iminothiolate)和4-巯基丁亚氨酸甲酯 (methyl-4-mercaptobutyrimidate)以及在例如美国专利第4, 676, 980号中披露的那些。
[0200] 效应子功能改造
[0201] 可能需要就效应子功能而修饰本发明的抗体，以增强例如抗体在治疗癌症中的效 力。例如，可将半胱氨酸残基引入到Fc区域中，从而允许在该区域中形成链间二硫键。由此 产生的同二聚抗体可以具有改进的内在化能力和/或增大的补体介导的细胞杀伤以及抗 体依赖性细胞毒性（ADCC)，参见 Caron 等，J. Exp Med.，176:1191-1195(1992)和 Shopes，J. Immunol.，148:2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚抗体也可以利用如在 Wolff et al. Cancer Research, 53:2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来制备。 可替换地，可以对抗体进行改造(具有两个Fc区域）并且由此可以具有增强的补体溶解和 ADCC 能力，参见 Stevenson 等，Anti-Cancer Drug Design3:219-230 (1989)。
[0202] 免疫交联物
[0203] 本发明还涉及包含结合至细胞毒性剂如化疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动 物源的酶促活性毒素或它们的片段)、或放射性同位素（即，放射性结合物）的抗体的免疫交 联物。
[0204] 以上已经描述了用于产生这样的免疫交联物的化疗剂。可以使用的酶促活性毒 素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素 A链(来自绿脓假单胞菌)、 蓖麻毒素 A链、相思豆毒素 A链、蒴莲根毒素（modeccin) A链、α -八叠球菌、油桐蛋白、 石竹素蛋白、美洲商陆蛋白（PAPI、ΡΑΡΙΙ和PAP-S)、苦瓜抑制剂（momordica charantia inhibitor)、泻果素、巴豆毒蛋白、阜草黄抑制剂（sapaonaria officinalis inhibitor)、白 树毒素、米托洁林(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素以及单端孢霉烯类毒素。可 使用各种放射性核素来生产放射性结合物抗体。实例包括 212Bi、131I、131In、9°Y和186Re。抗 体和细胞毒性剂的结合物利用各种双功能蛋白偶联剂制成，所述偶联剂例如3-(2-吡啶二 硫基）丙酸N-琥拍酰亚胺酯（SFOP)、亚氨基硫杂环戊烧（iminothiolane) (IT)，亚氨酸酯 (如己二亚胺酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛）的双官能 团衍生物，双-叠氮基化合物(如双（对叠氮基苯甲酰基）己二胺)、双-二偶氮衍生物(如 双_(对二偶氮苯甲酰基）_乙二胺)、二异氰酸酯(如2, 6-二异氰酸亚苄酯)、以及双-活 性含氟化合物(如1，5_二氟-2, 4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如在Vitetta 等，Science, 238:1098(1987)中所述进行制备。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲 基二亚乙基三胺五乙酸（MX-DTPA)是用于放射性核素与抗体结合的示例性螯合剂，参见 W094/11026。
[0205] 在另一种实施方式中，可将抗体结合至"受体"（如抗生蛋白链菌素)以用于肿瘤预 定位（tumor pretargeting)，其中抗体-受体结合物给予患者，接着利用清洁剂从血液循 环除去未结合的结合物，然后给予结合至细胞毒性剂(例如放射性核素)的"配体"（例如，抗 生物素蛋白）。
[0206] 抗体同种型
[0207] 在某些情况下，依据它们的诊断或治疗效力，一个同种型的单克隆抗体可能比另 一同种型的单克隆抗体是更加优选的。例如，根据关于抗体介导的溶胞作用的研究，已知同 种型Y-2a和γ-3的未修饰小鼠单克隆抗体在溶解靶细胞中通常比Y-1同种型的抗体更 有效。这种差异性效力被认为是由于Y _2a和γ _3同种型更积极参与祀细胞的溶胞破坏 的能力。单克隆抗体的特定同种型可二次地由分泌不同同种型的单克隆抗体的亲代杂交瘤 来制备，通过使用同胞选择（sib selection)技术来分离类别转换变异体（class-switch variant) (Steplewski, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 82:8653, 1985 ; Spira, et al. , J. Immunol. Methods, 74:307, 1984)。
[0208] 结合特件
[0209] 在本发明的一种实施方式中，所述抗体依据其抑制浓度50值来定义。
[〇21〇] 术语"抑制浓度50%"（简写为"IC5(I"）表示一种抑制剂对于该抑制剂所靶向分子 的给定活性(例如，C5a与C5aR或其片段的结合)的50%抑制所需的浓度。本领域技术人员 应理解，更低的IC5(I值对应于更有效的抑制剂。
[0211] 在一种实施方式中，本发明的抗体抑制C5a与C5aR的结合，其中当在相同条件下 测定时，其IC 5Q值比MAb7F3低至少1. 5倍。
[0212] 在另一实施方式中，本发明的抗体抑制C5a与C5aR的结合，其中IC5(I低于500pM， 更优选低于400pM，更优选低于300pM，并且更优选低于200pM。优选地，这些IC 5(I值是如本 文的实施例中所述通过利用人嗜中性粒细胞实施的结合测定来确定的。
[0213] 本发明的另一实施方式涉及结合C5aR或其片段的抗体，其中当在相同条件下测 定时，其K D (亲和常数）比MAb7F3低至少1. 3倍，优选低1. 4倍。
[0214] 在另一实施方式中，本发明的抗体结合至C5aR或其片段，其中KD小于1.4nM，更优 选小于0. 7nM，更优选小于0. 5nM，更优选小于0. 3nM。
[0215] 本发明的另一实施方式涉及结合C5aR或其片段的抗体，其中当在相同条件下测 定时，其缔合常数或匕速率比MAb7F3高至少1.5倍。
[0216] 在另一实施方式中，本发明的抗体结合至C5aR或其片段，其缔合常数或匕速率为 至少6. 8X 105Μ?更优选为至少ΙΟΜ?，优选为至少3X 106Μ?。
[0217] 在一种优选的实施方式中，结合亲和力是通过抗体与来源于人C5aR的肽的结合 的BIACore分析来确定的。优选地，来源于人C5aR的肽包含序列LYRVVREEYFPPKVLCGVDYS HDKRRERAVAIV(SEQ ID N0:2)。更优选地，该结合分析在本文实施例中所描述的条件下通过 BIACore结合分析来实施。
[0218] 体外测丨定
[0219] 本发明的单克隆抗体适合体外利用，例如，在免疫测定中它们以液相利用或结合 至固相载体利用。这些抗体可以用于监测样品中的C5aR水平。类似地，抗-独特型抗体用 于测量样品中C5a水平。另外，在这些免疫测定中，可以各种方式可检测地标记这些单克隆 抗体。可利用本发明的单克隆抗体的免疫测定类型的实例是直接形式或间接形式的竞争性 和非竞争性免疫测定。这样的免疫测定的实例是放射性免疫测定（RIA)和夹心(免疫）测 定。使用本发明的单克隆抗体的抗原检测可利用以正向、反向或同步模式运行的免疫测定， 包括在生理学样品上的免疫组织化学测定来完成。本领域技术人员将知晓或者可以易于理 解其他免疫测定形式而无需过度实验。
[0220] 本发明的抗体可结合至许多不同载体并用来检测C5aR的存在。熟知的的载体的 实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙 烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿（magnetite)。对于本发明目的而言，载体的性质可以是可溶性的 或不溶性的。本领域技术人员将知晓用于结合单克隆抗体的其他合适载体，或者能够利用 常规实验确定。
[0221] 在一种实施方式中，天然表达C5aR的细胞或包含编码C5aR或其变体的重组核酸 序列的细胞用于本发明的结合测定。在适于受体表达的条件下保持这些细胞。在适合于 结合的条件下(例如，在合适结合缓冲液中）使这些细胞与抗体或片段接触，并通过标准技 术检测结合。为了确定结合，结合的程度可相对于合适对照加以确定(例如，与在没有抗体 下确定的背景对比，与第二抗体（即一个标准）的结合对比，与抗体和未转染细胞的结合对 比)。包含受体或脂质体(包含受体）的细胞部分，如膜部分可代替完整细胞使用。
[0222] 结合抑制测定也可用来鉴定结合C5aR和抑制C5a与C5aR或功能变异体的结合的 抗体或其片段。例如，可实施一个结合测定，其中相比于在没有抗体下的C5a的结合，检测 或测量C5a的结合(在存在该抗体的情况下）的减少。包含分离和/或重组哺乳动物C5aR 或其功能变异体的组合物可以与C5a和抗体同时接触或以一个接一个的顺序接触。在抗体 存在的情况下配体结合程度的降低表明通过该抗体使结合受到抑制。例如，配体的结合可 被降低或消除。
[0223] 可获得鉴定结合C5aR的抗体的存在的其他方法，如其他合适的结合测定，或监测 由受体结合触发的事件的方法，包括信号转导功能和/或细胞应答(例如白细胞运输）的刺 激。以这种方式鉴定的抗体可进一步评估以确定在结合后它们是否起到抑制C5aR的其他 功能和/或评定它们的治疗应用的作用。
[0224] 信号转导分析
[0225] 配体或促进剂(如激动剂）与C5aR的结合可导致通过这种G蛋白偶联受体的信号 转导，并且刺激G蛋白的活性以及其他胞内信号分子。通过一种化合物(例如抗体或其片段） 对信号转导功能的诱导可利用任何合适的方法加以监测。这样的测定可用来鉴定C5aR的 抗体激动剂。抗体或其功能片段的抑制活性可在测定中利用配体或促进剂，并评估抗体抑 制由配体或促进剂诱导的活性的能力而加以确定。
[0226] G蛋白活性，如GTP水解为GDP，或之后的由受体结合触发的信号转导事件，如胞内 (细胞溶质）游离钙浓度快速和瞬间增大的诱导可通过本领域已知的方法或其他合适方法 进行测定（参见，例如，他(^6，1(.6七31.，〇611，72:415-425，1993 ;￥3111^?616七31.，1』叉口· Med. , 177:851-856, 1993;Dahinden, C. A. et al. , J. Exp. Med. , 179:751-756, 1994)〇
[0227] 例如，Sledziewski等人利用杂合G蛋白偶联受体的功能测定可用来监测配体或 促进剂结合受体和激活G蛋白的能力（Sledziewski等，美国专利第5, 284, 746号）。
[0228] 这样的测定可在待评估的抗体或其片段存在下实施，并利用已知方法和/或本文 描述的方法来确定抗体或片段抑制由配体或促进剂诱导的活性的能力。
[0229] 趋化件和细朐刺激的测定
[0230] 趋化性测定也可用来评估抗体或其功能片段阻遏配体与C5aR的结合和/或抑制 与配体和受体的结合相关的功能的能力。这些测定基于由化合物诱导的细胞体外或体内的 功能迁移。趋化性可通过任何合适的手段进行评估，例如在利用96孔趋化性板的测定中， 或利用其他本领域已知的用于评估趋化性的方法。例如，Springer等人描述过体外跨内皮 趋化性测定法（transendothelial chemotaxis assay)的使用（Springer 等，W094/20142， 1994 年 9 月 15 公开；还参见 Berman 等，Immunol. Invest. 17:625-677 (1988))。也已描述 过越过内皮进入胶原凝胶的迁移（Kavanaugh等，J. Immunol.，146:4149-4156(1991))。小 鼠 Ll-2pre-B细胞或具有趋化能力的其他合适宿主细胞的稳定转染子可以用于趋化性测 定中。
[0231] 通常，趋化性分析监测合适细胞(如白细胞(例如淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性 粒细胞)）进入或通过屏障(例如，内皮、滤器)，朝向化合物的增高水平，从该屏障的第一表 面朝相对的第二表面的定向运动或移动。膜或滤器提供便利的屏障，以使合适细胞进入或 通过滤器朝向化合物的增高水平，从该滤器的第一表面朝该滤器的相对第二表面的定向运 动或移动被监测。在一些测定中，膜用物质涂覆以促进粘附，如ICAM-1、纤连蛋白或胶原。 这样的测定提供白细胞"寻靶（homing)"的体外近似。
[0232] 例如，可以检测或测量合适容器(一种容纳装置）中细胞从第一室迁移进入或通过 微孔膜迁移进入第二室(其包含待测试抗体，并且其通过所述膜与第一室分开）的抑制。选 择合适的膜，该膜具有用于监测响应于化合物的特定移动的合适孔大小，包括例如硝化纤 维素、聚碳酸酯。例如，可使用大小为约3-8微米，并优选为约5-8微米的孔。孔的尺寸可 以是在滤器上均匀的或者在合适的孔的尺寸的一个范围内。
[0233] 为了评估迁移和迁移的抑制，可利用标准技术(例如显微镜）确定迁移到滤器中 的距离、越过保持粘附于滤器的第二表面的细胞数量、和/或在第二室中累积的细胞数量。 在一种实施方式中，将细胞用可检测标签(例如，放射性同位素，荧光标签，抗原或表位标 签）加以标记，并且可在抗体或片段存在和不存在的情况下，通过利用适当方法(例如，通 过检测放射活性，荧光，免疫测定）而确定粘附于所述膜和/或在第二室中存在的标签的 存在来评估迁移。由抗体激动剂诱导的迁移程度可相对于适当对照来确定(例如，由所述 抗体诱导的未转染细胞的移动相比，相比于在没有抗体下确定的背景移动，相比于由第二 化合物（即，一个标准）诱导的移动程度)。在一种实施方式中，尤其是对于T细胞、单核细 胞或表达C5aR的细胞，可监测跨内皮迁移。在该实施方式中，评估通过内皮细胞层的移行 (transmigration)。为了制备细胞层，可以在微孔滤器或膜(可选地涂覆有诸如胶原、纤连 蛋白或其他胞外基质蛋白的物质）上培养内皮细胞，以促进内皮细胞的附着。优选地，培养 内皮细胞直至形成汇合(融合）的单层。各种哺乳动物内皮细胞可用于单层形成，包括例如 静脉、动脉或微血管内皮，如人脐静脉内皮细胞（Clonetics Corp，圣地亚哥，加利福尼亚 州)。为了测定响应于特定哺乳动物受体的趋化性，优选相同的哺乳动物的内皮细胞；然而， 也可以使用来自异源哺乳动物种或属的内皮细胞。
[0234] 通常，通过检测在朝向化合物水平增大的方向上，从滤器的第一表面朝向滤器的 相对第二表面进入或穿过膜或滤器的细胞的定向移动而实施测定，其中该滤器包含在第一 表面上的内皮细胞层。定向移动从邻近第一表面的区域发生，进入或穿过所述膜，朝向位于 滤器的相对侧上的化合物。在邻近第二表面的区域中存在的化合物的浓度大于邻近第一 表面的区域中的化合物浓度。
[0235] 在用来测试抗体抑制剂的一种实施方式中，可将包含能够迁移并表达C5aR的细 胞的组合物置于第一室中。将包含能够诱导第一室中细胞的趋化性(具有化学引诱物功能） 的一种或多种配体或者促进剂的组合物置于第二室中。优选地，在细胞置于第一室之前不 久，或与这些细胞同时，放置包含待测试抗体的组合物，优选地在第一室中。在该测定中，可 结合受体并抑制表达C5aR的细胞趋化性诱导(通过配体或促进剂）的抗体或其功能片段是 受体功能的抑制剂(例如，刺激功能的抑制剂)。在抗体或片段存在下由配体或促进剂诱导 的迁移程度的降低指示抑制活性。可实施单独的结合研究以确定抑制是否是抗体与受体结 合的结果或者经由不同机制发生。
[0236] 下文描述了监测组织的白细胞渗透（响应于该组织中注入的化合物(例如，趋化因 子或抗体)）的体内测定(参见炎症模式)。这些体内寻靶的模式测量细胞响应于配体或促进 剂通过迁移和趋化至炎症部位的能力以及评估抗体或其片段阻遏这种迁移的能力。
[0237] 除了上述方法，抗体或片段对C5aR的刺激功能的作用可通过利用包含受体的合 适宿主细胞，监测由活性受体诱导的细胞应答而进行评估。
[0238] C5aR的其他配体、抑制剂和/或促讲剂的鉴定
[0239] 上述的测定，其可用来评估本发明的抗体和片段的结合以及功能，可适于鉴定其 他配体或结合C5aR或其功能变异体的其他物质，以及C5aR功能的抑制剂和/或促进剂。例 如，具有与本发明的抗体或其功能部分相同或类似结合特异性的试剂可通过利用所述抗体 或其部分的竞争测定进行鉴定。因此，本发明还涵盖鉴定该受体的配体或结合C5aR的其他 物质、以及受体功能的抑制剂(例如拮抗剂）或促进剂(例如激动剂）的方法。在一种实施方 式中，在测定中使用带有C5aR蛋白或其功能变异体的细胞(例如，白细胞，被改造成表达哺 乳动物C5aR蛋白或功能变异体（由引入所述细胞内的核酸编码）的细胞系或合适的宿主细 胞)，以鉴定和评估配体或结合受体的其他物质的效力，包括受体功能的抑制剂或促进剂。 这样的细胞也可用于评估表达的受体蛋白或多肽的功能。
[0240] 根据本发明，结合受体的配体和其他物质、受体功能的抑制剂和促进剂可在合适 测定中鉴定，并且进一步评估治疗作用。受体功能的拮抗剂可用来抑制（降低或阻止）受体 活性，而配体和/或激动剂可用来诱导(触发或增强）其中指定的正常受体功能。因此，本 发明提供了一种治疗炎性疾病，包括自身免疫性疾病和移植物排斥的方法，包括向个体(例 如，哺乳动物）给予受体功能的拮抗剂。本发明进一步提供了一种通过向个体给予受体功 能的新型配体或激动剂来刺激受体功能的方法，提供了选择性刺激白细胞功能的一种新途 径，其例如在治疗传染性疾病和癌症中是有用的。
[0241] 如本文中所使用的，C5aR蛋白的"配体"是指一种特定种类的物质，其结合于哺乳 动物C5aR蛋白，包括天然配体以及天然配体的合成和/或重组形式。在一种优选的实施方 式中，C5aR蛋白的配体以高亲和力发生结合。
[0242] 如本文中所使用的，"拮抗剂"是一种抑制（降低或阻止）C5aR蛋白的至少一种功 能特性的物质，如结合活性(例如，配体结合、促进剂结合、抗体结合)、信号转导活性(例如， 哺乳动物G蛋白的活化、细胞溶质游离钙浓度的快速和瞬间增大的诱导)和/或细胞应答功 能(例如，趋化性、胞吐作用或通过白细胞的炎性介质释放的刺激)。术语拮抗剂涵盖结合受 体的物质(例如，抗体、天然配体的突变体、小分子量有机分子、配体结合的其他竞争性抑制 剂)、以及抑制受体功能而不与其结合的物质(例如，抗-独特型抗体)。
[0243] 如本文中所使用的，"激动剂"是一种促进(诱导，引发，增强或增加)C5aR蛋白的至 少一种功能特性的物质，如结合活性(例如，配体、抑制剂和/或促进剂结合)、信号转导活性 (例如，哺乳动物G蛋白的活化、细胞溶质游离钙浓度的快速和瞬间增大的诱导)和/或细胞 应答功能(例如，趋化性、胞吐作用或通过白细胞的炎性介质释放的刺激)。术语激动剂涵盖 结合受体的物质(例如，抗体，来自另一物种的天然配体的同系物)、以及促进受体功能而不 与其结合的物质(例如，通过激活相关蛋白）。在一种优选的实施方式中，激动剂不同于天然 配体的类似物。
[0244] 因此，本发明还涉及一种检测或鉴定结合C5aR或结合其变异体的配体的试剂(包 括配体、拮抗剂、激动剂和结合C5aR或功能变体的其他物质)的方法。根据该方法，可将待 测试的试剂、本发明的抗体或抗原结合片段(例如，具有与7F3相同或类似的表位特异性的 抗体，以及其抗原结合片段）以及包含C5aR或其配体结合变异体的组合物进行组合。将前 述组分在适合于抗体或抗原结合片段与C5aR结合的条件下进行组合，并且根据本文所述 的方法或其他合适方法直接或间接地检测或测量抗体或片段与C5aR的结合。相对于合适 对照(例如，在没有待测试的试剂下）形成的复合体的量的减少是该试剂结合所述受体或变 体的指征。包含C5aR的组合物可以是带有重组C5aR蛋白或结合其变异体的配体的细胞的 膜部分。抗体或其片段可用标签加以标记，如放射性同位素、自旋标签、抗原或表位标签、酶 标签、荧光基团以及化学发光基团。
[0245] 抗_C5aR mAb的置换可以更易于鉴定C5a受体拮抗剂是有原因的。C5a与C5aR的 结合是涉及C5aR的不同区域的两步过程(参见Klco et al.，2005)，且抗-C5aR单克隆抗 体，即7F3或3C5识别第二胞外环中的用于抑制的单个关键区域。
[0246] 炎症樽型
[0247] 可用来评估本发明的抗体和片段作为治疗剂在体内的作用的炎症的体内 模型是可获得的。例如，可监测经过与C5aR反应性的趋化因子和抗体或其片段 皮内注入到合适动物，如兔、小鼠、大鼠、豚鼠或猕猴中的白细胞渗入(参见，例如， Van Damme, J.等，J. Exp. Med. ,176:59-65 (1992); Zachariae，C.0.C. et al.，J. Exp. Med. 171:2177-2182(1990) ; Jose, P.J.等，J. Exp. Med. 179:881-887(1994))。在一种实施 方式中，皮肤活组织检查组织学地评估白细胞(例如，嗜酸性粒细胞，粒性白细胞）的渗入。 在另一实施方式中，将能够趋化且外渗的标记细胞(例如，稳定转染的表达C5aR的细胞）给 予该动物。待评估的抗体或片段可在标记细胞给予试验动物之前、同时或之后给予。与没 有抑制剂下的渗入程度相比，抗体存在下渗入程度的降低是抑制的指征。
[0248] 应甩
[0249] 本发明的抗体可应用于在各种应用，包括研究、诊断和治疗应用。
[0250] C5aR在白细胞运输中具有重要的作用。因此，C5aR是嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细 胞、T细胞或T细胞亚组或单核细胞迁移到某些炎性部位的化学引诱物受体，所以抗_C5aR 抗体可以用来抑制(减少或阻止）白细胞迁移，尤其是与嗜中性粒细胞组织损伤，如再灌注 损伤和休克、T细胞机能障碍如自身免疫性疾病，或过敏反应或单核细胞介导的紊乱如动脉 粥样硬化相关。
[0251] 本文描述的抗体可用作抑制(减少或阻止）（a)与受体的结合(例如配体、抑制剂或 促进剂的结合)，（b)受体信号转导功能，和/或（c)刺激功能的抑制剂。用作受体功能的抑 制剂的抗体可直接或间接地阻遏配体或促进剂结合(例如，通过引起构象变化)。例如，抗体 可通过抑制配体的结合或通过脱敏(有或没有抑制配体的结合）而抑制受体功能。
[0252] 因此，本发明提供了一种抑制哺乳动物(例如人类患者）体内白细胞运输的方法， 包括向该哺乳动物给予有效量的本发明的抗体。本发明还提供了一种抑制与C5aR活性相 关的其他作用如从嗜碱性粒细胞释放组胺和从嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细 胞释放颗粒的方法。给予本发明的抗体可导致疾病状态的改善或消除。
[0253] 单克隆抗体也可免疫治疗地用于免疫病理学相关疾病。如本文联合本发明的抗体 使用的，术语"免疫治疗地"或"免疫疗法"表示预防性以及治疗性给药。因此，这些抗体可 给予高危险患者以便减轻免疫病理学疾病的可能性和/或严重性，或者给予已显示活动性 疾病的迹象，例如由于革兰氏阴性菌感染导致的败血症的患者。
[0254] 这些抗体可用来治疗变态反应、动脉粥样化形成、过敏反应、恶性肿瘤、慢性和急 性炎症、组胺和IgE介导的变态反应、休克、以及类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、多发性硬 化症、同种异体移植物排斥、纤维变性疾病、哮喘、炎性肾小球病或任何免疫复合物相关紊 舌L
[0255] 可利用本发明的抗体治疗的人类或其他物种的疾病或症状包括但不限于：
[0256] (a)炎性或变态疾病和症状，包括呼吸性变态疾病，例如哮喘、变应性鼻炎、超敏 性肺病、过敏性肺炎、间质性肺疾病（ILD)(例如，特发性肺纤维化、或与类风湿性关节炎 相关的ILD、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、系统性硬化症、斯耶格伦综合征（Sjogren's syndrome)、多肌炎或皮肌炎）；过敏反应或超敏反应、药物变态反应(例如，对青霉素，头孢 菌素)、昆虫叮咬过敏；炎性肠疾病，如克罗恩氏病（Crohn's disease)和溃瘍性结肠炎；脊 椎关节炎；硬皮病；银屑病和炎性皮肤病，如皮炎、湿疹、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、 荨麻疹、血管炎(例如，引起坏死的、影响皮肤的和超敏性血管炎）；
[0257] (b)自身免疫性疾病，如关节炎(例如，类风湿性关节炎，牛皮癣性关节炎)、多发性 硬化症、系统性红斑狼疮、重症肌无力、青少年型糖尿病、肾炎(如肾小球肾炎)、自身免疫性 甲状腺炎、贝切特病（Behcet' sdisease);
[0258] (c)移植物排斥(例如在移植中），包括同种异体移植物排斥或移植物抗宿主病；
[0259] (d)动脉粥样硬化；
[0260] (e)具有白细胞（白血球）渗入皮肤或器官的癌症；
[0261] (f)可由其中不期望的炎性应答受到抑制而得到治疗的其他疾病或症状(包括 C5aR介导的疾病或症状)，包括但不限于再灌注损伤、休克、成人呼吸窘迫综合征、某些恶 性血液病、细胞因子诱导的毒性(例如感染性休克、内毒素性休克)、多肌炎、皮肌炎、类天疱 疮、阿尔茨海默病和肉芽肿病包括肉样瘤病、血友病滑膜炎和与年龄相关的黄斑退行性病 变。
[0262] 本发明的抗_C5aR抗体可阻遏一种或多种配体的结合，从而阻遏导致以上紊乱的 一种或多种事件的下游级联反应。
[0263] 在一种优选的实施方式中，本发明的抗体用于治疗败血症、休克和成人呼吸窘迫 综合征。
[0264] 在另一实施方式中，本发明的不同抗体可用来检测C5aR以测量受体的表达，例如 在白细胞(例如嗜中性粒细胞、单核细胞、B细胞)、内皮细胞上和/或在用受体基因转染的 细胞上。因此，它们可用于诊断或研究目的的诸如细胞分选(例如，流式细胞仪，荧光活化细 胞分选）的应用中。
[0265] 本发明的抗_C5aR抗体在诊断应用中具有价值。通常，诊断测定需要检测由抗体 或其片段与C5aR结合得到的复合体的形成。对于诊断目的，抗体或抗原结合片段可被标记 或未标记。抗体或片段可直接标记。可采用各种标签，包括但不限于放射性核素、荧光剂、 酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂和配体(例如，生物素，半抗原)。本领域技术人员知晓大量 适合的免疫测定（参见，例如美国专利第3, 817, 827 ;3, 850, 752 ;3, 901，654和4, 098, 876 号)。组织样品的免疫组织化学也可以用于本发明的诊断方法中。当未标记时，可利用合适 方式检测抗体或片段，例如在凝集测定中。未标记抗体或片段也可与另一（即一种或多种） 可用来检测抗体的合适试剂的组合使用，如与第一抗体(例如，抗-独特型抗体或对于未标 记免疫球蛋白是特异性的其他抗体)或其他合适试剂(例如，标记蛋白A)是反应性的标记抗 体(例如，第二抗体)。
[0266] 也可制备用于检测生物学样品中存在C5aR蛋白的试剂盒。这样的试剂盒包括结 合至C5aR的抗体或其功能片段，以及一种或多种适合于检测抗体或片段与C5aR之间的 复合物的存在的辅助试剂。本发明的抗体组合物可以冻干形式提供(单独或与另外的对 其他表位特异性的抗体的组合)。抗体可以是标记或未标记的，其可与佐剂成分（adjunct ingredient)(例如，缓冲剂，如Tris、磷酸盐和碳酸盐、稳定剂、赋形剂、杀菌剂和/或无活 力蛋白例如牛血清白蛋白)一起包括在所述试剂盒中。例如，抗体可作为与佐剂成分的冻干 混合物提供，或者佐剂成分可单独提供以由使用者进行组合。通常，基于活性抗体的量，这 些佐剂材料（adjunct materials)以低于约5%重量存在，并且基于抗体浓度，通常以至少 约0. 001%重量的总量存在。在采用能够结合至单克隆抗体的第二抗体的情况下，可在试剂 盒中提供这样的抗体，例如在单独的小瓶或容器中。如果存在第二抗体，则其通常被标记， 并且可以与上述抗体制剂类似的方式进行配制。
[0267] 类似地，本发明还涉及一种通过细胞的C5aR检测和/或定量表达的方法，其中，包 含细胞或其部分(例如膜部分）的组合物在适于抗体或片段与其结合的条件下与本发明的 抗体接触，并监测该结合。抗体的检测是抗体和C5aR之间的复合物形成的指征，表明存在 受体。抗体与细胞的结合可利用诸如在W003/062278中描述的那些技术进行确定。该方法 可用来检测在来自个体(例如，在样品，如体液，如血液、唾液或其他合适样品）的细胞上的 C5aR的表达。在T细胞或单核细胞表面上的C5aR表达水平也可例如通过流式细胞仪来确 定,而且表达水平(例如，染色强度）可与疾病易感性、进展或危险相关联。
[0268] 给药樽式
[0269] 各种给药途径是可能的，包括但不必限于口服、饮食、局部、非肠道(例如，静脉内、 动脉内、肌内、皮下注射)、吸入(例如，支气管内、眼内、鼻内或口腔吸入、鼻内滴剂)，取决于 待治疗的疾病或症状。其他合适的给药方法还可包括可再加载或可生物降解装置以及缓慢 释放聚合物装置。本发明的药物组合物也可作为与其他试剂联合疗法的一部分而给予。
[0270] 待给予的抗体的剂型将根据选择的给药途径和剂型(例如，溶液、乳液、胶囊）而不 同。包含待给予的抗体的适合的药物组合物可在生理学可接受赋形剂或载体中制备。也可 使用抗体的混合物。对于溶液或乳液，合适的载体包括例如，含水或含醇/含水溶液、乳液 或混悬液，包括盐水和缓冲介质。非肠道载体可包括氯化钠溶液、林格式葡聚糖（Ringer's dextrose)、葡聚糖和氯化钠、乳酸化林格或非挥发油。各种适当的含水载体对于本领域技 术人员是已知的，包括水、缓冲水、缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)、葡 聚糖溶液和甘氨酸。静脉内载体可包括各种添加剂、防腐剂、或流体、营养剂或电解质补充 齐Ll (通常，参见，Remington'sPharmaceutical Science,第 16 版，Mack, Ed. 1980)。组合物 可以可选地根据需要包含药用辅助物质至适当的生理条件，如pH调节和缓冲剂以及毒性 调节剂，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠。本发明的抗体和片段可在根据本领 域已知冻干和重建技术使用之前被冻干以用于在合适载体中储存和重建。所选介质中活性 成分的最佳浓度可根据经验、根据本领域技术人员熟知的程序进行确定，并取决于期望的 最终药物制剂。对于吸入，抗体或片段可溶解并加载到合适的分配器(例如，雾化器、喷雾器 或压缩气溶胶分配器）中以用于给药。
[0271] 本发明抗体给药的剂量范围为足够大以产生期望的效果，其中免疫病理学疾病的 症状减轻或者感染的可能性或对于免疫系统的刺激降低。该剂量不应太大而引起有害副作 用，如高粘滞综合征、肺水肿、充血性心力衰竭等。通常，剂量将随着患者的年龄、症状、性别 和疾病程度而不同并且可由本领域技术人员确定。剂量可由任何并发症事件中的单个医生 调节。剂量可以在一天或多天中以每天一个或多个剂量给药，从约〇. lmg/kg至约300mg/ kg，优选从约0· 2mg/kg至约200mg/kg，最优选从约0· 5mg/kg至约20mg/kg变化。
[0272] 本发明的一种或多种抗体可通过适当途径，单独地或与另一药物或药剂组合(之 前、同时或之后）给予个体。例如，本发明的抗体也可与其他单克隆或多克隆抗体(例如，联 合结合趋化因子受体的抗体，该趋化因子受体包括但不限于CCR2和CCR3)联合使用，或与 抗-TNF或其他抗炎性药剂或与现有的血浆产品联合使用，如商业上可获得的在预防或治 疗中使用的Y球蛋白和免疫球蛋白产品。本发明的抗体可以作为与抗生素和/或抗菌剂 结合的单独给药组合物使用。
[0273] 本领域技术人员将理解，本发明的抗体可以通过给予包含编码该抗体的序列的核 酸分子而引入到受试者体内。该核酸分子的形式可以是DNA或RNA或包含DNA或RNA的嵌 合分子。编码该抗体的核苷酸序列可以被克隆进入表达载体中，其中编码该试剂的序列操 作性地与表达控制元件连接。表达控制元件在本领域是熟知的，并且包括例如启动子、增强 子以及适当的启始和终止密码子。
[0274] 可采用各种方法将编码抗体的核酸引入到体内靶细胞中。例如，可在靶部位注射 裸露核酸、可以囊化入脂质体、或者可以借助于病毒载体引入。
[0275] 单独或例如在阳离子脂质体中囊化的核酸分子的直接注射可以用于将编码TSP-1 的核酸的稳定基因转移到体内未分化或分化细胞中（Ulmer等，1993)。另外，可以利用粒子 轰击方法将核酸转移到体内各组织中（Williams等，1991)。
[0276] 病毒载体可用于将编码抗体的核酸分子基因转移到体内特定细胞类型中。病毒是 特化的感染剂，其可在特定细胞类型中感染并繁殖。这种对于感染特定细胞型的特异性特 别适合于将抗体靶向于所选定的体内细胞。病毒载体的选择将部分取决于待靶向的细胞类 型。
[0277] 特化病毒载体在本领域是熟知的，其可靶向特定细胞类型。这样的载体包括，例 如，具有一般或组织特异性启动子的重组腺相关病毒载体（US5, 354, 678)。重组腺相关病 毒载体具有额外的优点，即重组病毒可稳定地整合到甚至是休眠非增殖性细胞的染色质中 (Lebkowski 等，1988)。
[0278] 病毒载体可被构建成通过将组织特异性启动子或增强子并入到该载体中而进一 步控制表达所编码抗体的细胞类型（Dai等，1992)。
[0279] 逆转录病毒也适合用于体内递送编码该抗体的核酸分子的方法。这样的载体可被 构建成充当感染性颗粒或非感染性颗粒(其仅经过单次初始一轮的感染)。
[0280] 也可以以组织特异性方式，利用组织特异性配体或经由桥接分子与该核酸分子 非共价复合的抗体，利用受体介导的DNA递送方法将编码抗体的核酸分子递送到细胞中 (Curiel 等，1992;Wu 和 Wu, 1987)。
[0281] 为了获得受试者体内抗体表达的基因转移，也可通过例如自体同源细胞的体外转 染而实施。用于这样的体外转染的合适细胞包括血细胞，因为这些细胞易于通过本领域熟 知的方法进行操作并再次回引到受试者体内。
[0282] 通过体外细胞转染的基因转移可通过各种方法实施，包括例如磷酸钙沉淀、二乙 基氨基乙基葡聚糖、电穿孔、脂转染或病毒感染。这样的方法在本领域是熟知的(参见， 例如，Sambrook 等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual, Cold Springs Harbour Laboratory Press (1989))。一旦细胞被转染，然后就将它们移植或嫁接回到待治疗的受试 者体内。一旦引入到体内，这些细胞可产生抗体，其可进入循环并抑制疾病或病症部位处的 血小板聚集。
[0283] 在说明书全文中，术语"包含"，或变形如"包含"应理解为包含所述元件、整体或步 骤，或多个元件、整体或步骤的组，但不排除任何其他元件、整体或步骤，或多个元件、整体 或步骤的组。
[0284] 已包含在本说明书中的文献、条例、材料、装置、论文等的任何论述仅用于提供用 于本
【发明内容】
的目的。不应视为这些内容的任何或全部形成现有技术基础的一部分或者与 本发明相关领域中的公知常识，如在本申请每一个权利要求的 优先权日:之前在澳大利亚存 在的。
[0285] 本发明现在将通过以下实施例进行举例说明，这些实施例并不用于以任何方式限 制本发明。本文引述的所有参考文献的教导通过引用并入本文。
[0286] 实施例
[0287] 实验详述
[0288] 人类C5aR敲入小鼠的产生
[0289] 在小鼠 C5aR基因启动子的控制下，采用敲除/敲入策略以构建表达人类C5aR但 不表达小鼠 C5aR的转基因小鼠。靶载体包含C5aR基因外显子3的小鼠 C57BL/6基因组DNA 上游的3. 5kb区域、人类C5aR基因外显子3编码序列、小鼠 C5aR基因3'未翻译区域、磷酸 葡萄糖激酶启动子和由loxP部位侧悬的新霉素抗性基因以及载体pLOz中的C5aR基因的 小鼠基因组DNA下游的3kb区域（Ozgene，Perth, Australia)。基因组DNA片段利用PCR扩 增产生。将该载体转染到C57BL/6胚胎干细胞中，并将来自G418抗性克隆的DNA通过DNA 印迹进行筛选。Xba I和EcoR V消化的DNA分别与5'和3'探针杂交以鉴定在5'和3'端 都具有正确同源性重组事件的克隆体。从用正确靶向ES克隆体注射的胚泡产生的嵌合体 与C57BL/6雌性交配。通过小鼠尾部基因组DNA的DNA印迹来证实人类C5aR基因的种系 传递。产生了人类C5aR基因（hC5Rl +/+)的小鼠纯合子，并且PCR、DNA印迹和FACS染色证 实缺少mC5aR。
[0290] 嗜中性粒细胞分离
[0291] 改进的如先前所述从健康志愿者的外周静脉血分离人嗜中性粒细胞（Haslett et al.，（1985))。简而言之，收集到EDTA涂覆的真空采血管（vacutainer)内的血样以400x g 离心15min，然后将血浆和血沉棕黄层（buffy coat)去除。随后1%葡聚糖沉淀30分钟，白 血细胞通过300x g离心5分钟而成片状沉淀（pellet)并用PBS清洗。然后将这些细胞在 65% 帕可尔（percoll)(密度：1.093g/ml，Amersham Bioscience)的塾层上以 500x g 离心 30分钟。离心后，将嗜中性粒细胞再悬浮在PBS中。利用注射器穿过骨头通过强制注射具 有10%胎牛血清的5ml DMEM(GIBCO)介质而将小鼠嗜中性粒细胞从后腿股骨分离出来。嗜 中性粒细胞在菲科帕克（Ficoll-Paque (Amersham Bioscience))上通过密度离心而分离。 红血细胞用低渗缓冲液（155mM NH4Cl，10mM KHC03，lmM EDTA)溶解。通过台盼蓝排斥确定 细胞存活性并且将嗜中性粒细胞片状沉淀再悬浮在PBS中。
[0292] 单克隆抗体增殖
[0293] 将C57BL/6小鼠用?2X107表达高水平的hC5aR的L 1. 2转染子免疫化（Campbell et al. (1996))，以2周间隔腹膜内5次然后静脉内一次。在最后一次静脉内免疫之后4 天，取出脾并利用标准程序将细胞与SP2/0细胞系融合。用?1 X 107从hC5Rl+/+小鼠股骨 分离的嗜中性粒细胞以类似方式对C57BL/6小鼠免疫化，静脉内两次，腹膜内一次以及最 后进行静脉内免疫。杂交瘤在含有10%Fetalclone (HyClone)和HAT补体（SIGMA)的DMEM (GIBC0)中生长，并取培养物上清用于初始筛选。所选抗体的生产按比例增大并通过蛋白 A或G色谱纯化mAb，浓缩，缓冲交换，并除去内毒素。MAb浓度利用小鼠 IgG ELISA试剂盒 (Roche)确定。
[0294] 流式细胞计量
[0295] 为了评估mAb对转染细胞或白细胞的反应性，我们使用了间接免疫荧光染色和流 式细胞计量法。细胞用PBS清洗一次，并再悬浮在100 μ 1含有2%人血清和0. 1%叠氮化钠 (染色缓冲液)、纯化抗体或50 μ 1杂交瘤培养物上清液的PBS中。在4°C下20分钟之后，细 胞用染色缓冲液清洗两次，并再悬浮在50 μ 1 FITC-结合的亲和纯化的F(ab'）2羊抗-小 鼠 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories)(在染色缓冲液中以 1:200 稀释)中。在 4°C下孵育20分钟后，细胞用染色缓冲液清洗两次并在FACSCalibur (Becton-Dickinson) 上进行分析，以确定表面表达的水平。碘化丙啶染色用来排除死细胞。
[0296] 结合测定
[0297] 清洗人嗜中性粒细胞并以IX 107/ml再悬浮在结合缓冲液（50mMHEPES，pH7. 5, ImM CaCl2,5mM MgCl2，以及0. 5%BSA)中。对于每一个结合反应(终体积为120μ 1)，将40μ 1具 有适当量的抗-hC5aR mAb、同种型匹配的对照mAb或未标记的人类C5a (SIGMA)的细胞悬 浮液（4X 105个细胞）在室温下孵育15分钟。以0. 4nM的终浓度加入1251标记的人类C5a (Perkin Elmer)，并且使反应在室温下孵育60分钟。然后收集细胞并用含有150mM NaCl 的结合缓冲液清洗3次。然后将细胞转移到具有MicroScint20闪烁液的Opti板（Perkin Elmer)并在TopCount (Packard)上计算放射活性。每一个样品一式三份地进行测定。
[0298] BIACore 分析
[0299] 1.仪器试剂：
[0300] 1. 1 硬件 / 软件：BIACore2000/BIACore2000 控制软件
[0301] 运行缓冲液：HBS-EP (BIACore, #BR-1001-88)
[0302] 再生缓冲液：100mM HC1
[0303] 传感器芯片：传感器芯片SA (链霉亲和素）；BIACore#BR-1003-98)生物素化 人类 C5aR 肽(第二个环）：生物素-SGSGLYRVVREEYFPPKVLCGVDYSHDKRRERAVAIV_OH(SEQ IDN0:26)。
[0304] 2.测定程序/仪器设置：
[0305] 2. 1 测定的流速：30 μ 1/min
[0306] 2. 2条件：3X 1-分钟注射在50mM NaOH中的1M NaCl的SA芯片（Fcl和Fc2)。
[0307] 2.3样品制备：
[0308] 在 HBS-EP (BIACore,#BR-12001-88)中的稀释抗体样品
[0309] 对每一抗体使用以下浓度：
[0310] ?) ΙΟΟηΜ
[0311] ii)50nM
[0312] iii)25nM
[0313] iv) 12. 5nM
[0314] v)6. 25nM
[0315] vi)3.125nM。
[0316] 2. 4对照测定：
[0317] 在继续进行动力学研究之前测试用于与链霉亲和素（Fcl)非特异性结合的抗体。 使用最高浓度的待在动力学测定中使用的抗体(在HBS-EP中的ΙΟΟηΜ)。
[0318] 2. 5生物素化-肽23 (C5aR肽）与SA传感器芯片Fc2的固定：
[0319] 在HBS-EP中制备1 μ g/mL的Biot-肽。以手动注射?1000RU固定至Fc2。
[0320] 2. 6抗体动力学测定：
[0321] 利用动力学分析向导（Kinetic Analysis Wizard),依照提示并输入如以下概括 的分析参数：
[0322] 2. 6. 1输入要运行的浓度系列：
[0323] SP, 3. 125,6. 25,12. 5,25,50, ΙΟΟηΜ。一式两份地运行样品。
[0324] 2. 6. 2选择"直接结合测定"
[0325] 2. 6. 3选择："浓度系列"
[0326] 2. 6. 4在对话框中输入以下参数：
[0327] 使用Fc2,其中Fcl作为参照
[0328] 流速：30 μ 1/分钟
[0329] 注射时间：2分钟
[0330] 稳定时间：10分钟
[0331] 离解时间：20分钟
[0332] 选择："运行如所输入的样品"
[0333] 选择："下一步"。
[0334] 2. 6. 5再生方法：
[0335] 单次注射
[0336] 流速：30 μ 1/分钟
[0337] 再生缓冲液：100mM HC1
[0338] 注射时间：2分钟
[0339] 再生后的稳定时间：2分钟。
[0340] 2. 6. 6将抗体和再生缓冲液置于指定台架位置（rack position)
[0341] 2· 6· 7 运行向导（Wizard)。
[0342] 钙通量测定
[0343] 将新鲜分离的人嗜中性粒细胞如前所述（Ponath等（1996))在37°C下用Flu〇-3AM (分子探针）加载30分钟。样品在FACSCalibur流式细胞仪上运行并随时间测量线性荧光 强度。
[0344] 趋化性测定
[0345] 将悬浮在趋化性缓冲液(具有50%M199 (SIGMA)和2%胎牛血清（HyClone )的 RPMI1640)中的人类或小鼠嗜中性粒细胞（1-2X105个细胞/孔）置于12孔转移孔板 (12-well transwell plate) (Corning Costar Co.)的上室中，并允许在 30 分钟内越过 3 μ m滤器移动到含有人类或小鼠 C5a的下室中。通过60秒计数在FACSCalibur上计算迁 移细胞的数量。正前方角度和侧面散射口设置成排除碎片或不相关细胞。
[0346] 表达嵌合人类/小鼠 C5aR的细胞系的构建
[0347] 利用改进的PCR基重叠延伸技术（Wurch等1998)构建嵌合人类/小鼠 C5a受体。 简而言之，人类或小鼠 C5aR基因的不同片段通过PCR扩增。将重叠片段进行组合、变性和再 退火并进行第二轮PCR扩增。具有适当限制性酶部位的全长嵌合受体序列在第三个PCR步 骤中扩增，并克隆入pcDNA3. 1(+) (Invitrogen)以用于表达。根据人类C5aR和小鼠 C5aR 基因序列（基因文库（Genebank)替录号分别为M62505和S46665)设计PCR引物。该引物 包含相邻人类和小鼠 C5aR序列(表1 )。
[0348] 表 1
[0349] 示出了用来构建嵌合小鼠/人类C5a受体的PCR引物序列。红颜色的序列来自人 类C5aR基因，而蓝色序列对应于小鼠 C5aR。C5aR基因5'端正向引物并入了 ATG的Kozak 序列（下划线）上游和Hindlll部位(黑体)。3'反向引物并入了 Xbal位点（黑体）以促进克 隆入表达载体。
[0350]
【权利要求】
1. 一种抗体，包含： (i) 如在SEQ ID N0:7中所示的可变重链和如在SEQ ID N0:8中所示的可变轻链；或 (ii) 包含如在SEQ ID N0:7中所示的可变重链序列的⑶R1XDR2和⑶R3环序列的可 变重链和包含如在SEQ ID NO:8中所示的可变轻链序列的⑶R1、⑶R2和⑶R3环序列的可 变轻链。
2. 根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体是单克隆、重组抗体，嵌合或人源化抗 体。
3. -种单克隆抗体，其为MAb8G7,由以登录号06081803保藏在ECACC的杂交瘤产生。
4. 根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体与人类C5aR的第二胞外环(残基 175-206)是反应性的。
5. 根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体与包含人类C5aR的残基179-184 (EEYFPP)的表位是反应性的。
6. -种以登录号06081803保藏在ECACC的杂交瘤。
7. -种抗体，包含： (i) 如在SEQ ID N0:5中所示的可变重链和如在SEQ ID N0:6中所示的可变轻链；或 (ii) 包含如在SEQ ID N0:5中所示的可变重链序列的⑶R1XDR2和⑶R3环序列的可 变重链和包含如在SEQ ID NO:6中所示的可变轻链序列的⑶R1、⑶R2和⑶R3环序列的可 变轻链。
8. 根据权利要求7所述的抗体，其中，所述抗体是单克隆、重组抗体，嵌合或人源化抗 体。
9. 一种单克隆抗体，其为MAb7H3,由以登录号06081802保藏在ECACC的杂交瘤产生。
10. 根据权利要求7所述的抗体，其中，所述抗体与人类C5aR的第二胞外环(残基 175-206)是反应性的。
11. 根据权利要求7所述的抗体，其中，所述抗体与包含人类C5aR的残基179-184 (EEYFPP)的表位是反应性的。
12. -种以登录号06081803保藏在ECACC的杂交瘤。
13. -种结合物，包含根据权利要求1-5或7-11中任一项所述的抗体和治疗剂。
14. 一种结合物，包含根据权利要求1-5或7-11中任一项所述的抗体和可检测标签。
15. -种分尚的核酸分子，所述核酸分子包含编码根据权利要求1-5或7-11中任一项 所述的抗体的序列。
16. -种组合物，包含根据权利要求1-5或7-11中任一项所述的抗体和药用载体。
17. 根据权利要求1-5或7-11中任一项所述的抗体在制备药物中的应用。
18. 根据权利要求14所述的结合物在制备用于检测C5aR的试剂中的应用，所述检测包 括使从受试者获得的样品与所述结合物在体外接触，以及检测所述结合物与所述样品之间 的免疫特异性结合。
19. 根据权利要求1-5或7-11中任一项所述的抗体，用于制备用于治疗涉及白细胞或 嗜中性粒细胞移行的紊乱的药物。
【文档编号】A61P37/02GK104059149SQ201410134435
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2007年8月22日 优先权日:2006年8月22日
【发明者】查尔斯·雷伊·麦凯 申请人:G2炎症私人有限公司