专利名称：一种从怀菊花中提取总黄酮有效部位的方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及一种从怀菊花中提取总黄酮有效部位的方法及用途，具体涉及从怀菊花全形花中提取总黄酮有效部位的方法及其有效部位在制备治疗或预防过敏性鼻炎、皮炎及哮喘等过敏性疾病的药物中的应用。
背景技术：
现在生活节奏加快、工作压力和精神压力的增加使人们易疲劳、体质下降、易患多种季节性流行疾病。由于全球气候变暖，使得空气中花粉数有所增加。这些都使人们容易受到过敏原的困扰，导致支气管炎、过敏性鼻炎、花粉症等过敏性疾病的发病率逐年上升，对人们的健康造成了威胁，也影响人们的工作和生活。在美国，每一百人当中就有两个以上的人患花粉症，而日本有超过10%的人在每年4-6月深受花粉症困扰，我国发病率为0. 5-1%， 并表现出逐年上升的趋势。同时，随着工业化生产的加剧和汽车数量的增加，使大气污染更加严重，空气中粉尘和有害物质增多也加重了过敏反应的诱因，如汽车尾气中汽油燃烧的气体粒子能刺激机体分泌IgE增加，会增强机体再受刺激时的过敏反应。由于有机物燃烧释放的硫氧化物、氮氧化物和亚硫酸等气体能损伤呼吸道粘膜，加重过敏症状。室内装修使用材料释放的挥发性有机污染物可引起化学污染，空气不流通所蓄积的悬浮颗粒、尘螨、霉菌、细菌、孢子等都是可刺激机体的变应原。研究人员对1996-2003年在广州医院就诊的过敏性疾病患者血清中特异性IgE进行研究，结果表明婴幼儿以牛奶、鸡蛋白为主要致敏原，尘螨的阳性反应率仅次。随着年龄的增长，过敏性疾病主要致敏原是吸入性抗原，以屋尘螨、粉尘满、屋尘等为主，中老年患者对飞蛾过敏或寄生虫更加敏感。钟南山等对儿童哮喘及其他过敏性疾病进行国际间对比研究，结果表明广州市13-14岁青少年哮喘及过敏性鼻炎，湿疹患病率均较7 年前高，且以男性上升明显。另外，吸烟和高水平的IgE都可能增加花粉过敏的诱导几率， 建筑群的分布、人群活动密集度等因素在客观上也会影响过敏反应发病率。根据世界卫生组织(WHO)的数据，目前全球有2. 5亿人患过敏性疾病，且该发病率迅猛上升。我国卫生专家指出我国小儿过敏发病率有上升的趋势，过敏性鼻炎发病率也呈上升趋势。菊花以“鞠华”之名始载于《神农本草经》，为疏风散热、解毒消肿、利咽明目之上品。《本草纲目》所述菊花性甘、味寒。《本草经疏》称其“苦可泻热，甘能益血，甘可解毒，平则兼辛，故也散结，苦入心，小肠，甘入脾胃，平辛走肝胆，兼入肺与大肠，苦以泻热，甘以宜血脉，辛平以散虚热也”。2005年版《中国药典》规定了中药菊花为菊科植物菊Chiysanthemum morifolium Ramat的干燥头状花序。古典本草中有应用菊花治疗过敏症状的记载，临床研究指出菊花对眼睛红肿和瘙痒等过敏症的治疗和防治具有一定效果。对菊花同属植物西伯利亚菊花抗过敏活性的研究表明，其乙醇提取物对RBL-2H3肥大细胞脱颗粒反应有明显抑制作用，对二硝基苯基化牛血清白蛋白(DNP-BSA)和compound 48/80诱导的RBL-2H3肥大细胞脱颗粒有抑制作用，还能够抑制肿瘤坏死因子及细胞外调节蛋白激酶ERK1/2的活化。菊花中多种黄酮类化合物也显示了很强的抗过敏活性，如芹菜素、木犀草素、香叶木素、漆树黄素和槲皮素对免疫球蛋白E介导RBL-2H3细胞产生肿瘤坏死因子a (TNF_a)和白细胞介素4 (IL-4)有抑制作用。由此可见，菊花中有抗过敏活性的成分可能是黄酮类成分。本研究室的研究表明，作为药用菊花代表的怀菊花具有显著地抗过敏活性，并且也对怀菊花有机酸成分群和总黄酮有效部位抗过敏活性进行了研究，结果表明，总黄酮有效部位在抗过敏活性方面表型突出。但目前未见以菊花全形花总黄酮含量大于50%的总黄酮有效部位为主要原料治疗或预防异位性皮炎、过敏性鼻炎等过敏性疾病的口服制剂上市。
发明内容
本发明目的在于提供了一种从怀菊花全形花中提取总黄酮有效部位的方法，此方法易行，操作简便，成本低廉，有效部位中黄酮成分提取率较高。在有效部位中总黄酮的含量为 50-70%。本发明的另一个目的在于提供提取的总黄酮有效部位在制备治疗或预防异位性皮炎、过敏性鼻炎等过敏性疾病的药物中的应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的
一种从怀菊花中提取总黄酮有效部位的方法，其提取步骤如下
a.在怀菊花中加入醇浓度为20%含水醇溶液，经热回流、超声提取，含水醇溶液用量为怀菊花重量的8-20倍，滤过，合并滤液，减压回收至无醇味，得到怀菊花浓缩提取液；
b.在怀菊花浓缩提取液中加入怀菊花重量4-10倍的水或醇溶液，溶液中醇浓度为 10-30%，滤过，得滤液；
c.滤液经填充有吸附材料的吸附柱，选用的吸附材料为大孔吸附树脂中的任一种或两种并用；
d.洗脱前，选用体积为吸附材料4 8倍的水或20-40%的醇依次淋洗吸附柱至流出液为无色；
e.用含40%-80%的醇溶液洗脱，洗脱液用量为吸附材料的4 10倍，收集洗脱液；
f.减压回收溶剂，至无醇味，得到洗脱液浓缩液；
g.洗脱液浓缩液经填充有吸附材料的吸附柱，选用的吸附材料为大孔吸附树脂中的任一种或两种并用；
h.洗脱前，选用体积为吸附材料4 8倍的水或20-40%的醇依次淋洗吸附柱至流出液为无色；
i.用含40-80%的醇溶液洗脱，洗脱液用量为吸附材料的4 10倍，收集洗脱液；
j.减压回收溶剂，得稠膏，稠膏经干燥后得怀菊花总黄酮有效部位。总黄酮含量为 50%-70%。经所得总黄酮有效部位的干膏采用常规粉碎或固体分散技术或超微粉碎，得不同粒径粉末。本发明中的怀菊花优选其全形花。 所述的醇溶液中所用的醇优选为乙醇或甲醇中的一种。所述大孔树脂的型号为 AB-8、SP-70、DlOl、DM-130, S_8、D3520、D4020、HP-20 其中的一种。
本发明中所制备的怀菊花全形花总黄酮有效部位，加入适量的辅料或基质(如淀粉、糊精、微晶纤维素、乳糖、低取代羟丙纤维素、辛基十二烷醇、甘露醇等)，制备成用于治疗或预防异位性皮炎、过敏性鼻炎等过敏性疾病的口服制剂，包括片剂(素片、糖衣片、薄膜衣片、分散片)、胶囊剂(硬胶囊、软胶囊)、颗粒剂和滴丸。本发明所制备的总黄酮有效部位的药效学研究
1、怀菊花提取物及各浓度大孔树脂洗脱部分对RBL-2H3细胞脱颗粒的抑制作用大鼠嗜碱粒细胞性白血病2H3细胞(RBL-2H3)细胞是NIDR于1978年从Wistar大鼠嗜碱性粒细胞瘤中分离和克隆出来的嗜碱性白血病细胞。这些细胞具有高亲和力的IgE受体。通过聚集这些受体或与钙离子载体作用下可以激活他们分泌组胺及其他递质。这株细胞广泛应用于研究Fc ε RI和肥大细胞分泌的生化途径。RBL-2H3细胞具有可继代培养，生长快速等特点，是研究速发型过敏反应的主要细胞系。a、RBL-2H3细胞的培养
RBL-2H3细胞接种于细胞培养皿中，用含质量分数10%胎牛血清的MEM培养基(含青霉素1000 KU · L—1和链霉素100 mg · L—1)混勻，在37°C、体积分数为5% CO2的条件下传代培养，2-3天换一次液。取处于对数生长期状态良好的RBL-2H3细胞，弃去上清液，用PBS 轻轻洗去残余细胞上清液后，加入适量的0. 02% EDTA和0. 25%胰酶消化2-3 min，加入完全培养基终止消化，吹打混勻。1000 rpm离心5 min，弃去上清液，用完全培养基重新悬浮细胞，计数。b、怀菊提取物及不同洗脱流份抑制RBL-2H3细胞脱颗粒反应活性部位筛选取生长状态良好的RBL-2H3细胞，以2X IO8化―1密度接种在M孔板上，每孔400 μ L，
分成6组正常细胞组、模型对照组、供试样品不同剂量组和全部释放组，每组设4个平行孔。在37°C、5% CO2的条件下培养1 h后，加经MEM培养基稀释的IgE抗体40 μ L(终浓度 0.45 mg/L)，培养M h，使细胞致敏。然后用Siraganian细胞培养液(在约900 mL超纯水中溶解如下试剂119 mM NaCl，5 mM KCl, 0. 4 mM MgCl2, 25 mM PIPES, 5. 6 mM glucose, 1 mM CaCl2,0. 1% BSA，40 mM NaOH，最后用1 M NaOH溶液调节pH为7. 2，加超纯水至1 L，过滤)清洗细胞2次，洗液全部吸净后，加入Siraganian培养液160 yL，37°C培养10 min后， 再加供试样品溶液20 μ L (DMS0终浓度均小于0. 1%)，正常细胞组、模型对照组和全部释放组中加等体积1% DMSO/Siraganian细胞培养液(v/v)，37°C培养10 min，最后向模型对照组和样品组中加溶解DNP-BSA抗原的Siraganian细胞培养液20 μ L (终浓度为10 mg/ L),正常细胞组和全部释放组加等体积的Siraganian细胞培养液，在培养箱中37°C培养10 min后，将M孔板置于冰浴中10 min终止反应。平行吸取各孔上清液(全部释放组使用前经超声破碎)两份，各50 μ L，转移至96 孔板中，一份加入溶解1 mM PNAG的枸橼酸缓冲液50 μ L (0. 1 Μ,ρΗ 4. 5)，另一份加等体积枸橼酸溶液作空白对照，37°C培养1 h后，加碳酸钠缓冲液200 μ L (0.1 Μ, pH 10.0)， 室温放置10 min，于酶联免疫检测仪405 nm下测定各孔光密度。计算对A -己糖胺酶活性抑制率，结果见表一。结果怀菊花75%乙醇提取物对抗原刺激RBL-2H3细胞脱颗粒反应具有一定抑制作用，IC5tl值为63 yg/mL。大孔树脂60%和95%乙醇洗脱流分中主要成分为黄酮类，它们的IC5tl值分别为6. 8 μ g/mL和16 μ g/mL,与75%乙醇提取物比较，力价分别提高了约10倍和4倍，60%乙醇洗脱流分活性较强。30%乙醇洗脱流分中主要成分为有机酸，其在终浓度100 μ g/mL时仍未表现出抑制作用。因此，富含黄酮类成分的大孔树脂60%和95%乙醇洗脱流分是怀菊提取物抗过敏活性部位。 表一怀菊花不同洗脱部分对RBL-2H3细胞释放β ~己糖胺酶的抑制作用
权利要求
1. 一种从怀菊花中提取总黄酮有效部位的方法，其特征是其提取步骤如下a.在怀菊花中加入醇浓度为20%含水醇溶液，经热回流、超声提取，含水醇溶液用量为怀菊花重量的8-20倍，滤过，合并滤液，减压回收至无醇味，得到怀菊花浓缩提取液；b.在怀菊花浓缩提取液中加入怀菊花重量4-10倍的水或醇溶液，溶液中醇浓度为 10-30%，滤过，得滤液；c.滤液经填充有吸附材料的吸附柱，选用的吸附材料为大孔吸附树脂中的任一种或两种并用；d.洗脱前，选用体积为吸附材料4 8倍的水或20-40%的醇依次淋洗吸附柱至流出液为无色；e.用含40%-80%的醇溶液洗脱，洗脱液用量为吸附材料的4 10倍，收集洗脱液；f.减压回收溶剂，至无醇味，得到洗脱液浓缩液；g.洗脱液浓缩液经填充有吸附材料的吸附柱，选用的吸附材料为大孔吸附树脂中的任一种或两种并用；h.洗脱前，选用体积为吸附材料4 8倍的水或20-40%的醇依次淋洗吸附柱至流出液为无色；i.用含40-80%的醇溶液洗脱，洗脱液用量为吸附材料的4 10倍，收集洗脱液；j.减压回收溶剂，得稠膏，稠膏经干燥后得怀菊花总黄酮有效部位。
2.根据权利要求1所述的一种从怀菊花中提取总黄酮有效部位的方法，其特征在于， 所述的怀菊花为其全形花。
3.根据权利要求1所述的一种从怀菊花中提取总黄酮有效部位的方法，其特征是所述的醇溶液中所用的醇为乙醇或甲醇中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种从怀菊花中提取总黄酮有效部位的方法，其特征是所述大孔树脂的型号为 SP-70、D101、AB-8、DM-130、S-8、D3520、D4020、HP-20 中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种从怀菊花中提取总黄酮有效部位的方法，其特征是所制备的总黄酮有效部位中总黄酮含量为50 70%。
6.根据权利要求1所述的一种从怀菊花中提取总黄酮有效部位的方法，其特征是提取的总黄酮有效部位可以与药学上可接受的载体或赋形剂结合制成片剂、胶囊、滴丸或颗粒剂。
7.权利要求1所述的怀菊花总黄酮有效部位在制备治疗或预防过敏性鼻炎、异位性皮炎及哮喘等过敏性疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，涉及一种从怀菊花中提取总黄酮有效部位的方法及用途。本发明通过提取、过滤、吸附、浓缩、再吸附等步骤制备有效部位，该方法不用有毒的有机溶剂，不污染环境，是在常规含水溶媒提取方法的基础上，采用了吸附材料的吸附分离技术，耗时少，效率高，提取工艺简单，成本低廉，可进行产业化生产，并达到了环保的要求。本发明提取的总黄酮有效部位在制备治疗或预防异位性皮炎、过敏性鼻炎等过敏性疾病的药物中的应用。
文档编号A61K36/287GK102293806SQ20111025800
公开日2011年12月28日 申请日期2011年9月2日 优先权日2011年9月2日
发明者张琳, 王岩, 王瑞杰, 袁丹, 谢媛媛 申请人:沈阳药科大学