专利名称：一种海肠废弃内脏中粗多糖的提取方法
技术领域：
本发明属于农业废弃物资源化利用领域，更具体地说，是涉及一种海肠废弃内脏中粗多糖的提取方法。
背景技术：
海肠学名单环刺螆⑴rechis imiconctus)，在分类上属于螆虫动物门、螆纲、无管螆目、刺螆科、刺螆属。主要分布于我国渤海、黄海，俄罗斯、朝鲜半岛、日本北海道和本州周围海区，是我国北方沿海一种特有的海洋无脊椎动物，具有较高的科学研究和经济价值。其中烟台市是北方海肠的主要产地和重要集散地。从营养角度看，海肠体壁组织的氨基酸组成与人体类似，且富含多种风味氨基酸， 被称为是“鲁菜之魂”，具有较高的营养价值。杨桂文等对烟台沿海的单环刺螆营养成分进行了分析，发现其含有丰富的蛋白质及微量元素，具有良好的营养保健价值(杨桂文， 安利国，孙忠军；《单环刺螆营养成分分析》；海洋科学；1999年第6期；P13-14)；李诺等对单环刺螆体壁的氨基酸组成和含量进行了分析，发现其含有8种人体必需氨基酸，含量达 17. 79 %，且组成模式与人体所需一致(李诺，宋淑莲，唐永政；《单环刺螆体壁氨基酸组分与含量的分析》；齐鲁渔业；2000年第17期；P^-28)。当前，海肠的利用价值还未被完全开发出来，大量海肠内脏作为废弃物弃置，不仅对环境造成污染，也造成了资源的浪费。孟祥欣等对烟台市售单环刺螆废弃内脏进行了营养成分分析，结果表明单环刺螆新鲜废弃内脏蛋白质含量为18. 25%，脂肪含量为0. 12%, 总糖含量为4. 09%，Ca为2. 10%，Mg为0. 41% Je为0. 32%，Si为0. 03%;对单环刺螆废弃内脏的脂肪酸分析发现EPA、DHA和DPA均较为丰富，分别占总脂肪酸的21. 61%、3. 67% 和56124%.由此提出单环刺螆废弃内脏具有很好的开发利用价值(孟祥欣，郭承华，董新伟，秦倩，周厚成，赵刚；《单环刺螆⑴rechis imicinctus)废弃内脏营养成分分析》;烟台大学学报(自然科学与工程版)；2008年第21卷第3期；P232-234)。多糖是一类广泛存在于动物、植物和微生物细胞中具有特殊活性的重要生物大分子物质。随着分子生物学研究的进展，人们逐渐发现不同来源的多糖具有广泛而复杂的生物活性，已经引起医药界高度重视，并成为当今生命科学研究的热点之一。多糖具有免疫调节作用、抗肿瘤作用、抗病毒作用、抗衰老作用、抗动脉粥样硬化作用、对物质代谢具有影响、抗溃疡作用、类肾上腺皮质激素和促肾上腺皮质激素作用以及对辐射损伤的保护等作用(杨小军，王筱霏，尹瑞卿，姚军虎；《功能性多糖与家禽肠道黏膜免疫调控的构效关系》； 动物营养学报；2011年第23卷第7期；P1089-1093)。目前已报道的研究方法主要集中于植物组织中多糖的提取。包括热水浸提、稀酸、 稀碱、酶法提取等。动物组织多糖成分的提取方法包括分级沉淀、透析、柱层析、超滤、制备性区域电泳等。由于动物多糖结构复杂，具有许多不同单糖残基、连接位置和糖昔键，能形成具有不同的构象，在分离制备时，应根据不同的动物来源采用不同的方法进行提取提取 (陈浩凡，潘仕荣，胡喻，石桂新；《动物多糖的分离纯化方法》；现代食品与药品杂志；2007年第17卷第3期；P9-12)。
发明内容
本发明就是针对上述问题，提供了一种操作简单、产率高、产品活性高的海肠废弃内脏中粗多糖的提取方法。为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案，以海肠废弃内脏为原料， 依次经过除杂、粉碎、脱脂、酶解、脱蛋白、沉淀、冷冻干燥后得到所述的粗多糖。所述的酶解过程采用风味酶进行消化酶解。具体步骤为⑴除杂、粉碎；(2)脱脂将绞粉碎后的内脏放置于体积比为1 1 2的丙酮和乙醚或石油醚混合液中浸泡过夜，料液比为1 2 4g/ml，接着在4 10°C下离心分离，离心速度为 12000 15000rpm，去除脂肪层；(3)烘干后得到干粉；(4)酶解将步骤(3)得到的干粉按照料液比1 5 10g/ml溶解在pH = 6. O 7. O的磷酸缓冲液中，风味酶添加量为5000U/g(干粉)其中(酶活力单位为20万U/g)，在 50-55°C下水浴酶解，酶解时间2-3小时；(5)脱蛋白将步骤⑷得到的酶解液在10000-12000rpm离心，过滤后真空浓缩； 向浓缩物中加Vmi= 4 5 1的混合液，料液比为=1 1 4g/ml，离心除蛋白，离心速度为12000 140000rpm，离心后去除蛋白层，重复5-8次；(6)脱色向步骤(5)中得到的离心液加入食品级活性炭，脱色过夜；(7)沉淀过滤除去活性炭粉后，用无水乙醇进行分级沉淀；(8)将收集的沉淀冷冻干燥后，得到粗多糖成品。步骤(6)中，食品级活性炭与离心液的料液比为1 10 20g/ml。步骤(7)中所述的分级沉淀为，首先向除去活性炭后的多糖溶液中加入无水乙醇，使体系中乙醇体积浓度达到70 75%，静置2 池后过滤沉淀；然后继续向滤液中加无水乙醇，使体系中乙醇浓度达到80 85%，静置2 池后过滤沉淀，最后，再加无水乙醇，使乙醇浓度最终达到90 95%，静置2 池后过滤得沉淀，将三次沉淀收集备用。本发明的有益效果利用本发明的提取方法，海肠废弃内脏中粗多糖的产率为2. 31%，占海肠内脏中糖分总量的56.5%。所得成品色泽微黄，总糖含量为17. 1%，蛋白质含量为0.76%。所制备的粗多糖产品的对OH自由基的清除能力为55. 1% -60. 1%，具有较好的剂量效应，具备了一定的体外抗氧化活性，。本发明采用风味酶进行消化酶解，避免了高温对多糖活性的影响。本发明方法操作简单，产率较高，所得产品具有较好的生物活性，适合于大规模生产。有益于海洋生物废弃资源的高值利用。此外，本发明是以海肠废弃内脏为原料进行多糖的提取的，一方面减轻了环境的污染，同时使资源得到了最大限度的利用。
表1实施例1制得的粗多糖苯酚-硫酸显色后稳定性结果；图1实施例1制得的粗多糖中总糖含量测定曲线；图2实施例1制得的粗多糖中总蛋白质含量测定曲线；图3实施例1制得的粗多糖的体外抗氧化活性测定曲线。
具体实施例方式实施例1(1)清洗取新鲜海肠废弃的内脏，将内脏中残留的食物残渣、粪便等用清水处理干净，用搅拌器绞碎。(2)脱脂将绞粉碎后的内脏放置于体积比为1 1的丙酮和乙醚混合液中浸泡过夜，料液比为1 3g/ml，在4°C下离心，转速为14000rpm，去掉脂肪层。(3)烘干上述混合液放在通风橱中，至有机溶剂完全挥发，烘干，粉碎得干粉。(4)酶解将上述干粉按照料液比1 5g/ml溶解在磷酸缓冲液中(pH = 7. 0)，风味酶添加量为5000U/g(干粉)其中(酶活力单位为20万U/g)，水浴50-55°C，作用时间2_3小时。(5)脱蛋白上述浸提液12000rpm离心，过滤后(普通滤纸)，真空浓缩(用旋转蒸发仪浓缩至合适体积)，加混合液V氯仿V正丁醇=4 1，料液=1 lg/ml，重复两次，除蛋白，离心14000rpm，去除蛋白层。(6)脱色按照料液比为1 20g/ml加入食品级活性炭粉，脱色过夜。(7)沉淀过滤除去活性炭粉后，用无水乙醇进行分级沉淀，首先向除去活性炭后的多糖溶液中加入无水乙醇，使体系中乙醇浓度(ν/ν)达到70 75%，静置2 池后过滤沉淀；然后继续向滤液中加无水乙醇，使体系中乙醇浓度达到80 85%，静置2 池后过滤沉淀， 最后，再加无水乙醇，使乙醇浓度最终达到90 95%，静置2 池后过滤得沉淀，将三次沉淀收集备用。(8)将得到的沉淀冷冻干燥，即得粗多糖成品。实施例2粗多糖理化性质测定以实施例1中得到的粗多糖为样品进行测定。粗多糖中总糖含量测定采用常规的苯酚-硫酸法，实施例1中得到的样品经苯酚-硫酸显色后，分别在室温下静置0h，0. 5h，lh，1. 5h，2h，3h,考察吸光值变化情况见表1。 粗多糖中总糖含量测定结果见图1。表 1时间 O.Oh 0.5h l.Oh 1.5h 2. Oh 2.5h 3. Oh RSD
A490nm 0.313 0.308 0.314 0.31 0.311 0.311 0.315 0.78% 硫酸-苯酚法是根据多糖在浓硫酸水解作用下产生单糖，并与苯酚发生显色反应的原理测定多糖浓度，在490nm处吸收值与糖含量呈线性关系。实施例1中所述样品经显色后，0-3h内，随着时间的推移，吸光值无明显变化，计算得相对标准偏差为0. 78%，说明实施例1中所述样品具有较好的稳定性，符合总糖含量测定条件；与葡萄糖标准曲线对比， 测得多糖样品中总糖的浓度为42. 905μ g/mL，计算得到含量为17. 1%。
蛋白质含量测定利用常规的考马斯亮蓝法，紫外280nm处所得吸光值与蛋白质含量成正相关。样品及标准品测定结果见图2。由图2可知，测得多糖样品中蛋白质的浓度为75. 665 μ g/mL，计算得到含量为 0. 76%。实施例3体外抗氧化活性测定以实施例1中得到的粗多糖为样品，利用邻菲罗啉法进行测定。在试管中依次加入9mmol/L 的 FeSO4 溶液 2ml, 10 μ g/mL,30 μ g/mL,40 μ g/mL、 50 μ g/mL的多糖溶液anl，9mmol/L的H2A溶液^il，摇勻后静置lOmin，再加入9mmol/L水杨酸溶液anl，摇勻后静置30min，后于波长510nm处测得不同浓度多糖的吸光度Ai，用蒸馏水代替水杨酸时测得吸光度Aj，空白对照组用蒸馏水代替多糖提取液，测得吸光度为Atlt5 测量结果见图3。.清除率计算公式为:Ε(·0Η)(%)= [1- (Ai-Aj)/A0] X 100%由图3可知，在10_50μ g/mL浓度范围内，样品对· OH自由基的清除率为 55. 1-60. 1%。说明实施例1所得样品具有较好的对羟基自由基(· 0H)的清除效果。
权利要求
1.一种海肠废弃内脏中粗多糖的提取方法，其特征在于，以海肠废弃内脏为原料，依次经过除杂、粉碎、脱脂、酶解、脱蛋白、沉淀、冷冻干燥后得到所述的粗多糖。
2.根据权利要求1所述的粗多糖的提取方法，其特征在于，所述的酶解过程采用风味酶进行消化酶解。
3.根据权利要求1所述的粗多糖的提取方法，其特征在于，其具体步骤为，(1)除杂、粉碎；(2)脱脂将绞粉碎后的内脏放置于体积比为1 1 2的丙酮和乙醚或石油醚混合液中浸泡过夜，料液比为1 2 4g/ml，接着在4 10°C下离心分离，离心速度为12000 15000rpm，去除脂肪层；(3)烘干后得到干粉；(4)酶解将步骤(3)得到的干粉按照料液比1 5 10g/ml溶解在pH = 6. 0 7. 0 的磷酸缓冲液中，风味酶添加量为5000U/g(Te)其中酶活力单位为20万U/g，在50-55°C下水浴酶解，酶解时间2-3小时；(5)脱蛋白将步骤⑷得到的酶解液在10000 12000rpm离心，过滤后真空浓缩；向浓缩物中加入V氯仿V正丁醇=4 5 1的混合液，料液比为=1 1 4g/ml，离心除蛋白，离心速度为12000 14000rpm，离心后去除蛋白层，重复5-8次；(6)脱色向步骤(5)中得到的离心液加入食品级活性炭，脱色过夜；(7)沉淀过滤除去活性炭粉后，用无水乙醇进行分级沉淀；(8))将收集的沉淀冷冻干燥后，得到粗多糖成品。
4.根据权利要求3所述的粗多糖的提取方法，其特征在于，步骤(6)中，食品级活性炭与离心液的料液比为1 10 20g/ml。
5.根据权利要求3所述的粗多糖的提取方法，其特征在于，步骤(7)中所述的分级沉淀为，首先向除去活性炭后的多糖溶液中加入无水乙醇，使体系中乙醇体积浓度达到70 75%，静置2 池后过滤沉淀；然后继续向滤液中加无水乙醇，使体系中乙醇浓度达到 80 85%，静置2 池后过滤沉淀，最后，再加无水乙醇，使乙醇浓度最终达到90 95%， 静置2 池后过滤得沉淀，将三次沉淀收集备用。
全文摘要
一种海肠废弃内脏中粗多糖的提取方法属于农业废弃物资源化利用领域，更具体地说，是涉及一种海肠废弃内脏中粗多糖的提取方法。本发明提供了一种操作简单、产率高、产品活性高的海肠废弃内脏中粗多糖的提取方法。其以海肠废弃内脏为原料，依次经过除杂、粉碎、脱脂、酶解、脱蛋白、沉淀、冷冻干燥后得到所述的粗多糖。
文档编号A61K31/715GK102304191SQ201110260629
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月24日 优先权日2011年8月24日
发明者孟芳, 安传峰, 焦绪栋, 王成林, 王福亮, 秦松 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所