专利名称：Her2-neu抗原阳性肿瘤治疗性疫苗的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学和医学领域，更具体地，本发明涉及一种Her2-neu抗原阳性肿瘤治疗性疫苗的制备及应用，所述的融合蛋白包括热休克蛋白与Her2-neu肿瘤抗原。
背景技术：
HER2/neu是人类肿瘤常发生改变的一个癌基因，与肿瘤的发生、发展密切相关，是表皮生长因子受体(Epidermal growth-factor receptor, EGFR)家族的第二位成员。表皮生长因子受体家族，也称为!ER或ErbB2家族，在细胞信号转导中发挥重要作用，是细胞生长、分化及存活的重要调节因子。人HER2/neu基因定位于17号染色体短臂，表达产物为分子量185KDa的单链跨膜 糖蛋白，即Pl85。pl85含有1255个氨基酸残基，细胞内段具有酪氨酸激酶活性，是一种酪氨酸激酶受体。人HER2/neu蛋白由三部分组成细胞外区(extracellular domain,EO))、跨膜区和细胞内区(intracellular domain, IQ))。HER2/neu的EQ)包括4个亚结构域,亚结构域I和III是配体结合域，介导受体配体结合；亚结构域II和IV，富含半胱氨酸，在形成受体二聚体过程中起着重要作用。HER2/neu胞内信号途径主要有2条，分别为丝裂原活化蛋白激酶(Ras-mitogen activated protein kinase, Ras/MAPK)、憐酸肌醇 3 激酶 / 蛋白激酶B(phosphoinositide-3-kinasee/protein kinase B，PI3K/AKT)。一般认为，HER2/neu 的ECD与配体结合后，引发受体变构，导致其与相同的或其他EGFR家族成员形成同、异二聚体，随后受配体被内吞并激活蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK),可使细胞膜内侧的PTK活性显著增加最终使癌细胞核内早期反应基因如原癌基因fos和jun等转录水平增加，促进有丝分裂等，从而能够促进肿瘤形成、进展。而且，HER2/neu的过度表达能引起HER2/neu同二聚体的激活而无需配体的结合，从而引起不受控制的细胞生长和癌基因的转化，因此，HER2/neu全蛋白或含有胞内段结构的片段应用于肿瘤疫苗中具有致瘤性和导致细胞不受控制的过度转化的潜在风险。此外，HER2/neu蛋白主要在胚胎期的组织或器官中表达，而在成年组织或器官极少表达，因而机体免疫系统往往不能有效识别而导致免疫耐受。人类的多种肿瘤组织均存在HER2/neu过度表达，如乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原发性肾细胞癌、胃癌、结直肠癌等。目前，手术、化疗、放疗等传统疗法对于早期ffiR2/neu阳性肿瘤具有一定的疗效，但一方面化疗、放疗具有较大的副作用，另一方面由于许多肿瘤发现较晚，往往失去手术治疗的最佳机会，所以通过增强机体免疫系统的抗肿瘤作用杀灭肿瘤细胞、达到治疗肿瘤目的的免疫与基因疗法作为肿瘤治疗的一种新模式，成为肿瘤治疗和免疫学研究的热点。目前对于HER2/neu阳性肿瘤已有多种免疫和基因治疗方案，如单克隆抗体、构建HER2/neu重组病毒疫苗、核酸疫苗、细胞因子的应用等。随着HER2/neu氨基酸序列中T细胞表位被发现，并证实其可以在体外诱导出特异性的细胞免疫应答，以这些表位肽为基础的肿瘤疫苗受到了研究者的关注，Disis采用完整P185蛋白不能有效诱导免疫应答，Georg采用HLA-A*0201限制性的九肽表位E75(Her2369_377)作为多肽疫苗可促发淋巴结阳性乳腺癌(NPBC)接受过治疗的某些无疾病患者的特异性免疫反应，然而，目前尚没有取得令人满意的免疫效果。因此选择适当的ffiR2/neu原癌基因片段区域是关键点，该片段既能够暴露某些表位而诱导免疫应答，又能够避免全长基因表达产物带来潜在转化危险。近年来，肿瘤抗原的发现、肿瘤免疫逃逸和抗肿瘤免疫应答机制的逐步阐明使人们认识到，如何有效提呈肿瘤抗原、激发机体对肿瘤抗原的应答能力是影响疗效的一个关键因素。树突状细胞研究的深入不仅使基础免疫学研究取得重要进展，而且给肿瘤的免疫治疗带来了希望。DC作为机体免疫系统中功能最强的专职性抗原递呈细胞(Antigen-presenting cell, APC),能高效地摄取、加工处理和提呈抗原，并能够显著的激活初始型T细胞以启动T细胞免疫应答反应,是机体免疫反应的始动者,处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。在受到抗原刺激后，DC经由循环或淋巴系统迁移至二级淋巴器官，并在此将所加工处理的抗原提呈给T细胞，在此过程中MHCI、II类分子、粘附分子等免 疫相关分子的高表达对DC功能的发挥起十分重要的作用。采用肿瘤抗原或其中的某些特异性表位肽致敏的DC作为肿瘤治疗性疫苗已经在基础及临床研究中得到了证实，在前列腺癌、黑色素瘤、恶性淋巴瘤等肿瘤中取得了较好的疗效，被认为是目前疗效最有前景的肿瘤免疫治疗方案。然而，单纯采用小分子的抗原肽体外致敏DC的效率一般较低，DC在摄取小分子肽后，往往不能有效递呈抗原并激发特异性的CTL(即细胞毒性T淋巴细胞)，因此如何增强DC对抗原的加工递呈，以期更有效地激发肿瘤抗原特异性的免疫应答仍然是肿瘤免疫治疗研究中亟待解决的问题。近年来有人尝试利用辅助蛋白，如KLH(钥孔虫戚血蓝蛋白)辅助肿瘤特异性的抗原去刺激DC，结果可增强抗肿瘤免疫应答。因此，发现并应用高效的辅助分子作为免疫佐剂(Adjuvant)，增强肿瘤抗原肽致敏DC的效能，从而诱导出更强的抗肿瘤免疫，是提高DC为基础的肿瘤免疫治疗的一个重要途径。随着免疫学研究的进展，新一代佐剂不断被发现，如热休克蛋白(Heat shockprotein, Hsp)、IFN- y、IL-12、LPS, lipid A和CpG等，其中Hsp以其所具有的独特的生物学效应，受到越来越多的关注。当细胞遭受严重应激时，Hsp可从细胞内释放出来，成为一种内在的“危险信号”向APC发出警示信息，并可活化DC，APC被Hsp趋化和激活后必将进一步激发免疫反应，引发抗原摄取和递呈，静息的T细胞由于获得APC呈递的抗原和危险信号的双重刺激而活化，从而引起抗体产生、病损细胞及感染因子的清除等一系列免疫过程。综上所述，因此，本领域迫切需要开发有效的Her2-neu阳性肿瘤治疗性疫苗。
发明内容
本发明的一个目的就是提供一种新的具有热休克蛋白和Herf-neu两者生物活性的物质，它是热休克蛋白和Her2-neu胞外区片段的融合蛋白。本发明的另一目的是提供编码所述融合蛋白的DNA、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。本发明的另一目的是提供一种成本低廉和/或步骤简便的生产所述Hsp70Ll-Her2-neu融合蛋白的方法。
本发明的另一目的是提供用该融合蛋白制备Herf-neu阳性肿瘤治疗性疫苗的方法。在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，它包括(a)肿瘤抗原Her2_neu元件,该元件具有人肿瘤抗原Her2_neu的胞外区或其免疫原性片段的氨基酸序列；(b)热休克蛋白元件，该元件具有人热休克蛋白或其活性片段的氨基酸序列；以及(c)任选的位于肿瘤抗原Her2_neu元件和热休克蛋白元件之间的连接肽序列。在另一优选例中，所述的肿瘤抗原Her2_neu元件的长度为90-200个氨基酸，较佳地100-150个氨基酸。·在另一优选例中，所述肿瘤抗原Her2_neu元件为含肿瘤抗原Her2_neu的342-456位的片段(如含341-456位的片段);和/或所述的热休克蛋白元件选自下组Hsp70或Hsp70Ll。在另一优选例中，所述的接头肽序列长度为1-30个氨基酸，较佳地1-4个氨基酸。在另一优选例中，所述的热休克蛋白元件具有SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列，所述的肿瘤抗原Her2-neu元件具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。在本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA分子，它编码本发明第一方面所述的融合蛋白。在本发明的第三方面，提供了含有上述DNA分子的载体和含有上述载体的宿主细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞选自大肠杆菌、酵母(如毕赤酵母、酿酒酵母、或甲醇酵母)。在本发明的第四方面，提供了一种产生本发明融合蛋白的方法，包括步骤在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养本发明第三方面所述细胞，从而表达出本发明第一发明所述的融合蛋白；和分离所述的融合蛋白。在本发明的第五方面，提供了本发明第一部分所述融合蛋白的用途，它用于制备治疗Her2-neu阳性肿瘤的治疗性疫苗药物或用于致敏树突状细胞。在另一优选例中，Her2_neu阳性肿瘤选自下组乳腺癌、肺腺癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌等恶性肿瘤。在本发明的第六方面，提供了一种树突状细胞，它是用本发明第一方面所述的融合蛋白致敏过的树突状细胞。在本发明的第七方面，提供了一种Herf-neu阳性肿瘤预防性或治疗性疫苗，它含有安全有效量本发明第六方面所述的树突状细胞或用树突状细胞诱导的T细胞或本发明第一方面所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体和赋形剂。在本发明的第八方面，提供了一种制备治疗性疫苗的方法，包括步骤将有安全有效量本发明第六发明所述的树突状细胞或用所述树突状细胞诱导的T细胞或本发明第一方面所述的融合蛋白，与药学上可接受的载体或赋形剂进行混合，从而形成治疗性疫苗。在本发明的第九方面，提供了一种制备致敏的树突状细胞的方法，包括步骤将树突状细胞与本发明第一方面所述的融合蛋白接触，从而致敏树突状细胞。
在本发明的第十方面，提供一种Her2_neu阳性肿瘤特异性细胞免疫的诱导方法，包括以下步骤采用本发明所述的融合蛋白致敏的树突状细胞体外刺激人外周血淋巴细胞。在另一优选例中，该刺激步骤包括(I)采用IO-IOOii g/ml的本发明所述的融合蛋白，与IO5-IO6个树突状细胞共同孵育，作用2-48小时，收集致敏的树突状细胞细胞；(2)将致敏后且用射线灭活的树突状细胞按树突状细胞T细胞为I : 1-10000的比例共同孵育，在完全培养基中添加10-100U/ml的IL-2，10-100ng/ml IL-7，10-100ng/mlIL-10，培养7天；
重复(I)、(2)步骤3-10次，收集增殖的T细胞，即为Her2_neu阳性肿瘤特异性T细胞。 在本发明的第十方面，提供了一种制备免疫个体的方法，包括步骤将需要免疫的对象施用有安全有效量本发明第六方面所述的树突状细胞或用所述树突状细胞诱导的T细胞或本发明第一方面所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物(包括人)。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
图I 显示了 pPIC9k-Hsp70Ll_Her2342_456 构建流程。图2显示了 pPIC9k-Hsp70Ll-Her2342_456酵母转化子阳性克隆的PCR鉴定结果。泳道1-10为用于鉴定的转化子克隆，泳道Mk为标准分子量DL2000。图3显示了经各个步骤纯化的Hsp70Ll-Her2342_456SDS_PAGE鉴定。泳道L为浓缩后的培养上清；泳道M为通过Phenyl HP柱纯化后目标蛋白；泳道N为通过Mono Q柱纯化后目标蛋白(终产品)；泳道MK为标准分子量DL2000。图4显示了 Hsp70Ll-Her2342_456融合蛋白致敏树突状细胞体外诱导Her2/neu特异性的T淋巴细胞CTL杀伤试验结果。图4A显示，对于SW620细胞，Hsp70Ll_Her2342_456组的效应细胞的杀伤能力显著高于Her2342_456组(P < 0. 05)，而对照组Hsp70Ll组的效应细胞未显示显著的杀伤活性(P< 0. 05)。图4B 显示，对于 SK-BR-3 细胞，Hsp70Ll_Her2342_456 组及 Her2342_456 组的效应细胞均无明显的杀伤效应。图4C 显示，负载 E75(Her2369_377，KIFGSLAFL)的 T2 细胞可被 Hsp70Ll_Her2342_456组及Her2342_456组的效应细胞杀伤，而且前者的杀伤效应显著高于后者(P < 0. 05)，而Hsp70Ll对照组的效应细胞没有显著杀伤活性(P < 0. 05)。图4D显示,所有实验组的效应细胞均不能杀伤本身不表达Her2/neu抗原但表达HLA-A*0201分子的T2细胞。图4E显示，所有实验组的效应细胞对结合有无关肽CAP-I的T2细胞均无显著的杀伤活性。图5显示了 Hsp70Ll_Her2342_456融合蛋白致敏的DC免疫诱导Her2/neu特异性CTL的检测结果图5A显示，对于SW620细胞，Hsp70Ll_Her2342_456组及Her2342_456组的效应细胞有显著的杀伤，且Hsp70Ll-Her2342_456组杀伤能力明显高于Her2342_456组(P < 0. 05)，而另两个对照组包括无明显杀伤活性。图5B 显示，对于负载E75(Her2369_377)的 T2 细胞，Hsp70Ll_Her2342_456 组及 Her2342_456组的效应细胞对其有杀伤活性，而且前者的杀伤效应明显高于后者(P < 0.05)，而另两个对照组均无有明显杀伤活性。图5C 显示，对于 SK-BR-3 细胞，Hsp70Ll_Her2342_456 组及 Her2342_456 组对其均无明 显的杀伤效应。图显示，所有实验组的效应细胞均不能杀伤T2细胞。图6显示了 SW620肿瘤在各过继回输组裸鼠体内的生长情况。回输Hsp70Ll-Her2342_456组小鼠脾细胞的裸鼠，肿瘤出现时间晚于其它对照组；且肿瘤直径低于各个对照组小鼠的肿瘤直径。图7显示了荷瘤裸鼠的存活曲线，回输Hsp70Ll_Her2342_456组小鼠脾细胞的裸鼠，其存活率和生存时间大于其他对照组。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次将Her2/neU胞外区的免疫原性片段和热休克蛋白(Hsp70Ll)融合在一起,产生新的融合蛋白。本发明人意外地发现，所述融合蛋白既具有肿瘤抗原Her2/neu胞外区的免疫原性又可避免全长Her2/neu基因表达产物带来潜在转化危险，还可以通过热休克蛋白将肿瘤抗原Her2/neu有效致敏树突状细胞，从而制得免疫性显著提高的Her2/neu阳性肿瘤疫苗。具体地，本发明Her2阳性肿瘤的治疗性疫苗采用了含多个T细胞表位的Her2342_456与具有独特免疫佐剂样效应的Hsp70Ll构建融合蛋白Her2342_456-Hsp70Ll，致敏DC使Her2342_456中的特异性抗原肽得到有效的识别、加工、处理，并递呈至体内的T细胞激发更强的HER2/neu特异性的T细胞免疫应答反应。因此，本发明的融合蛋白可以在两个元件的协同下增强抗肿瘤的效果，为抗肿瘤等治疗提供新的化合物。在此基础上完成了本发明。Herf/neu 阳性肿瘤如本文所用，术语“Herf/neu阳性肿瘤”包括指在肿瘤细胞膜上高度表达Her2/neu抗原的肿瘤，代表性的例子包括(但并不限于)直结肠癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤。Her2/neu 兀件如本文所用，术语“Her2/neu”、“Her2-neu”可互换使用。如本文所用，术语“Her2_neu元件”、“Her2_neu胞外区元件”与“肿瘤抗原Her2-neu元件”可以互换，该元件序列与天然的或变异的肿瘤抗原Her2-neU免疫原性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然肿瘤抗原Her2-neU基本相同的生物活性。
优选的肿瘤抗原元件Her2_neu是人肿瘤抗原Her2/neu或其免疫原性片段，例如对应于全长Her2-neu蛋白的第342-456位、或第341-456位的片段。热休克蛋白元件如本文所用，术语“热休克蛋白”包括热休克蛋白和热休克蛋白样蛋白，代表性的例子包括(但并不限于):Hsp70、Hsp70Ll (Hsp70-like protein I)及其他的热休克蛋白。这些热休克蛋白的序列可从Genbank数据库上获得。 如本文所用，术语“元件”指构成融合蛋白的某一段肽段，它来自于肿瘤抗原、热休克蛋白的氨基酸序列。在DNA水平，元件指相应的编码序列。热休克蛋白70L1元件与天然的或变异的全长热休克蛋白70L1或其活性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然热休克蛋白70L1基本上相同的生物活性。优选的Hsp70Ll元件是人热休克蛋白70L1，更佳地是全长的热休克蛋白70L1或其活性片段。
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Hsp70Ll是本发明人从人外周血单核细胞来源的DC cDNA文库中通过大规模随机测序发现的一种新分子(GenBank的登录号AF143723)，生物信息学分析表明该分子有典型Hsp70家族的特征，和Hsp70家族成员具有较高的同源性。本发明人前期研究结果也提示Hsp70L I具有与Hsp70类似的佐剂样效应，其诱导DC产生的细胞因子，具有促使免疫反应向Thl型免疫应答偏移的特点，体内实验也表明，Hsp70Ll与抗原肽交联的复合物免疫能诱导产生抗原特异性Thl型免疫应答反应。连接肽如本文所用，术语“连接肽”或“氨基酸连接臂”可互换使用，指位于肿瘤抗原Her2/neu胞外区元件的氨基酸序列和热休克蛋白元件的氨基酸序列之间的、起连接作用的短肽。连接肽的长度通常为1-40个氨基酸，较佳地为3-20个氨基酸，最佳地为2-10个氨基酸。技术人员可按照本领域常规方法(如参见PNAS 1998 ；95 :5929-5934 ；Protein Eng, 2000 ；13(5) :309-312 ；Protein Eng,2003 ；15(11) :871-879 等文献)设计连接肽。通常，连接肽不影响或严重影响肿瘤抗原Her2/neu胞外区元件的氨基酸序列和Hsp70Ll元件的氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象。优选的连接肽例子包括(但并不限于)为了有利于蛋白折叠成相互独立的结构域，用SGGGGSGGGG等序列作为连接臂是合适的；为了有利于蛋白酶把Her2/neu-HSp70Ll切割两个独立的蛋白分子，可用活性X因子的酶切位点(IEGR)作连接臂。相似的，糜蛋白酶I、木瓜蛋白酶、纤维蛋白溶酶、纤维蛋白酶、胰蛋白酶等的酶切位点也可设计作为氨基酸连接臂；为了有利于纯化，可把6His作为连接臂，以用金属亲和层析纯化Her2/neu-Hsp70L I融合蛋白；上述三种方案的结合也可设计成新的氨基酸连接臂，如融合了蛋白酶切位点(NIa蛋白酶)和金属亲和层析位点6His的连接肽。此外，另一种优选方式是将肿瘤抗原Her2/neu胞外区元件和热休克蛋白元件直接连接，而不含任何连接肽。融合蛋白及其制法如本文所用，术语“肿瘤抗原Her2/neu和热休克蛋白的融合蛋白”、“ Her2/neu-Hsp融合蛋白”与“Hsp_Her2/neu融合蛋白”等可互换使用，都指由肿瘤抗原的氨基酸序列和热休克蛋白的氨基酸序列融合而成的蛋白，其中在两者之间可以有或者没有连接肽序列。此外，所述融合蛋白可以具有或没有起始的甲硫氨酸或信号肽。
编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成，也可用PCR扩增或合成的方法获得肿瘤抗原和或热休克蛋白70L1的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。在获得了编码本发明 新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。代表性的状态包括(但并不限于)能在真核细胞如CH0、C0S系列等真核细胞中表达的载体，能在酿酒酵母或毕氏酵母中表达的载体，能在家蚕等昆虫细胞中表达的载体以及原核表达载体。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA ;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是甲醇酵母细胞。在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。药物组合物和给药方式本发明还提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物可以是治疗性的或预防性的(如疫苗)。本发明的药物组合物包括有效量的本发明的新型融合蛋白、或用该融合蛋白致敏的树突状细胞或用树突状细胞诱导的T细胞，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。对于含细胞的组合物，优选形式为液态剂型。
组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、癌旁、或局部给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明融合蛋白或相应的树突状细胞或T细胞施用于人，其中该安全有效量通常至少约I微克融合蛋白/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克融合蛋白/千克体重，较佳地该剂量是约I微克-I毫克融合蛋白/千克体重；或者，通常为IO5-IO14细胞/人/次，更佳地为IO6-IO12细胞/人/次。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。此外，本发明的融合蛋白还可与其他治疗药物联用，其中包括(但并不限于)各种细胞因子，如IFN、TNF、IL-2等；各种肿瘤化疗药物，如5_Fu、氨甲蝶呤等影响核酸生物合 成的药物，氮芥、环磷酰胺等烷化剂类，阿霉素、放线菌素D等干扰转录过程阻止RNA合成的药物，长春新碱、喜树碱类影响蛋白质合成的药物及某些激素等各类药物。综上所述，本发明的主要优点如下(l)Hsp_Her2/neu融合蛋白，既具有Her2/neu的免疫原性,又具有Hsp的免疫佐剂效应的作用，是一种具有双重优点的治疗肿瘤的新型药物，因而可以更显著地诱导出抗原特异性的T细胞免疫应答反应。(2)用本发明融合蛋白致敏的树突状细胞(DC)，可使Her2/neu特异性抗原肽得到有效的识别、加工、处理，并递呈至体内的T细胞激发更强的Her2/neu特异性的T细胞免疫应答反应。(3)动物试验表明，本发明的融合蛋白或疫苗可显著抑制肿瘤细胞的生长，增加动物存活率，延长存活时间。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。实施例IHer2序列设计和优化根据Her2核酸序列设计、合成甲醇酵母密码子优序列SEQ ID NO :1，并在3’端添加Not I酶切位点，序列连接于T载体pUC18(购自Invitrogen公司)，记为pucl8-HER2。该优化的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)编码的Her2/neu胞外区元件的氨基酸序列如SEQ IDNO :2所示，长度为115，对应于第342-456位。实施例2重组表达质粒的构建I. Her2342_456 和 Hsp70Ll 的 DNA 片段的获得以质粒pucl8-HER2为模板，以M13R和HSP-HER2-F为引物，得到用于构建融合蛋白的编码 Her2342_456 的 DNA 片段(PCR 产物 A，SEQ ID NO : I)。PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物M13R序列为
5' -CAGGAAACAGCTATGACC-3'，(SEQ ID NO :3)。3’端寡核苷酸引物HSP-HER2-F序列为5' -CTCTATTGAGATAGCATCTTGTTACGGTTTGGGTATG-3' (SEQ IDNO :4)。同时，收集经41°C热诱导Ih的HeLa细胞(ATCC Number :CCL_2)，利用细胞总RNA抽提试剂Trizol (Invitrogen公司)制备细胞总RNA,利用AMV逆转录酶(Promega公司)合成第一链，以其为模板，用序列如下的a -factor和HSP-HER2-R为PCR寡核苷酸引物进行扩增，得到用于构建融合蛋白的编码Hsp70Ll的DNA片段(PCR产物B，其编码的氨基酸序列为 SEQ ID NO :8)。PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物a-factor序列为5' -TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3' (SEQ ID NO :5)。·3 ’ 端引物 HSP-HER2-R 序列为5' -CATACCCAAACCGTAACAAGATGCTATCTCAATAGAG-3' (SEQ IDNO :6)。反应参数95°C 15秒，53°C 30秒，72°C 40秒，29个循环后72°C延伸lOmin，产物预期大小为1527bp，使用PCR纯化试剂盒进行纯化。2.构建 pPICZ a -Hsp70Ll-Her2342-456 转化子将上述步骤中获得的Her2342_456 (PCR产物A)和Hsp70Ll的DNA片段(PCR产物B)作为模板，以a-factor引物(SEQ ID NO :5)和M13R引物(SEQ ID NO. 3)进行扩增，得到Hsp70Ll-Her2342_456的DNA片段，胶回收后XhoI和NotI双酶切，同时用XhoI和NotI双酶切处理pPICZ a A质粒(购自Invitrogen公司)，按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌宿主菌DH5 a (Qiagen公司)，挑取阳性克隆，经XhoI-NotI酶切鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDye Terminator试剂盒，PE公司)。经测序证实，已插入了所设计的序列正确的Hsp70Ll-Her2342_456编码序列，插入位置与读框也全部正确。重组子记为pPICZ a -Hsp70Ll-Her2342-456o3.构建 pPIC9k-Hsp70Ll-Her2342_456 转化子将所获得的pPICZ a -Hsp70Ll_Her2342_456用SacI和BamHI双酶切，回收片段经试剂盒进行纯化，与SacI和BamHI双酶切处理的载体pPIC9k (购自Invitrogen公司)按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌宿主菌DH5 a，筛选pPIC9k-HSp70Ll-Her2342_456转化子。经SacI-BamHI酶切鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪,BigDye Terminator试剂盒，PE公司)。经测序证实，已插入了所设计的序列正确的Hsp70Ll-Her2342_456编码序列，插入位置与读框也全部正确。重组子记为pPIC9k-Hsp70Ll-Her2342_456。图I为pPIC9k-Hsp70Ll-Her2342-456 构建流程图。实施例3高表达Hsp70Ll-Her2342_456工程菌的构建及阳性酵母转化子的鉴定试剂盒(Qiagen公司)大量抽提pPIC9k-Hsp70Ll_Her2342_456质粒,用SacI内切酶线性化，2. OkV, 25 u F，200 Q的转化条件下电转化至GSl 15感受态酵母细胞，获得酵母转化子。将MD平板上的单克隆分别接种到3ml YTO培养基中，30°C培养24小时后提取酵母基因组DNA，以a -factor引物(SEQ ID NO 4)和3’ -aox引物(3，-AOX 5' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'，(SEQ ID NO :7))，PCR 鉴定酵母转化子。阳性的重组子经电泳鉴定。结果显示，对于阳性酵母转化子(记为pPIC9k-Hsp70Ll-Her2342_456酵母)，获得了
2.Ik左右的PCR条带(图2)，与预测值相符。其中，该融合蛋白不含连接肽？？。实施例4重组Hsp70Ll-Her2342_456蛋白的表达、纯化及鉴定挑选pPIC9k-Hsp70Ll-Her2342_456酵母转化子阳性克隆单菌落，将阳性克隆I、2、4、5、7和10于(图2)置于装有25ml BMGY培养基的250ml摇瓶中，于30°C，300rpm培养至0D600 = 0. 6 ;室温下1500rpm离心5min，收集菌体，用IOml BMMY培养基重悬菌体(约 10-20ml)，置于IOOml的摇瓶中，30°C，300rpm摇床继续生长；每1211添加100%甲醇至终浓度I. 0%，培养72h后离心，SDS-PAGE法检测重组蛋白的表达(图3，泳道L)。选取表达量最高的克隆用于后续的大规模重组蛋白表达。SDS-PAGE电泳结果显示，pPIC9k-Hsp70Ll_Her2342_456阳性酵母转化子菌中可观察到一条明显的重组蛋白表达带，分子量约为65kD，与预测的Hsp70Ll-Her2342_456目的蛋白的分子量相符。pPIC9k-Hsp70Ll-Her2342_456阳性酵母转化子培养上清加入硫酸铵至终浓度为
I.2M,上样至phenyl-SepharoseHP柱,采用20mM PB缓冲液洗脱目的蛋白峰。超滤浓缩目的蛋白组分，并将其转移至20mM Tris/HCl (pH8. 0)缓冲液中，进行SourceQ阴离子交换柱层析，采用NaCl梯度洗脱目的蛋白，各步骤的纯化组分进行SDS-PAGE鉴定(图2，泳道M/N)。纯化的重组Hsp70Ll_Her2342_456蛋白的鉴定通过行SDS-PAGE慢速银染得到Hsp70Ll-Her2342-456融合蛋白凝胶，DTS扫描仪扫描蛋白凝胶，ImageMster软件对融合蛋白进行纯度和分子量的计算。按说明书操作用鲎试剂盒检测重组Hsp70Ll_Her2342_456蛋白的内毒素含量。使用无LPS(脂多糖)的注射用水稀释样品，LPS标准作为参照。采用Lowery法测定蛋白质浓度蛋白定量标准和待测定蛋白分别用蒸馏水稀释到0. 5ml，加入2. 5ml新鲜配制的碱性铜溶液(25ml 4%碳酸钠，25ml 0. 2M氢氧化钠，0. 04M硫酸铜和0. 5ml 2%酒石酸钾)，摇匀，置于室温IOmin ;加入酚试剂0. 25ml，摇匀置于室温30min,650nm比色。根据各管的吸光度值和标准曲线计算样品的蛋白浓度。结果显示，纯化的重组Hsp70Ll_Her2342_456融合蛋白经SDS-PAGE电泳，慢速银染，显示单一的蛋白条带，分子量约65KD，凝胶扫描分析，纯化的重组Hsp70Ll-Her2342_456融合蛋白纯度>95%。内毒素含量小于0. lEU/yg。测定蛋白浓度为0. 5mg/ml。实施例5Her2/neu阳性肿瘤的治疗性树突状细胞疫苗的制备I. DC和T淋巴细胞的分离培养取新鲜分离的健康志愿者(HLA-A*0201+)的外周血白细胞，通过淋巴细胞分离液(Ficoll-Histopaque I. 077)(购于Sigma公司)密度梯度离心分离外周血单个核细胞。置37°C>5% CO2孵育2小时，贴壁的单核细胞在含人重组GM-CSF(即粒细胞-巨噬细胞克隆刺激因子)(500U/ml)(先灵葆雅公司)和人重组IL-4(白细胞介素_4) (10ng/ml) (Promega公司)的完全培养基中37°C、5% CO2进行培养，获得外周血单核细胞来源的DC。非贴壁细胞用5%胎牛血清的RPMI 1640培养基悬浮，过尼龙毛柱(37°C孵育I小时)，获得纯化的T淋巴细胞。2. DC 的致敏收集上述培养至第六天的健康志愿者(HLA-A*0201+)外周血单核细胞来源的DC，调整细胞浓度为2X IO5细胞/ml，lml/孔，分入24孔板，分别加入7. 5 y g/mlHsp70Ll-Her2342_456融合蛋白、对照重组Her2342_456蛋白和对照重组Hsp70Ll蛋白，孵育4小时后收集细胞，洗涤后悬浮在完全培养基中，用于刺激同体的T淋巴细胞。纯化的T淋巴细胞与致敏的同体DC于37°C、5% CO2条件下共培养(T DC =10 1)，第五天加入20U/ml rhIL-2(重组人白细胞介素-2) (Sigma公司)，培养7天后收集上述淋巴细胞，同样以10 I的比例再与新鲜制备的2X105/ml蛋白致敏的同体DC共培养进行第二轮的刺激，共培养7天，并依此法进行第三轮的刺激，培养过程中每隔3天加 入一次20U/ml rhIL-2, 2-3天半量更换新鲜培养基。末轮刺激后的7天收集细胞，使用免疫磁珠(Miltenyi Biotec公司)阳性选择分选⑶8+T细胞，方法严格依照厂商提供的说明书进行。实施例6Hsp70Ll-Her2342_456融合蛋白致敏树突状细胞体外诱导Her2/neu特异性的T淋巴细胞CTL杀伤试验采用4小时51Cr释放法检测CTL杀伤能力。方法如下用SW620细胞(Her2/neu+，HLA-A*0201+)、SK-BR-3 细胞(Her2/neu+，HLA_A*020D、T2 细胞分别作为靶细胞。一部分T2细胞悬浮在200 u I不含胎牛血清的RPMI1640培养基中，先与10 u g/ml E75 (Her2369_377，KIFGSLAFL,为Her2342_456中所含的一个HLA_A*0201限制性的表位)或无关肽CAP-I共孵育 60min。加入 200 u Ci 51Cr (Amersham Pharmacia 公司)，置 37°C水浴标记 90min,每间隔15min轻混匀一次，然后用培养基彻底洗去残余的51Cr,用作杀伤的靶细胞，按10 I、5 1、2. 5 I三个不同效靶比加入相应的制备好的效应细胞(分选出的各组⑶8+T细胞)培养4小时，离心收集各孔上清，用Y计数仪检测cpm值。最大释放组各孔为单独的靶细胞加100 ill 0. 1%的NP40(即乙基苯基聚乙二醇)；自发释放组为单独的靶细胞加完全培养基。各组均设三个复孔。杀伤率(％ )=(实验组cpm-自发释放组cpm) X 100/ (最大释放组cpm-自发释放组cpm)结果显示如图4所示。图4A中，Hsp70Ll_Her2342_456组的效应细胞显示了对SW620细胞的杀伤活性，而且杀伤能力显著高于Her2342_456组(P < 0. 05)，而对照组Hsp70Ll组的效应细胞未显示显著的杀伤活性(P < 0. 05)。对SK-BR-3细胞(图4B)，Hsp70Ll-Her2342_456组及Her2342_456组的效应细胞均无明显的杀伤效应，表明以上两组的效应细胞对靶细胞的杀伤是HLA-A*0201限制性的，而对表面递呈非HLA-A*0201限制性抗原表位的靶细胞无杀伤作用。对于负载E75(Her2369_377，KIFGSLAFL)的T2细胞，结果(图4C)显示其可被Hsp70Ll-Her2342_456组及Her2342_456组的效应细胞杀伤，而且前者的杀伤效应显著高于后者(P < 0. 05)，而Hsp70Ll对照组的效应细胞没有显著杀伤活性(P < 0. 05)。图4D显示所有实验组的效应细胞均不能杀伤本身不表达Her2/neu抗原但表达HLA_A*0201分子的T2细胞。对于将结合有无关肽CAP-I的T2细胞，结果发现所有实验组的效应细胞对其均未显示显著的杀伤活性(图4E)，表明效应细胞的杀伤活性只针对Herf/neu抗原。该结果证明Hsp70Ll-Her2342_456融合蛋白致敏的肿瘤患者外周血单个核细胞来源的DC体外诱导出了HLA-A*0201限制性的Her2/neu特异性的CTL。实施例7Hsp70Ll-Her2342-456融合蛋白致敏的DC体内诱导抗原特异性抗肿瘤效应I.小鼠骨髓树突状细胞(BMDC)分离颈椎脱位法处死HLA_A*0201/Kb转基因小鼠(The Jackson Laboratory),无菌取股骨，无血清培养基冲洗出骨髓细胞，溶除红细胞，加入抗Ia、B220、⑶4、⑶8单抗(终浓度均为IOy g/ml)及补体(10 I稀释)，37°C水浴45min溶除T、B及Ia+细胞，随后加IOng/ml mGM-CSF (Promega公司)、lng/ml mIL_4 (Promega公司)培养3天后，贴壁细胞重新加入新鲜完全培养基及mGM-CSF、mIL-4继续培养3天后，吹打收集疏松贴壁的增殖性细胞聚集·体置新瓶培养，3天后收集悬浮细胞即为富集的BMDC。2.蛋白体外致敏BMDC上述培养至第六天的小鼠DC，分别加入7. 5 ii g/ml Hsp70Ll-Her2342_456融合蛋白、对照重组Her2342_456蛋白和对照重组Hsp70Ll蛋白，并设置未刺激的DC作为空白对照组，孵育4小时后收集细胞,用于免疫小鼠。3. HLA-A*0201/Kb转基因小鼠的免疫以蛋白体外致敏的HLA-A*0201/Kb转基因小鼠的BMDC对同系小鼠进行免疫。每只小鼠后腿皮下注射I X IO6经7. 5 y g/ml蛋白致敏的同系小鼠的BMDC或未未经任何因素致敏的同系小鼠的BMDC。每只小鼠共免疫三次，间隔一周。4. CTL杀伤试验以上每组免疫小鼠的脾细胞加入7. 5 ii g/ml的重组Her2342_456蛋白作为抗原进行再刺激，补加25U/ml IL-2，培养7-9天，用作CTL测试其杀伤靶细胞的能力。靶细胞同实施例6。51Cr释放法检测CTL杀伤能力同实施例6。5.结果结果显示如图5所示。来自Hsp70L 1-Her2342_456组及Her2342_456组的效应细胞显示了对SW620细胞的显著杀伤(图5A)，而且Hsp70Ll-Her2342_456组的效应细胞杀伤SW620的能力明显高于Her2342_45f^i(P < 0. 05)，而另两个对照组包括Hsp70Ll组、未致敏的DC免疫组的效应细胞对靶细胞SW620没有明显杀伤活性。对于负载E75 (Her2369_377，KIFGSLAFL)的T2细胞，结果(图5B)发现Hsp70Ll-Her2342_456组及Her2342_456组的效应细胞对E75致敏的T2细胞具有杀伤活性，而且前者的杀伤效应明显高于后者(P < 0. 05)，而另两个对照组包括Hsp70Ll组、未致敏DC免疫组的效应细胞对负载E75的T2细胞没有明显杀伤活性。对于SK-BR-3细胞，结果(图5C)显示Hsp70Ll-Her2342_456组及单独的Her2342_456组的效应细胞对SK-BR-3细胞均无明显的杀伤效应，表明以上两免疫组的效应细胞对靶细胞的杀伤是HLA-A*0201限制性的，而对表面递呈非HLA-A*0201限制性抗原表位的靶细胞无杀伤作用。图显示，所有实验组的效应细胞均不能杀伤T2细胞。上述结果表明效应细胞的杀伤活性只针对Her2/neu抗原，说明Hsp70Ll_Her2342_456融合蛋白致敏的DC免疫HLA_A*0201/Kb转基因小鼠诱导其产生了 Her2/neu特异性的CTL。实施例8
裸鼠荷瘤及过继回输治疗效果的观察6-8周龄的雌性裸鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)，右侧腹部皮下一点接种体外培养扩增的SW620肿瘤细胞。三天后进行过继回输治疗。分组同实施例7中免疫HLA-A*0201/Kb转基因小鼠，另外设置单独腹腔注射IL-2的对照组。如前述经体外抗原再刺激7-9天后的免疫小鼠的脾细胞收集后尾静脉回输至荷瘤裸鼠体内，回输后第二天腹腔注射IL-2 2000U，以后隔天同样方法注射同样剂量的IL-2，第一次回输后7天进行第二次回输，方法相同。接种肿瘤细胞后每隔两天观察肿瘤出现及生长情况。记录各鼠肿瘤出现的时间，测量肿瘤的直径，观察各组小鼠的存活情况。结果显示，Hsp70Ll-Her2342_456融合蛋白致敏的DC免疫的HLA_A*0201/Kb转基因小鼠的脾细胞过继回输至负荷SW620肿瘤的裸鼠，可以显著抑制裸鼠体内肿瘤的生长，而且提高了小鼠的存活率。如图6，回输Hsp70Ll-Her2342_456组小鼠脾细胞的裸鼠，肿瘤出现时间明显晚于其它几个对照组(P<0. 05)。观察至第22天时，此组中出现肿瘤生长的小鼠的肿瘤平均直径明显的低于各个对照组小鼠的肿瘤平均直径(P < 0. 05)。由图7可见，几个对 照组裸鼠在荷瘤第25天至第50天之间全部死亡，而在第50天过继回输Hsp70Ll-Her2342_456组小鼠脾细胞的裸鼠存活率为25 %，观察至第90天此组中小鼠的存活率仍为25 %，且存活的小鼠体内均未观察到有肿瘤生长。实施例9Hsp70Ll-Her2341_456融合蛋白诱导特异性的T淋巴细胞CTL杀伤实验重复实施例1-6,不同点在于，Her2/neu元件采用肿瘤抗原Her2/neu的341-456位的片段，从而制得Hsp70Ll-Her2341_456融合蛋白。结果表明，该融合蛋白也可诱导Her2/neu特异性的T淋巴细胞CTL杀伤。实施例10含连接肽的Hsp70Ll-Her2342_456融合蛋白诱导特异性T淋巴细胞CTL杀伤实验重复实施例1-6,不同点在于,在Her2/neu元件与HSP元件之间存在因酶切位点引入的长度为2个残基的连接肽，从而制得Hsp70Ll-L2-Her2342_456融合蛋白。结果表明，该融合蛋白也可诱导Her2/neu特异性的T淋巴细胞CTL杀伤。实施例11含Hsp70Ll_Her2342_456融合蛋白致敏的DC的药物组合物重复实施例7，不同点在于，用人的DC细胞替换小鼠DC细胞。并且，将经Hsp70Ll-Her2342_456融合蛋白致敏的人树突状细胞置于生理盐水中，制成药物组合物，为注射剂剂型。实施例12含Hsp70Ll_Her2342_456融合蛋白的药物组合物将实施例4中制备的Hsp70Ll_Her2342_456融合蛋白进行冻干处理，制得药物组合物，为冻干剂型。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种融合蛋白，其特征在于，它包括 (a)肿瘤抗原Her2-neu元件,该元件具有人肿瘤抗原Her2_neu的胞外区或其免疫原性片段的氨基酸序列； (b)热休克蛋白元件，该元件具有人热休克蛋白或其活性片段的氨基酸序列；以及 (c)任选的位于肿瘤抗原Her2-neu元件和热休克蛋白元件之间的连接肽序列。
2.如权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述肿瘤抗原Her2-neu元件为含肿瘤抗原Her2-neu的342-456位的片段；和/或 所述的热休克蛋白元件选自下组Hsp70或Hsp70Ll。
3.如权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述的热休克蛋白元件具有SEQIDNO 8所示的氨基酸序列,所述的肿瘤抗原Her2-neu元件具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
4.一种分离的DNA分子，其特征在于，它编码权利要求I所述的融合蛋白。
5.—种载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的DNA分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求5所述的载体或染色体中整合有权利要求4所述的DNA分子。
7.—种产生权利要求I所述的融合蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤 在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和 分离所述的融合蛋白。
8.权利要求I所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备治疗Her2-neU阳性肿瘤的治疗性疫苗药物。
9.一种树突状细胞，其特征在于，它是用权利要求I所述的融合蛋白致敏过的树突状细胞。
10.一种Her2-neu阳性肿瘤治疗性疫苗，其特征在于，它含有安全有效量权利要求9所述的树突状细胞或用所述树突状细胞诱导的T细胞或权利要求I所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体和赋形剂。
全文摘要
本发明提供一种Her2-neu抗原阳性肿瘤治疗性疫苗的制备及应用。具体的，本发明提供了一种融合蛋白，该融合蛋白含有(a)肿瘤抗原Her2-neu胞外区元件和(b)热休克蛋白元件。本发明还提供用所述融合蛋白致敏的树突状细胞以及相应的肿瘤治疗性疫苗。试验表明，体内应用本发明疫苗可以有效激发Her2-neu抗原特异性的免疫应答，有效地应用于Her2-neu阳性肿瘤。
文档编号A61P35/00GK102838679SQ20111017252
公开日2012年12月26日 申请日期2011年6月23日 优先权日2011年6月23日
发明者吴艳峰, 万涛, 曹雪涛 申请人:中国人民解放军第二军医大学