专利名称：一种制何首乌多糖及其在制备抗衰老药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药领域，具体涉及一种制何首乌多糖及其在制备抗衰老药物中的应用。
背景技术：
何首乌(A^j^o/w mult ifIorum 7&// 力)，为蓼科多年生草本植物何首乌的块根。 自古以来，何首乌被人们认为具有益寿延年、延缓衰老之功效，系著名的滋补中药。2005版药典何首乌生品与炮制品质量控制指标都是二苯乙烯苷。传统用药多用制何首乌，其主要有补肝肾、益精血、乌须发功效，并且现代研究证明二苯乙烯苷是其补益作用的物质基础。 但研究发现，何首乌经过炮制以后，补益作用增强了，但二苯乙烯苷的含量却下降了，这说明除了二苯乙烯苷以外，别的成分也具有较好的补益作用。多糖是由10个以上的单糖组成的聚合高分子碳水化合物，具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、治疗肝肾疾病及消炎镇痛，美容等药理作用，且其来源十分丰富，广泛存在于动物(如动物粘液)、植物(如植物的种子、茎和叶)、微生物(细菌和真菌，昆虫及甲壳动物的壳真菌，细菌的胞内外等)和海藻中，从动植物器官组织、菌类及微生物发酵产物中可得到不同种类的多糖。淀粉、纤维素等植物多糖早已被人们在日常生活中使用。近年来， 世界范围内对多糖的研究都较多，已经从动植物体分离出来了 300多种多糖，经过研究和开发，人们对多糖的作用机制和作用机理有了了解，多糖类药品和保健品已经得到了开发， 例如香菇多糖由于具有较好的抗肿瘤效果，在临床上已经被得到广泛应用。关于何首乌多糖的报道不多，中国专利200610012026. 3 (公开号101081250，
公开日2007-12-05)公开了一种改善贫血的何首乌提取物药剂及其制备方法和应用。该何首乌提取物中多糖含量大于60%，可以改善血虚动物模型的贫血指征和提高白细胞水平，用于治疗贫血。关于制何首乌中多糖类成分的抗衰老活性还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制何首乌多糖。本发明的另一目的是提供上述制何首乌多糖的制备方法。本发明的又一目的是提供上述制何首乌提取物在制备抗衰老药物中的应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的 一种制何首乌多糖，是采用以下方法制备而成的
(1)将制何首乌粉碎成粗粉，95体积％乙醇回流脱脂，滤出溶剂，滤渣干燥后再用80体积％乙醇回流提取，滤出溶剂，滤渣干燥后得到脱脂制何首乌粉；
(2)脱脂制何首乌粉加入1(Γ20倍体积的水(S卩加入水的体积为药材质量的1(Γ20倍)， PH值为7. 0的条件下在6(T90°C恒温水浴中提取2、次，每次广2h，然后过滤，浓缩滤液到相对密度为1. 05 ；(3)将浓缩后的滤液加入淀粉酶适量，37°C恒温过夜，得到脱淀粉后的浓缩液；
(4)向脱淀粉后的浓缩液加入乙醇，调整使含醇量为509T80%(体积百分含量)，静置过夜，离心，收集沉淀，得到除淀粉的制何首乌粗多糖；
(5)对除淀粉后的制何首乌粗多糖进行除蛋白、除色素处理，最终得到制何首乌多糖。本发明所述的制何首乌，是指采用2010版《中国药典》一部制何首乌项下炮制方法炮制的何首乌加工品。作为一种优选方案，上述步骤(1)中95体积％乙醇回流脱脂2次，每次4h ；80体积％乙醇回流提取时间为他。步骤(2)中，加入水的体积优选为脱脂制何首乌粉末质量的15倍。研究结果表明， 随着液固比的增加，多糖的得率逐渐增加，但当料液比达1:15以后，多糖得率不再增加，反而降低。最适料液比为1:15，在料液比为1:15时，多糖的提取量最大。低于1:15时随料液比的增加多糖的提取量增加，当料液比超过1:15时，随着的料液比的增大，多糖的提取量减少。一般来说，溶剂用量越大提取效率是越高的，原因可能是由于随着提取液的增加，溶剂中多糖总量增加。而随着原料中多糖总量减少，导致浓度差变小，扩散速度会降低，逐渐达到基本平衡状态。而且过大的料液比会造成溶剂和能源的浪费，并给后工序的浓缩带来困难。当料液比大到一定程度时，溶剂已将有效成分基本溶出完全。再增大料液比，杂质成分会竞争溶出反而不利于效成分的提取。故料液比选择1 :1(Γ20为宜，其中1:15最佳。步骤(2)中恒温水浴温度优选为90°C。随着提取温度的升高，多糖含量不断增加， 而以100°C为最佳。这可能是由于制何首乌多糖主要存在于细胞壁中，要提取多糖，首先要使细胞壁成分降解或分离，需要较高的温度。但鉴于高温可能对多糖的结构与活性有一定的影响，多糖易发生降解而丧失活性，并且从已得到的多糖干品发现，随着温度的升高，多糖色泽亦加深。所以选择提取温度不宜超过90°c。步骤(2)中恒温水浴中提取次数优选2 3次，最佳方案为提取2次。随着提取次数的延长，多糖的得率不断增加，提取两次明显比提取一次效果好，但是提取两次后，增加变缓。因此，提取次数限制在2 4次提取为宜。再综合其他提取因素后测评后，发现提取 2次最佳。步骤(2)中恒温水浴每次提取时间为lh。随着提取时间的延长，多糖的得率增加， 60min后趋于平缓。提取时间过短时，多糖难以从何首乌细胞中溶出，影响多糖含量。当提取达到一定时间时，有效成分浓度达到平衡，提取率最高。为缩短工时，减少能耗，提取时间宜选择60 120min。而提取时间过长多糖得率增加不明显且会造成不必要的浪费，因此确定为60min最为适合。综合以上各因素，最终得出的步骤(2)中提取优选方案为提取温度90°C、提取时间为60min、提取次数为3次，提取时的料液比1 :15。研究发现，在上述众多影响因素中，提取温度、提取时间和料液比对制何首乌多糖提取率起主要作用，而提取次数的作用不明显，因此从节约生产成本的角度考虑，最终确定步骤(2)中的最佳提取条件为提取温度90°C，提取时间为60min，提取次数为2次，提取时的料液比1 :15。步骤(3)中除淀粉选择淀粉酶用量为每100克药材(即浓缩后的滤液)加入20mg 淀粉酶。随着淀粉酶用量的加大，何首乌总多糖的提取率没有明显增加，而淀粉含量在加入
420mg淀粉酶时含量最低，而随淀粉酶含量加大含量区域平缓。为纯化何首乌多糖，降低生产成本考虑，最终确定为每IOOg药材加入20mg淀粉酶。步骤(4)中调节醇沉浓度为60% (体积)。随着乙醇浓度升高，总多糖纯度也随之升高，在乙醇浓度为60%时总多糖纯度最高，之后平缓下降；而其中淀粉含量却随乙醇浓度升高而降低，在乙醇浓度60%时最低，之后含量升高，综合考虑何首乌多糖的纯化工艺，应得何首乌多糖量多，纯度高，尽量减少非有效物质淀粉的含量，最终确定为60%乙醇沉淀。步骤(5)中除蛋白方法可以选择Sevag法和三氯乙酸-正丁醇法。其中Sevag法脱蛋白6次、三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白3次都可以达到较好的脱蛋白效果，但是相比之下三氯乙酸_正丁醇对多糖的破坏性较大，因此选择Sevag法脱蛋白6次作为最佳的脱蛋白方案。步骤(5)中所述除色素的方法可以选择大孔吸附树脂、双氧水或活性炭等，经过分析发现，多糖脱色率双氧水>大孔吸附树脂DlOl >活性炭，多糖保存率大孔吸附树脂DlOl >双氧水>活性炭，双氧水的脱色效果远好于大孔吸附树脂D101，二者的多糖保存率又十分接近，并且操作更为方便。因此将制何首乌多糖除色素方法的确定为取一定量粗多糖水溶液，慢加双氧水使双氧水的质量百分比浓度达到10%，45°C恒温水浴锅中脱色4h。上述制何首乌多糖在制备抗衰老药物中的应用，所述的衰老尤其指由H2O2损伤引起的衰老。上述制何首乌多糖可以用于制备清除自由基的药物、保护超氧化物歧化酶活力的药物或保护谷胱甘肽过氧化物酶活力的药物。我们研究发现，制何首乌多糖对H2O2损伤的PC12细胞模型具有很好的保护作用， 添加制何首乌多糖后H2O2损伤细胞密度大，生长均勻，与模型组相比细胞形态明显改善。在PC12细胞凋亡测定中，添加制何首乌多糖的细胞，细胞凋亡数有所减少，且呈剂量依赖关系，尤其是制何首乌多糖浓度为1(T20 mg/L时效果最为明显。同时，制何首乌多糖在2(T0. 156mg/ml范围内对H2O2损伤的H印G2细胞也具有很好的保护作用，能够显著增加细胞存活率。对小鼠衰老模型(注射D-半乳糖造模)的研究表明，制何首乌多糖灌胃的小鼠脑丙二醛(MDA)活力显著低于模型组和空白组，提示多糖可以显著降低机体内脂质过氧化程度。 同时研究还表明制何首乌多糖能够显著提高机体内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活力。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明提供了一种精制的制何首乌多糖，采用的制备方法操作简单、合理、多糖提取率高，外观色泽好，能够较好的应用于生产；同时验证了精制后的制何首乌多糖的抗衰老作用，提供了制何首乌多糖的新用途，并提出了其开发方向。
图1.不同温度处理脱脂何首乌粉末后多糖含量测定结果。图2.不同时间处理脱脂何首乌粉末后多糖含量测定结果。图3.不同提取次数处理脱脂何首乌粉末后多糖含量测定结果。图4.不同pH值处理脱脂何首乌粉末后多糖含量测定结果。
图5.不同料液比处理脱脂何首乌粉末后多糖含量测定结果。图6.淀粉的标准曲线。图7.不同淀粉酶含量除淀粉后淀粉含量测定结果。图8.不同醇沉浓度醇沉后粗多糖中多糖含量测定结果。图9.蛋白质的标准曲线。图10. Sevag法脱除次数对蛋白含量的影响检测结果。图11.三氯乙酸-正丁醇法脱除次数对蛋白含量的影响检测结果。图12.两种方法除蛋白能力的比较，其中ISkvag法，2为三氯乙酸-正丁醇法。图13.两种方法多糖含量的比较，其中1为Sevag法，2为三氯乙酸-正丁醇法。图14.大孔吸附树脂与多糖水溶液的加入比例对多糖脱色率的影响。图15.双氧水在不同温度下对多糖脱色率的影响。图16.活性炭脱色法不同时间对多糖脱色率的影响。图17.不同脱色方法对多糖脱色率的影响。图18.制何首乌多糖对H2O2诱导PC12细胞损伤的形态学显微镜照片，其中A.正常细胞组，B. H2O2损伤模型组，C.何首乌多糖组(20mg/ml)，D.何首乌多糖组(1. 25mg/ml)， Ε.何首乌多糖组(0. 188mg/ml)。图19.流式细胞术检测制何首乌多糖对H2A诱导PC12细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻的影响结果分析图，其中A.正常对照组，B. H2O2模型组，C.大剂量多糖保护组(5mg/ml)， D.多糖保护组(2. 5mg/ml)，E.多糖保护组(1. 25mg/ml)，F.多糖保护组(0. 625mg/ml)。图20.制何首乌多糖对H2O2损伤PC12细胞Hochest荧光染色结果图(X200)， 其中 A-F 分别为多糖试验组，多糖浓度为 20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2. 5mg/ml、l. 25mg/ml、 0. 156mg/ml，G.模型组，H.空白对照组。
具体实施例方式实施例1制何首乌多糖的提取 1.制何首乌药材的预处理
称取制何首乌500g，粉碎成粗粉，过20目筛。2.脱脂，除去单糖和低聚物
将步骤1中制何首乌粗粉装入3000mL烧瓶中，加入95%乙醇2000mL，置于电热套中， 冷凝回流4h，回流脱脂两次，滤出溶剂，自然风干滤渣。风干的滤渣加入80%乙醇2000mL， 再回流他，除去部分单糖和低聚糖以及苷类、生物碱、氨基酸等，滤出溶剂，自然风干滤渣， 得到脱脂何首乌粉末。3.制何首乌多糖提取工艺单因素考察 (1)提取温度对制何首乌多糖得率的影响
精确称取IOg的脱脂何首乌粉末5份，分别加入150mL蒸馏水，调节pH值至7. 0，然后分别在在60°〇、701、801、901、1001恒温水浴中提取2h，过滤，残渣以上述条件重复提取一次，离心，收集上清液，减压浓缩，合并两次上清液，定容到250mL容量瓶中，从中吸取 ImL到50mL容量瓶中，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，测定结果见图1。结果表明，随着提取温度的升高，多糖含量不断增加，而以100°C为最佳。这可能是由于制何首乌多糖主要存在于细胞壁中，要提取多糖，首先要使细胞壁成分降解或分离，需要较高的温度。但鉴于高温可能对多糖的结构与活性有一定的影响，多糖易发生降解而丧失活性，并且从已得到的多糖干品发现，随着温度的升高，多糖色泽亦加深。所以选择提取温度不宜超过90°C。(2)提取时间对制何首乌多糖得率的影响
精确称取IOg的脱脂制何首乌5份，分别加入150mL的蒸馏水，调节pH值至7. 0， 然后在90°C温水浴中分别提取0. 5h、lh、l. 5h、2h和2. 5h，过滤，残渣以上述条件重复提取一次，离心，收集上清液，减压浓缩，合并两次上清液，定容到250mL容量瓶中，从中吸取ImL 到50mL容量瓶中，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，测定结果见图2。结果表明，随着提取时间的延长，多糖的得率增加，60min后趋于平缓。提取时间过短时，多糖难以从何首乌细胞中溶出，影响多糖含量。当提取达到一定时间时，有效成分浓度达到平衡，提取率最高。为缩短工时，减少能耗，提取时间宜选择60 120min。(3)提取次数对制何首乌多糖得率的影响
精确称取IOg的脱脂制何首乌粉末5份，分别加入150mL的蒸馏水，调节pH值至7.0，然后90°C的恒温水浴中提取2h，过滤，5份样品分别提取1、2、3、4、5次，离心，收集上清液，减压浓缩，合并上清液，定容到250mL容量瓶中，从中吸取ImL到50mL容量瓶中，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，结果见图3。结果表明，随着提取次数的延长，多糖的得率不断增加，提取两次明显比提取一次效果好，但是提取两次后，增加变缓。因此，提取次数限制在2 4次提取为宜。(4)提取液pH值对制何首乌多糖得率的影响
精确称取IOg的脱脂制何首乌粉末5份，分别加入150mL的蒸馏水，然后调提取液pH 值分别为5、6、7、8、9，90°C热水提取2h，过滤，残渣以上述条件重复提取一次，离心，收集上清液，减压浓缩，合并两次上清液，定容到250mL容量瓶中，从中吸取ImL到50mL容量瓶中， 采用苯酚_硫酸法测定多糖含量，结果见图4。结果表明，在pH 5.0 7.0时，随着pH值升高，多糖得率有所提高，在pH7.0时最高。pH超过7.0(pH 7.0 9.0)时又呈降低趋势，这很可能过强的酸碱度影响到制何首乌多糖结构的稳定性，从理论上来说多糖在碱性溶液中易发生烯醇化、异构化和分解等反应， 因此最终确定提取液pH为7. 0。(5)料液比对制何首乌多糖得率的影响
在PH为7. 0条件下，90°C热水提取3h，通过改变料液比，考察料液比对制何首乌多糖含量的影响。精确称取IOg的脱脂制何首乌粉末5份，分别加入80、100、150、200和250mL 蒸馏水，调节PH值至7. 0，然后在90°C恒温水浴中提取2h，过滤，残渣以上述条件重复提取一次，离心，收集上清液，减压浓缩，合并两次上清液，定容到250mL容量瓶中，再从250mL容量瓶中吸取ImL到50mL容量瓶中，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，结果见图5。结果表明，随着液固比的增加，多糖的得率逐渐增加，但当料液比达1:15以后，多糖得率不再增加，反而降低。最适料液比为1:15，在料液比为1:15时，多糖的提取量最大。 低于1 15时随料液比的增加多糖的提取量增加，当料液比超过1 15时，随着的料液比的增大，多糖的提取量减少。一般来说，溶剂用量越大提取效率是越高的，原因可能是由于随着提取液的增加，溶剂中多糖总量增加。而随着原料中多糖总量减少，导致浓度差变小，扩散速度会降低，逐渐达到基本平衡状态。而且过大的料液比会造成溶剂和能源的浪费，并给后工序的浓缩带来困难。当料液比大到一定程度时，溶剂已将有效成分基本溶出完全。再增大料液比，杂质成分会竞争溶出反而不利于效成分的提取。故料液比选择1 :1(Γ20为宜，其中1:15最佳。实施例2制何首乌多糖的提取工艺的优化 1.制何首乌多糖热水提取正交试验
为了进一步考察最佳提取工艺，经过分析，我们选用提取温度、提取时间、提取次数、料液比为考察因素，根据以多糖含量为指标的制何首乌多糖的水提单因素考察实验结果，而分别选出三个水平，采用正交试验设计对制何首乌多糖提取工艺进行研究。选取用L9(34) 正交表安排试验。( 1)水煎煮提取正交试验方法设计
精确称取IOOg的脱脂制何首乌粉末，选用不同的提取温度、提取时间、提取次数和加水量进行煎煮提取，调节PH值至7. 0，然后在90°C恒温水浴中提取池，过滤，残渣分别提取 2次，离心，收集上清液，减压浓缩，合并两次上清液，定容到2L容量瓶中，再从2L容量瓶中吸取ImL到50mL容量瓶中，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。采用正交设计试验，对提取温度、提取时间、提取次数和加水量进行条件优选，用L9(34)正交表安排试验。因素水平表见表1。表1制何首乌多糖热水提取因素水平表
权利要求
1.一种制何首乌多糖，其特征在于是由以下方法制备而成(1)将制何首乌粉碎，95体积％乙醇回流脱脂，滤出溶剂，滤渣干燥后再用80体积％乙醇回流提取，滤出溶剂，滤渣干燥后得到脱脂制何首乌粉；(2)脱脂制何首乌粉加入1(Γ20倍体积的水，ρΗ值为7.0的条件下在6(T90°C恒温水浴中提取2、次，每次广2h，然后过滤，浓缩滤液到相对密度1. 05 ；(3)将浓缩后的滤液加入淀粉酶，37°C恒温过夜，得到脱淀粉后的浓缩液；(4)向脱淀粉后的浓缩液加入乙醇，调整使含醇量为5(Γ80体积％，静置过夜，离心，收集沉淀，得到除淀粉的制何首乌粗多糖；(5)对除淀粉后的制何首乌粗多糖进行除蛋白、除色素处理，最终得到制何首乌多糖。
2.根据权利要求1所述的制何首乌多糖，其特征在于步骤(2)中加入水的体积为脱脂制何首乌粉末质量的15倍。
3.根据权利要求1所述的制何首乌多糖，其特征在于步骤(2)中恒温水浴温度为90°C， 提取2次，每次提取时间为lh。
4.根据权利要求1所述的制何首乌多糖，其特征在于步骤(3)中加入淀粉酶的量为每 IOOg浓缩后的滤液加入20mg淀粉酶。
5.根据权利要求1所述的制何首乌多糖，其特征在于步骤(4)中含醇量调整为60体积％。
6.根据权利要求1所述的制何首乌多糖，其特征在于步骤(5)中所述除蛋白是用kvag 法脱蛋白6次。
7.根据权利要求1所述的制何首乌多糖，其特征在于步骤(5)中所述除色素是向制何首乌粗多糖水溶液中加入双氧水使其质量百分比浓度为10%，45°C条件下脱色4h。
8.权利要求1所述的制何首乌多糖在制备抗衰老药物中的应用。
9.根据权利要求8所述制何首乌多糖在制备抗衰老药物中的应用，其特征在于所述衰老为由H2A和/或D-半乳糖引起的衰老。
10.根据权利要求9所述制何首乌多糖在制备抗衰老药物中的应用，其特征在于所述抗衰老药物为清除氧自由基药物、保护谷胱甘肽过氧化物酶活力药物和/或保护超氧化物歧化酶活力药物。
全文摘要
本发明公开了一种制何首乌多糖及其在制备抗衰老药物中的应用。该制何首乌多糖制备方法制何首乌粉碎，95%乙醇回流脱脂，滤出溶剂，滤渣干燥后用80%乙醇回流提取，滤出溶剂，滤渣干燥得脱脂制何首乌粉，然后将脱脂制何首乌粉加入水，pH7.0的条件下在60~90℃恒温水浴中提取，过滤，滤液合并浓缩到相对密度1.05，加淀粉酶37℃恒温过夜，过滤，滤液加乙醇调节醇浓度为50~80%，静置过夜，过滤，沉淀经过除蛋白、除色素处理后即得到制何首乌多糖。本发明的制何首乌多糖可以应用于制备抗衰老药物，具有良好的治疗效果，且为中药制剂，毒副作用小，安全可靠，应用领域广泛，可以作为胶囊剂、颗粒剂、片剂等进行开发。
文档编号A61P39/06GK102344500SQ20111030256
公开日2012年2月8日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者梁生旺, 王淑美, 王霆, 申洪超, 苏智斌, 陈占科 申请人:广东药学院