专利名称：草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程/分子病毒学领域，特别是一种草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus ,缩写 GCRV,又禾尔草鱼出血病病毒 Grass carp hemorrhagic virus,缩写 GCHV) 外衣壳蛋白的基因工程疫苗制备方法。本发明所用病毒株为草鱼呼肠孤病毒湖南邵阳株 GCRV873，又称草鱼出血病病毒湖南邵阳株GCHV873，已由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期是2004年7月23日，保藏编号是CCTCC NO :V200414。
背景技术：
草鱼(Ctenopharyngodon idellus )是我国淡水水产养殖物四大家鱼之一，其价廉物美，深受广大消费者的喜爱。草鱼呼肠孤病毒是引起草鱼死亡的主要病原，发病严重时， 可造成85%以上的草鱼鱼苗发病死亡，由此给淡水养殖业造成严重的经济损失。对于病毒性疾病的防治，免疫防治是最为有效的措施，而且安全有效不污染环境。因此，对于病毒性疾病的防治，采用疫苗预防是最为快速、有效、便利的举措。草鱼呼肠孤病毒粗制组织浆及细胞灭活疫苗已相继应用于生产，并取得了一定效果。虽然先前也进行了 GCRV抗原亚单位疫苗的研制，但是抗原亚单位制备成本较高，且在疫苗的稳定性与安全性等方面存在诸多不利因素，其应用推广受到一定的局限。草鱼出血病在我国有些地区仍时有发生，而且，在我国大面积再度暴发的隐患依然不可忽视。鉴于粗制组织浆，细胞灭活疫苗及抗原亚单位疫苗所存在的不稳定性及残余核酸等遗传物质，以及用常规病毒纯化方法得到的病毒颗粒亚单位疫苗成本高与效价不稳定等因素，有必要对以前的制备方法进行改良。已证实GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7具有良好的抗原性，其相应抗体具有中和病毒外衣壳蛋白、阻止病毒进入细胞的能力，但通过纯化病毒得到的VP5和VP7抗原蛋白十分有限，运用基因工程手段对该病毒蛋白在体外进行高效重组表达，制备GCRV基因工程疫苗可以解决抗原蛋白来源有限的困难。近年来，在解析GCRV873基因组序列及三维结构与蛋白特性等研究方面的基础上，进行GCRV基因工程疫苗制备已成为可能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为克服上述现有技术的不足，提供一种新方法，该方法运用基因工程手段实现草鱼呼肠孤病毒蛋白在体外的高效重组表达，进而制备出草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗，从而为发展草鱼用病毒疫苗与商品化生产开辟新的有效途径。本发明解决其技术问题采用以下的技术方案
本发明提供的草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制备方法，其步骤包括
(1)采用Sf9昆虫细胞系增殖重组的GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7的重组杆状病毒 vAcGCRV-VP5/VP7 ；
(2)收集重组杆状病毒感染的细胞，采用离心沉淀法，去上清，得到感染重组病毒的sf9 细胞；(3)在离心沉淀中加入由表面活性剂Triton-X-IOO及蛋白酶抑制剂PMSF的PBS组成的细胞裂解液，经冰浴与冻融，得到裂解的重组病毒细胞悬液。PBS是磷酸盐缓冲液的英文缩写；
(4)采用蔗糖衬离心法，对重组病毒细胞悬液进行纯化；
(5)用PBS缓冲液稀释纯化VP5和VP7蛋白复合物，制成草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制剂。本发明可以采用包括以下步骤方法对感染重组病毒的sf9细胞进行裂解
(1)收集重组病毒感染72h的sf9细胞，低速离心沉淀细胞，以除去培养液上清；用PBS 缓冲液冲洗细胞3次，去除牛血清蛋白组分；
(2)在低速离心的细胞沉淀中加入3倍体积的细胞裂解液，充分混勻后，冰浴30min；
(3)冻融处理细胞，即置超低温-80°C冰箱冷冻及37°C水浴中快速溶解冷冻的细胞；
(4)重复2-3次冻融步骤，得到裂解的重组病毒细胞悬液。所述PBS缓冲液可以由137 mM NaCl,2. 7 mM KCl,8. 1 mM Nei2HPO4禾口 1. 5 mM KH2PO4 构成，pH 7.5。所述细胞裂解液可以由体积浓度为0. 5%Triton-X-100及ImMPMSF的PSB溶液组成。在低速离心沉淀细胞过程中，可以采用速度为8000r/min，离心20分钟沉淀细胞。本发明可以采用包括以下步骤方法对裂解的细胞悬液进行纯化
(1)将细胞裂解液加入离心的沉淀的细胞中，将该混合液冰浴30分钟后，置-60°C 至_80°C超低温冰箱冷冻；将冻融3次的重组病毒细胞悬液，以8000r/min低速离心30分钟，除去游离细胞碎片；
(2)将除去细胞碎片的悬液加入到占1/3体积含30%的蔗糖衬溶液的离心管中，然后以 28000r/min超速离心池，离心沉淀物为体外表达的VP5和VP7蛋白复合物；
(3)将纯化的体外表达VP5和VP7蛋白复合物按1 10倍体积溶于PBS中，于_20°C保存备用。本发明可以采用紫外分光光度计测定纯化后的体外表达VP5和VP7蛋白复合物的含量，用PBS缓冲液稀释定量，制成终浓度为lmg/ml的草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制剂。本发明与现有技术相比，具有以下主要优点 其一.表达量高，适于规模化大批量生产和应用
采用杆状病毒表达系统，通过基因工程手段不仅获得GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7在 Sf9细胞中的高效稳定表达，而且体外重组蛋白表达产量高，因此适于规模化大批量生产和应用。其二.具有良好的稳定性及免疫原性
通过蔗糖衬离心，纯化得到VP5和VP7蛋白，提高了其蛋白的稳定性。表达的蛋白产物为非融合蛋白，因此具有良好的免疫原性。其三.该基因工程亚疫苗安全性好，无病毒核酸成分。其四.通过浸泡处理鱼苗，可进一步提高鱼体免疫保护率。总之，本发明制备的GCRV基因工程疫苗不仅具有良好的稳定性和免疫原性，而且对草鱼鱼苗具有良好的免疫保护作用，其免疫保护率达到90%，适于疫苗规模化大批量生产和应用。
具体实施例方式本发明提供的草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗是采用基因工程方法得到的在昆虫细胞中高效表达GCRVVP5和VP7的基因工程疫苗。其GCRV基因工程疫苗的具体制备步骤是通过蔗糖衬离心，得到纯化的VP5及VP7蛋白复合物，将该纯化蛋白用0. 65%生理盐水稀释后浸泡鱼苗，获得达到90%的免疫保护效果。1.采用Sf9昆虫细胞系增殖重组的GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7的重组杆状病毒， 收集重组病毒感染72h的sf9细胞，低速离心沉淀细胞，去上清。用PBS即磷酸盐缓冲液冲洗3次，除去牛血清蛋白组分，在低速离心的细胞沉淀中加入3倍体积的裂解液，充分混勻后，置超低温冰箱冷冻。2.采用细胞裂解液(含0. 5% Triton-XlOO及1 mM PMSF的PBS)及经3次冻融处理，裂解重组病毒感染的sf9细胞。3.采用蔗糖衬离心法对裂解的病毒细胞悬液进行纯化。4.纯化后的VP5和VP7蛋白样品经紫外分光光度计测定其含量，用PBS稀释将其制成终浓度为lmg/ml的基因工程疫苗制剂。下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明。本发明草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制备可采用包括以下步骤的方法 一.重组病毒的增殖与培养
采用昆虫Sf 9细胞进行重组GCRV衣壳蛋白杆状病毒的转染及扩大培养。1. Sf9细胞的培养
Sf9细胞培养所用培养液为Sf-900SFM无血清培养基(Invitrogen)。取液氮中保存的 Sf细胞，置37°C水浴中温育直至冰溶解。然后在台式离心机上离心Imin后，加入适量的 Sf-900SFM无血清培养基(Invitrogen)，转移至培养瓶中进行培养。Sf9细胞最适培养温度为，在细胞培养2 3天，待细胞汇合度达到90-95%后，采用吸管吹打贴壁细胞至悬浮状态，分成3瓶，进行传代培养。2.重组病毒的增殖
将传代保存的重组病毒vAcGCRV -VP5/VP7细胞悬液以10 PFU/ml MOI (Plaque-forming unit, PFU 中文为空斑形成单位；Multiplicity of infection, MOI 中文为感染复数)的病毒感染细胞，感染72h收集病毒细胞悬液。二.细胞裂解与表达产物纯化与鉴定
将收集的重组病毒细胞悬液，在摄氏4°C下，以8000r/min低速离心20分钟沉淀细胞。 除去培养液上清后,用适量 PBS (137 mM NaCl, 2. 7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1. 5 mM KH2PO4; pH 7. 5)缓冲液冲洗细胞3次，去除牛血清蛋白组分。然后在离心沉淀的细胞中加入3倍体积的细胞裂解液(含0.5% Triton X-100 (Fluka公司产品)(聚乙二醇辛基苯基醚)，及 ImMPMSF (Sigma 公司产品)(Phenylmethanesulfonyl fluoride，中文名称苯甲基磺酰氟))的PBS，充分混勻后，冰浴反应30分钟，置_80°C冰箱冷冻，然后在37°C水浴中快速溶解低温冷冻细胞。将冻融3次的重组病毒细胞悬液，以8000r/min低速离心30分钟， 除去游离细胞碎片。将除去细胞碎片的病毒悬液加入到占1/3体积含30%的蔗糖衬溶液的离心管中，以^000r/min超速离心池，离心沉淀为体外表达的GCRV VP5和VP7蛋白复合物。采用SDS-PAGE进行表达产物的鉴定。三.体外表达VP5和VP7免疫原性与特异性分析
纯化后的重组体外表达VP5和VP7蛋白复合物抗原经紫外分光光度计(BioteK公司产品)测定，采用PBS将其制成终浓度lmg/ml制剂。取VP5和VP7蛋白复合物450 μ g (蛋白含量约ι μ g/μ 1)免疫家兔，2周后加强免疫2次，剂量与第一次相同，每次间隔14天。两周后，由颈动脉放血，ELISA方法检测抗体效价。在确定抗体效价后，利用已制备的VP5和 VP7原核表达蛋白及采用免疫印迹方法鉴定出其制备的抗体与VP5和VP7蛋白具有良好的特异性。四.中和实验与中和效价测定
采用固定病毒量一倍比稀释血清法进行病毒的中和效价测定。实验设置3组重复，于 M孔Corning板中进行。同时设病毒感染与正常细胞对照各一组。具体方法为用PBS缓冲液将待测血清作一系列倍比稀释，各稀释度的血清与已测定的病毒滴价的毒株悬液(滴价为100TCID5(i/0. Iml)进行等量混合。待每管病毒抗原与待测抗体充分混勻后，放置条件下孵育60min。每管取0. 2ml中和作用后之病毒样品接种于预先培养于M孔板中的 CIK细胞，吸附30min后，加入一定体积细胞维持液(MEM-2)，于进行培养，逐日观察， 记录细胞病变结果。未加抗血清的病毒感染细胞及正常未感染病毒的细胞分别为阳性与阴性对照。待测抗血清的中和效价按Reed-Muech法进行计算。实验测得该抗体中和效价为
1:1沘0。五.GCRV基因工程疫苗的免疫保护效果评估
将纯化的体外表达VP5/VP7蛋白复合物基因工程疫苗用0. 65%生理盐水进行一系列10 倍稀释，采用浸泡法对3、cm小鱼苗浸泡30分钟，得到较好的免疫保护效果。10_4稀释度的VP5/VP7蛋白复合物制剂保护率可达90%，10_5稀释度的保护率在80%以上。表明采用稀释度为10 —4或10 —5基因工程VP5/VP7蛋白复合物制剂对草鱼鱼苗进行浸泡处理后，可达到有效地防治草鱼出血病的效果。上述实施例中，采用sf9昆虫细胞系增殖重组的GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7的重组杆状病毒(vAcGCRV-VP5/VP7)，其构建方法主要是通过RT — PCR扩增，分别得到2条编码GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7基因的特异片段；通过基因克隆筛选获得插入了 GCRV VP5 与VP7基因的重组pFastBacdual双表达载体pin3DGCRV-VP5/VP7 ；将筛选得到的重组双表达载体转化DHlOBac细胞，得到转座的AcGCRV-VP5/VP7 Bacmid ；并将其转染Sf9昆虫细胞， 在Sf9昆虫细胞中获得重组病毒vAcGCRV-VP5/VP7。所述vAcGCRV-VP5/VP7，其具体构建方法参见“表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆状病毒及其构建”专利文献(专利号200710168642. 2)。
权利要求
1.一种草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制备方法，其特征是包括以下步骤(1)采用Sf9昆虫细胞系增殖重组的GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7的重组杆状病毒 vAcGCRV-VP5/VP7 ；(2)收集重组杆状病毒感染的细胞，采用离心沉淀法，去上清，得到感染重组病毒的sf9 细胞；(3)在离心沉淀中加入由表面活性剂Triton-X-IOO及蛋白酶抑制剂PMSF的PBS组成的细胞裂解液，经冰浴与冻融，得到裂解的重组病毒细胞悬液；(4)采用蔗糖衬离心法，对重组病毒细胞悬液进行纯化；(5)用PBS缓冲液稀释纯化VP5和VP7蛋白复合物，制成草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制剂。
2.根据权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制备方法，其特征是对感染重组病毒的sf9细胞的裂解方法包括以下步骤(1)收集重组病毒感染72h的sf9细胞，低速离心沉淀细胞，以除去培养液上清；用PBS 缓冲液冲洗细胞3次，去除牛血清蛋白组分；(2)在低速离心的细胞沉淀中加入3倍体积的细胞裂解液，充分混勻后，冰浴30min；(3)冻融处理细胞，即置超低温-80°C冰箱冷冻及37°C水浴中快速溶解冷冻的细胞；(4)重复2-3次冻融步骤，得到裂解的重组病毒细胞悬液。
3.根据权利要求2所述的草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制备方法，其特征是PBS缓冲液由 137 mM NaCl,2. 7 mM KC1、8. 1 mM Na2HPO4 和 1. 5 mM KH2PO4 构成，pH 7. 5。
4.根据权利要求2所述的草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制备方法，其特征是细胞裂解液由体积浓度为0. 5%Triton-X-100及ImMPMSF的PSB溶液组成。
5.根据权利要求2所述的草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制备方法，其特征是采用速度为8000r/min，离心20分钟沉淀细胞。
6.根据权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制备方法，其特征是对裂解的细胞悬液进行纯化的方法是(1)将细胞裂解液加入离心的沉淀的细胞中，将该混合液冰浴30分钟后，置-60°C 至_80°C超低温冰箱冷冻；将冻融3次的重组病毒细胞悬液，以8000r/min低速离心30分钟，除去游离细胞碎片；(2)将除去细胞碎片的悬液加入到占1/3体积含30%的蔗糖衬溶液的离心管中，然后以 28000r/min超速离心池，离心沉淀物为体外表达的VP5和VP7蛋白复合物；(3)将纯化的体外表达VP5和VP7蛋白复合物按1 10倍体积溶于PBS中，于_20°C保存备用。
7.根据权利要求6所述的草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制备方法，其特征是采用紫外分光光度计测定纯化后的体外表达VP5和VP7蛋白复合物的含量，用PBS缓冲液稀释定量， 制成终浓度为lmg/ml的草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制剂。
全文摘要
本发明提供了一种草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制备方法，其步骤包括采用sf9昆虫细胞增殖重组GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7的重组杆状病毒(vAcGCRV-VP5/VP7)；经冻融裂解重组病毒感染的sf9细胞，采用蔗糖衬离心法分离重组蛋白组分，由此得到纯化的体外表达VP5和VP7蛋白复合物；通过将纯化的VP5和VP7蛋白进行鱼体保护实验，证实其具有良好的免疫保护作用。本发明制备的GCRV基因工程疫苗不仅具有良好的稳定性和免疫原性，而且对草鱼鱼苗具有良好的免疫保护作用，其免疫保护率达到90%，适于疫苗规模化大批量生产和应用。
文档编号A61P31/14GK102266555SQ20111018990
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月8日 优先权日2011年7月8日
发明者丁清泉, 孙小云, 方勤, 邵玲 申请人:中国科学院武汉病毒研究所