专利名称：一种玉米须总黄酮的提取与纯化方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种从玉米须提取高含量药物成分的工艺，具体的说是涉及从禾本科玉蜀属植物玉米的花柱和柱头即玉米须中提取纯化降血脂物质黄酮的生产工艺。
背景技术：
玉米须(Stigma maydis)为禾本科玉蜀属植物玉米(Zea mays L.)的花柱和柱头。 它含有多种化学成分，如挥发油、皂苷、生物碱、类总黄酮、多聚戊糖、尿囊素、有机酸等。其味淡、性平，有利尿、泻热、平肝、利胆之功效，可用于治疗肾炎、胆结石、糖尿病、黄疸、麻疹、 乳糜血尿、血蹦等症。现代药理研究证明玉米须有显著的利尿[、降血糖、降压、抑菌、增强免疫、抗癌等功效。而且玉米须总黄酮是一类高效低毒的天然抗氧化剂，因此其成为研究和开发利用的热点，任顺成等的研究证明，玉米须总黄酮对脂质体发生的过氧化有明显的抑制能力。玉米须是我国传统的中药材，全国各地均广泛栽培玉米，因此，作为玉米副产物的玉米须资源十分丰富，但对它的开发利用非常有限，仅少量入药外，大部分被白白丢弃。玉米须既有明显的药理价值，又具备一定的食疗特征，进行工业化开发利用前景相当广阔。当前对玉米须的临床及应用效果研究较多，但对其活性成分研究极少。黄酮类化合物(flavonoid)泛指2个具有酚羟基的苯环通过中央3碳原子相互连接而成的化合物，是在植物中分布非常广泛的一类天然产物，其在植物体内大部分与糖结合成苷类，有一部分是以游离态(苷元)形式存在的。根据中央三碳链的氧化程度、B-环连接位置(2-或3-位)以及三碳链是否构成环状等特点，可将主要天然黄酮类化合物分类为黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、花色素、黄烷二醇、双苯吡酮、异黄酮、二氢异黄酮、查耳酮、二氢查耳酮、橙酮、高异黄酮等10余类化合物。根据任顺成等、张慧恩等的研究，玉米须中的黄酮主要有刺芒柄花素(7-羟基-4' 2-甲氧基异黄酮)(1)，2" -Ο-α-L-鼠李糖基-6-C-(3-脱氧葡萄糖基)-3'-甲氧基木犀草素(II)， 2 “ -0- α -L-鼠李糖基-6-C- (6-脱氧-ax_5-甲基-木-己_4_羰基)_3 ‘-甲氧基木犀草素(III)，7，4' - 二羟基-3'-甲氧基黄酮-2〃 -O-a-L-O鼠李糖基-6-C-岩藻糖苷 (IV),7,4' - 二羟基-3'-甲氧基黄酮-2〃 -Ο-α-L-鼠李糖基-6-C-岩藻糖苷(V)和6， 4' - 二羟基-3'，5' - 二甲氧基黄酮-7-0-葡萄糖苷(VI)等。对于玉米须，总黄酮含量相对较低，若直接采用超临界流体萃取技术，消耗流体会很多，从经济效益来看非常不合算，所以富集分离总黄酮的方法主要有有机溶剂萃取法和树脂吸附分离法。由于有机溶剂萃取法存在溶剂残留和生产成本高的缺点，而大孔吸附树脂由于它具有物理化学稳定性高，吸附选择性强，富集效果好，解吸条件温和，再生简便，使用周期长等特点，因此，近些年来，树脂吸附法得到了长足的发展，广泛应用于天然产物的分离纯化。
发明内容
本发明是为了避免现有技术存在的不足之处，旨在提供一种从玉米须中提取及纯化总黄酮的方法。本发明玉米须总黄酮的提取与纯化方法，以玉米须为原料，包括原料粉碎、浸提、 浓缩、纯化步骤，其特征在于所述浸提步骤中，浸提液是体积浓度为55-65%的乙醇溶液， 浸提是在温度为60-80°C、密闭条件下浸提2-4小时，浸提料液质量百分比为1 20。本发明所述纯化步骤中使用HPD-100大孔树脂对黄酮粗提取液进行初步纯化粗提液。本发明的另一目的是提供玉米须总黄酮在降血脂药物中的应用。与已有技术相比，本发明有益效果具体体现在本发明首先从玉米须中提取了总黄酮，浓缩配制成不同浓度的总黄酮初提液，然后选择了 HPD-100吸附树脂，进行梯度洗脱等吸附与解吸实验来确定HPD-100的最佳吸附分离条件。最佳提取条件为提取60°C，提取时间3小时，乙醇浓度60%，料液比1 20。 其中温度是首要因素。大孔吸附树脂HPD-100对玉米须总黄酮的最佳吸附条件是提取液总黄酮含量为0. 43 0. 54mg/mL, pH为提取原液3. 7，上样流速为1. 5mg/min。本发明利用HPD-100型大孔树脂提取纯化黄酮，使黄酮的纯度由约5. 6%提高到了 60%以上，提取和纯化效率较高。本发明采用了大孔树脂吸附分离技术和乙醇洗脱技术， 大大提高了黄酮的提取量，该工艺操作更加简单易于控制条件，成本低，树脂可反复利用， 更适合工业生产。本发明可以开拓农副产品的综合利用，带动农村经济的繁荣，本发明对玉米须总黄酮进行研究为对玉米须更好地开发利用，为其临床疗效的依据奠定基础。
图1是本发明具体实施方式
中家兔生长曲线图。以下通过具体实施方式
对本发明做进一步说明。
具体实施例方式1)玉米须的获取从安徽毫州华佗镇一玉米种植农田采摘(玉米植株生长至成熟期，玉米须为棕褐色，含水量约为20% )，将采摘回的玉米须于70°C烘箱中烘6小时，使其失去游离水，一周内使用；或102°C烘10小时，除结合水，待长期使用。2)树脂的预处理用浓度为50-60%的乙醇充分浸泡，乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊，去离子水洗尽醇，最后用5% HCl溶液浸泡池，去离子水洗至pH值为中性，接着用5% NaOH溶液浸泡3h，去离子水洗至pH值为中性。3)黄酮的提取过程用天平称取20g玉米须，倒入IL的烧杯内，加体积浓度60%乙醇溶液400mL，即料液比为Ig 20mL，充分浸泡数小时后放入水浴锅60°C下浸提2-4h (加入乙醇后要注意密封，防止乙醇挥发，影响提取效率)，将浸提液倒入IL烧杯，在可调式电炉上浓缩，浓缩至 200mL加去离子水400mL继续浓缩，至200mL再加去离子水400mL，直到浓缩至IOOmL且无醇味。冷却后将浓缩液装入离心管离心，5000r/min，离心Ih后取出，将上清液倒入广口瓶加适量去离子水稀释盖上玻璃塞放入冰箱。依此方法数次提取足够量提取物以备用。4)标准曲线的绘制精密称取5. 6mg芦丁标准品(含量91.7% )，定容至50ml容量品中。配制成0. 102704mg/ml芦丁对照品溶液。分别取芦丁对照品溶液0. 0，1. 0，2. 0，3. 0，4. 0， 6. Oml于25ml容量瓶中，用0. lmol/L三氯化铝乙醇溶液定容至25ml，混勻，IOmin后于 400nm波长处测定吸光度，三氯化铝乙醇溶液为空白参比，制标准曲线，得回归方程Y = 0.03040X+0. 00097，r = 0. 99986。5)含量的测定取玉米须黄酮供试液于50ml容量瓶中，用0. lmol/L三氯化铝乙醇溶液定容至 50ml，混勻，IOmin后于400nm波长处测定吸光度(仪器名称722S分光光度计，生产厂家 上海精密科学仪器有限公司制造)，三氯化铝乙醇溶液为空白参比。6)玉米须总黄酮的纯化①装柱使用缓冲液将树脂调至指定pH(中性)后，利用漏斗将预处理好的树脂装入(IX 20) cm玻璃层析柱中，柱床体积为15. 5mL。装柱要让树脂随着缓冲液慢慢沉下，柱床应该紧实不能有气泡。②上样利用恒流泵将玉米须总黄酮提取液(上样液浓度0. 43 0. 54mg/mL)上柱，控制一定流速(1.5mL/min)③收集定容分步收集(5mL/管)，用微型移液器取出ImL流出液，用0. lmol/L三氯化铝乙醇溶液定容到50mL。④测吸光度反应10分钟后400nm处测出吸光度。⑤吸附量的计算当流出液吸光度达上样液的1/10时，停止上样，将接到的流出液倒入量筒，量得流出液体积，计算吸附量。(吸附量=上样液浓度(mg/mL) X流出液体积 (mL))⑥解吸使用3倍柱床体积(40mL)的75%的乙醇溶液进行解吸，同样控制一定流速，分步收集洗脱液主段(5mL/管)。⑦黄酮含量的测定用氯化铝显色法测定每个收集管内洗脱液的总黄酮含量，得到洗脱曲线。(解吸率=洗脱液体积(mL) X洗脱液浓度(mg/mL)/吸附量)⑧黄酮纯度测定分别蒸干上样浓缩物与主段，称取重量。(黄酮纯度=黄酮总量 (mg)/干燥物重量(mg) X 100% )所有不同条件下的吸附和解吸实验都做两个平行，这样可以减少实验误差。树脂除了吸附目标物外，还会吸附杂质，而这些杂质会污染树脂，所以每次使用后，树脂必须再生。每次层析后，将树脂倒出，用95%乙醇冲洗数次，待颜色较浅后加95% 乙醇浸泡数小时，再用去离子水将醇洗净，最后用缓冲液调至一定PH后即可再次使用。(树脂可以反复使用3到4次)本发明中所述料液比为Ig 20mL，最佳浸提温度为60°C，为实验节省了原材料和能源。采用HPD-100大孔树脂对粗黄酮进行精制，使黄酮的纯度有约5. 6%提高到了 60% 以上，提取和纯化效率较高。下面通过药学实验进一步验证玉米须黄酮对幼年家兔生长性能及血脂的影响。1.材料与方法
1. 1生长兔颗粒饲料配方及营养比原料配比(％)玉米20.0，小麦麸15.0，大豆粕5.0，花生仁饼11. 2，花生秧36.0， 苜蓿草粉10. 4，食盐0. 5，兔乐0. 7，球净1. 0,蛋氨酸0. 1，赖氨酸0. 1。配方营养(％)消化能9.M兆焦/千克，粗蛋白17. 46，粗纤维12.0，钙1.2，总磷0. 34，赖氨酸0. 71，蛋+胱氨酸0. 52。1. 2仪器与试剂1. 2. 1 仪器兔笼2个、食盆4个、烧杯(IOOOmL)、可调温电炉(1000W)、物理天平(感量 0. Olg)、玻棒、量筒(IOOOmL)、一次性注射器QmL) 6只、试管6个、AUP-1-35G-1型实验室级专用超纯化水机(颐洋企业发展有限公司)、DHG-9425A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)、DK-8AX型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)。1. 2. 2 试剂玉米须提取物(由上述方法提取获得，玉米须黄酮含量为0. )，纯水，消毒酒 Ib ο1. 3实验步骤1. 3. 1动物及分组家兔9只，体重300g 400g，普通颗粒饲料适应性饲养全部家兔一周后，选取体重值接近的6只随机分为2组，各组分别再饲养3周。分组前，家兔在毛色、眼神、进食、活动、粪便颜色及性状等一般情况均无明显差异。(1)对照组(3只)每日饲喂普通颗粒饲料；( 黄酮组(3只)每日饲喂含玉米须黄酮0.2%的普通颗粒饲料(饲料混勻采用逐渐扩大，充分混勻，反复过筛，烘干的方法)。调整幼兔饲喂颗粒饲料为每组100g。兔子均在同一生长条件下自由采食与饮水。1. 3. 2兔子体重及生长观察每日观察两组家兔精神与进食情况，每周定时称重一次(清晨8点，空腹)。根据公式生长速度(平均日增重)=统计期内肉兔增重(克)/统计期内饲养日期(天)料肉比=肥育期中消耗的饲料量/肥育期中的总增重转化率(<% )=总增重/总消耗饲料量X 100%肝肾称量，得数据。1. 3. 3血脂测定分别在实验第一周末和第四周末耳中动脉采血。采血前家兔禁食12h，禁水6h。取血2mL。标本送至武警安徽省总队医院检验科检测(血脂检测仪，型号NF42M2675，生产厂家南京丰达医疗仪器有限责任公司)。统计学处理采用SAS统计学软件，进行方差分析。2结果与分析2. 1黄酮对家兔生长性能的影响2. 1. 1肉眼观察黄酮组兔子表现活跃，静伏时间较短；食欲旺盛。越是到实验后期，和对照组差异愈发明显，对照组静伏时间长，活动不积极，食欲正常，有明显的满足感。其它未见任何不良反应。2. 1.2家兔体重比较表1各组每周体重比较(g)
权利要求
1.一种玉米须总黄酮的提取与纯化方法，以玉米须为原料，包括原料粉碎、浸提、浓缩、 纯化步骤，其特征在于所述浸提步骤中，浸提液是体积浓度为55-65%的乙醇溶液，浸提是在温度为60-80°C、密闭条件下浸提2-4小时，浸提料液质量百分比为1 20。
2.根据权利要求1所述的一种降血脂玉米须总黄酮的提取与纯化方法，其特征在于 所述纯化步骤中使用HPD-100大孔树脂对总黄酮粗提取液进行初步纯化。
3.如权利要求1所述的玉米须总黄酮在降血脂药物中的的应用。
全文摘要
本发明涉及一种玉米须总黄酮的提取与纯化方法及其应用。本发明以玉米须为原料，包括原料剪碎、浸提、浓缩、纯化步骤，其特征在于所述浸提是指在浓度为60％的乙醇溶液中温度为60℃条件下提取时间3小时，料液比1∶20；所述纯化是指用HPD-100大孔树脂纯化粗提取液，在家兔饲料中按照2％添加量饲喂家兔，取得了显著(P≤0.1)的降血脂效果。该方法操作简单，成本低，适于实际生产操作。可以开拓农副产品的综合利用，带动农村经济的繁荣，本发明对玉米须总黄酮进行研究为对玉米须更好地开发利用，为其临床疗效的依据奠定基础。
文档编号A61P3/06GK102309694SQ20111025155
公开日2012年1月11日 申请日期2011年8月29日 优先权日2011年8月29日
发明者徐双贵, 王在贵, 陈佳佳 申请人:安徽万士生物制药有限公司, 安徽农业大学