专利名称：一种富集自体干细胞的脂肪组织隆胸材料的制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，特别涉及一种富集自体干细胞的脂肪组织隆胸材料的制备方法。背景技术：
隆乳术或丰乳术(mammary augumentation)是整形外科最常见的一项美容手术，于20 世纪初诞生以来，填充材料就成为了焦点问题，先后尝试过许多隆乳材料，例如石腊、硅凝胶、盐水、自体真皮脂肪瓣等等，然而，长期的医疗实践证明，所有类型的组织替代品多多少少有一些不适感及并发症(包括挛缩，变形、变硬、渗漏)，这给求医者和医生们带来很大的困惑。所以，在70年代末有人开始尝试在真皮脂肪瓣移植隆胸的基础上利用自体脂肪组织隆胸，自体脂肪隆胸是将身体腰、腹、臀、腿等脂肪较丰厚的部位的脂肪颗粒移植到胸部的一种隆胸术。手术将隆胸者本身的多余脂肪用细针吸出，活化处理成纯净脂肪颗粒，通过微型管针分条理均勻注入隆乳区使之成活；不开刀、不出血，丰胸成效真实自然，同时又达到了减肥塑身，具有减肥丰胸的效果。尤其是近几年，随着脂肪抽吸术的日益成熟，利用自体脂肪颗粒注射隆胸迅速发展起来，成为目前最热门的丰胸方法之一。但是目前脂肪填充后液化吸收率太高，可以达70%以上，成活率较低(低于40%)，要想达到持久丰满的效果必须选用“少量多次”的办法，给求医者和医生们带来了极大地麻烦。脂肪组织的主要组成部分有脂肪细胞，脂肪基质细胞(ASC)，血管内皮细胞，外膜细胞。脂肪基质细胞(ASC)被看作是脂肪组织专属祖细胞，即生脂祖细胞和血管源祖细胞， 有些脂肪基质细胞能够分化成多种细胞，而被称为脂肪源干细胞。脂肪基质细胞对于脂肪组织运转发挥重要作用，(脂肪组织大约每2-10年循环一次)，并为下一代提供细胞。但是抽脂得到的主要是脂肪组织的零散成分，研究表明，抽脂术获得脂肪组织含有的脂肪基质细胞数量仅是完整脂肪组织含量的一半，比起完整脂肪组织，吸脂所得脂肪组织是一种干细胞源性差的脂肪组织，而脂肪移植后，从微观环境看，在组织修复的急性期，损伤有关的增长因素和炎症有关细胞活素和化学增活素会影响脂肪基质细胞(ASC)的表现。脂肪移植将经历脂肪细胞和毛细血管重组。脂肪基质细胞(ASC)是修复脂肪组织中的主要作用力量。如果吸入脂肪组织中脂肪基质细胞(ASC)相对不足，会影响替换过程，导致术后植入脂肪萎缩。这也是目前单纯脂肪颗粒移植隆胸效果不能持久的原因所在，因此要想获得持久的隆胸效果，必须向祖细胞不足的吸入脂肪组织增补脂肪基质细胞(ASC)或脂肪干细胞的数量，以提高移植脂肪的存活率。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种持久性强、隆胸效果好的富集自体干细胞的脂肪组织隆胸材料的制备方法。本发明是通过如下技术方案实现的
一种富集自体干细胞的脂肪组织隆胸材料的制备方法，主要包括如下步骤 (1)从病患身上微创抽取脂肪组织，GMP实验室内经过分离提取、纯化、检测、扩增等步骤，获得高数量的干细胞；(2)全麻，用插管和负压抽脂机抽取脂肪组织；
(3)取一半脂肪组织离心，分离脂肪吸入物，得到移植脂肪组织，并置于无菌容器内冰浴保存；
(4)取另一半脂肪组织离心分离脂肪部分和液体部分，然后分别用酶消化法和梯度离心法分离其中的SVF，并计数测活度；
(5)将扩增好的脂肪干细胞添加到新制备好的SVF中，按107100ml脂肪的比例添加， 最后将SVF和移植脂肪组织混勻。所述病患为体重指数大于15的十几岁到七十多岁的健康人群，其中，身上少脂肪的运动员除外。本发明的填充材料主要由自体脂肪组织和脂肪来源的基质血管成分SVF (stroma vascular fraction)组成，该技术简称细胞辅助式脂肪移植CELL-ASSISTED LIP0TRANSFER (CAL)。SVF是一个细胞混合体，也包括了基质细胞，高浓度的脂肪干细胞，血管内皮细胞、 白细胞和红细胞等血细胞。该技术的关键在于加入了含有高浓度的脂肪干细胞的SVF成分 。隆胸时抽的脂肪分两部分，一部分经过无菌处理后低温保存用于移植，另一部分在GMP实验室通过特异的SVF分离技术制备SVF细胞群并与制备好的脂肪混勻用于移植。SVF能保持脂肪组织细胞的丰富，其中的各种细胞能够促进周围环境的的生长因子如PDGF，EGF, FGF, VEGF, IGF等分泌，从而进一步促进血管新生作用，在短时间内为移植的脂肪提供血液和养分，提高了祖细胞和脂肪组织的存活率；另一方面，SVF具有免疫调节的作用，能够降低炎症反应，为移植的脂肪存活提供了一个适宜的环境。为了提高脂肪干细胞的浓度，我们首先从病号仅抽取5ml组织，经过分离、纯化、 及体外培养扩增得到高数量的脂肪干细胞，最后添加到新制备的SVF成分中，与脂肪组织混勻用于隆胸移植。本发明的更优方案为
步骤(1)中，微创抽取脂肪组织的量为5ml。步骤(3)中，脂肪组织以500G的速度离心5min。步骤(4)中，脂肪组织以300G的速度离心5min。本发明通过预先抽取微量的脂肪组织并获得大量的脂肪干细胞，这样就可以减少脂肪移植时用于制备SVF脂肪组织的用量，以弥补大量女性因体重指数偏低(目前小于17 的无法自体脂肪隆胸)而无法获得大量的脂肪组织来制备SVF而不能进行自体脂肪隆胸的弊端。
具体实施方式
实施例
1.病号的选择体重指数大于15的从十几岁到七十多岁的健康人群(身上少脂肪的运动员除外)，抽脂前一个月内必须做全面体检，包括心、肺、肝及肾功能，血常规，凝血四项等。同时，那些想一次大量增大(达到200至400毫升)的人不宜入选，因为一次疗程的注射限定在100至200毫升。2.脂肪干细胞的体外扩增
(1)微创抽脂，注射利多卡因小面积的局部麻醉，利用微型吸引针无菌抽取患者5ml脂肪组织；
(2)脂肪间充质干细胞的提取采用磷酸盐缓冲液浸泡，1500r/min离心洗涤脂肪至， 用0. 1% I型胶原酶37°C水浴消化约30min，加磷酸缓冲液稀释胶原酶并离心，悬浮下层沉淀，100目滤网过滤，1500r/m离心lOmin，以去除悬浮的脂肪细胞及脂滴，弃上清液，随后进行体外培养，培养体系为STEMPRO MSC SFM无血清培养基，含有2mM/ml的谷氨酰胺和 100U/ml的青-链霉素。2周可获得IO8 — IO9细胞。3.抽脂
用配有0. 001%肾上腺素的盐水溶液进行全身麻醉，等药渗透到取脂部位，用内径为 2. 5毫米的插管和负压吸脂机吸取脂肪组织。共抽取800到1000毫升脂肪组织。4.移植材料的制备
(1)移植脂肪组织的制备取一半抽取物以300G的速度离心5min分离抽脂组织，分别获得上层分离脂肪部分(PLA)和液体部分(LAF)，分离后的脂肪组织(PLA)放到无菌容器内冰浴保存；液体部分(LAF)分离其中SVF.
(2)SVF的制备取一半(约500ML左右)脂肪组织，以500G的速度离心5mim，分离脂肪部分(PLA)和液体部分(LAF)，然后分别采用不同的方法步骤分离其中的SVF。PLA 部分
①用I-型胶原酶37摄氏度水浴消化30分钟，并不断摇晃。吉村的文章用的胶原酶浓度为0. 075%的胶原酶
②800g离心10分钟，未消化的组织碎片和成熟的脂肪细胞会处于离心管的上层，SVF 处于离心管的底部。③以上离心后的底部细胞团用红细胞裂解液重悬，室温作用5min;
④用100μ m的一次性细胞筛网过滤以去除其中的组织碎片和杂质获取单细胞
⑤用DMEM重悬细胞，以300G离心5分钟，重复3次。LAF 部分
①400g离心10分钟，SVF处于离心管的底部；
②以上离心后的底部细胞团用红细胞裂解液重悬，室温作用5min；
③用100μ m的一次性细胞筛网过滤以去除其中的组织碎片和杂质获取单细胞
④用DMEM重悬细胞，以300G离心5分钟，重复3次。(3)完整CAL移植物的准备首先将扩增好的脂肪干细胞添加到新制备好的SVF 中，按107100ml脂肪的比例添加，最后将SVF和移植的脂肪组织混勻。
权利要求
1.一种富集自体干细胞的脂肪组织隆胸材料的制备方法，其特征为，主要包括如下步骤(1)从病患身上微创抽取脂肪组织，GMP实验室内经过分离提取、纯化、检测、扩增等步骤，获得高数量的干细胞；(2)全麻，用插管和负压抽脂机抽取脂肪组织；(3)取一半脂肪组织离心，分离脂肪吸入物，得到移植脂肪组织，并置于无菌容器内冰浴保存；(4)取另一半脂肪组织离心分离脂肪部分和液体部分，然后分别用酶消化法和梯度离心法分离其中的SVF，并计数测活度；(5)将扩增好的脂肪干细胞添加到新制备好的SVF中，按107100ml脂肪的比例添加， 最后将SVF和移植脂肪组织混勻。
2.根据权利要求1所述的富集自体干细胞的脂肪组织隆胸材料的制备方法，其特征在于所述病患为体重指数大于15的十几岁到七十多岁的健康人群，其中，身上少脂肪的运动员除外。
3.根据权利要求1或2所述的富集自体干细胞的脂肪组织隆胸材料的制备方法，其特征在于步骤(1)中，微创抽取脂肪组织的量为5ml。
4.根据权利要求1或2所述的富集自体干细胞的脂肪组织隆胸材料的制备方法，其特征在于步骤(3)中，脂肪组织以500G的速度离心5min。
5.根据权利要求1或2所述的富集自体干细胞的脂肪组织隆胸材料的制备方法，其特征在于步骤(4)中，脂肪组织以300G的速度离心5min。
全文摘要
本发明属于生物医学领域，特别公开了一种富集自体干细胞的脂肪组织隆胸材料的制备方法。本发明首先从病号仅抽取5ml组织，经过分离、纯化、及体外培养扩增得到高数量的脂肪干细胞，最后添加到新制备的SVF成分中，与脂肪组织混匀用于隆胸移植。本发明可以减少脂肪移植时用于制备SVF脂肪组织的用量，以弥补大量女性因体重指数偏低而无法获得大量的脂肪组织来制备SVF而不能进行自体脂肪隆胸的弊端。
文档编号A61L27/38GK102258810SQ201110203210
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者孙理兰, 张慧慧, 李荣荣, 王泰华 申请人:王泰华