专利名称：贻贝多糖在制备抗衰老药物或食品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是从海洋生物贻贝的提取物中分离到的贻 贝多糖用于制备抗衰老药物或食品的一种新用途。
背景技术：
贻贝是海产双壳贝类，俗称胄口、海红，是我国海水养殖的主要产品 之一。国外有从贻贝中分离纯化甘露聚糖酶、凝集素及抗菌物质等方面的
研究[Searching for Alternatives to Heparin Sulfated Fucans from Marine Invertebrate Paulo A.S.Moirao and Mariana S.Pereira 2000,Elsevier Science Inc.All right reserved. 1050- 1738，研究表明贻贝提取物具有抗肿瘤、抗病 毒等活性。贻贝提取物的主要活性成分为贻贝多糖，其具有抗肿瘤、抗病 毒、抗肝损伤和增加机体免疫能力的功效Hongli Xu, Tingling Guo， Yl-feng Guo, Jianpeng Zhang, Yang Li， Weihua Feng, a/. Characterization and Protection on Acute Liver Injury of a Polysaccharide MP-I from Mytilus Coruscus[J].G/;;coWo/ogy， 2008,18: 97-103;徐红丽，郭婷婷，郭一锋，张
建鹏，冯伟华，焦炳华.贻贝多糖MP-I的分离纯化及体外抗肿瘤活性研究 LJJ.第二军医大学学报，2006， 27 (9) :998-1001。但至今尚未见有关贻贝
多糖具有抗衰老活性的报道。
发明内容
本发明提供一种贻贝多糖用于制备抗衰老药物或食品的新用途。1.制备贻贝提取物
取东海厚壳贻贝的新鲜贻贝肉，用高速搅拌器将K搅拌匀浆，按常规 加水煮沸后改用小火煮约4-5h，过滤得滤液，此为贻贝提取液； 2.制备贻贝多糖 将制得的贻贝提取液浓縮后，离心弃沉淀，上清液用体积比为氯仿
正丁醇=4: l的sevage法分次萃取，直至水相不见蛋白质沉淀，再加三倍 体积的90-95%乙醇，搅拌均匀，室温静置过夜，离心弃上清，将沉淀冷冻 干燥，得贻贝多糖。
贻贝多糖的糖含量和蛋白含量的测定 将上述制得的贻贝多糖lg复溶于100ml蒸馏水，离心弃沉淀，分别 按常规用硫酸-苯酚法测定上清液中糖的含量，用BCA法测定上清液屮蛋白 的含量，检测结果，贻贝多糖的糖含量为91%，蛋白含量为5%。
贻贝多糖抗衰老活性动物实验
SD大鼠的寿命以月龄计算，通常认为24月龄后就进入衮老阶段，因
此，本^验将24月龄SD大鼠设为老年大鼠，3月龄SD大鼠为青年大鼠。 取24月龄SD大鼠，分为老年正常对照组、贻贝多糖低剂量组和贻贝多 糖高剂量组，并设一组3月龄SD大鼠为青年对照组。根据24月龄SD大鼠每天 的平均进食量，接贻贝多糖不同的给药剂量，将贻贝多糖和啮齿类动物饲 料按一定比例混合，分别制成混合饲料，使贻贝多糖高剂量组大鼠按体重 每天口服400mg/kg贻贝多糖，即贻贝多糖的给药剂量为400mg/kg/d;贻贝 多糖低剂量组大鼠按体重每天口服200mg/kg贻贝多糖，即贻贝多糖的给药 剂量为200mg/kg/d，老年对照组和青年对照组大鼠则喂食啮齿类动物饲料。 连续饲养90天，分别观察大鼠心脏、肝脏、肾、脾的脏器指数；对其心脏、肝脏、脑进行切片观察病理学变化；测定大鼠血清、肝脏及脑中超氧化物 歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)水平，测定 血清主要生化指+示，测定e-半乳糖苷酶在脑组织的分布和量。实验发现，
与老年对照组相比，贻贝多糖高剂量组的心脏、肝脏、脑组织病理切片HE 染色观察未见明显衰老性改变；其血清、肝脏、脑组织中SOD水平增高，MDA 含量降低；血清、肝脏组织中GSH-px水平增高；血清主要生化指标测定结 果显示血糖(Glu)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、 肌苷(CRE)、胆固醇(CH)生化指标中，贻贝多糖组与青、老年对照组相 比无统计学差异；贻贝多糖组、青年对照组、老年对照组的甘油三酯(TG) 水平有统计学差异。免疫组化测定0 -半乳糖苷酶在大脑皮质的分布和量发 现，老年对照组e-半乳糖苷酶表达较多，而贻贝多糖、fr年对照组大鼠大 脑皮质中的表达均明显减少。实验结果表明，本发明贻贝贻贝多糖具有抗 袞老活性，闵此，町用于制备抗衰老药物或食品。
本发明贻贝多糖制备方法简便，为贻贝多糖开辟r一种新用途，有利于
海洋生物的开发利用。
图1 .贻贝多糖低、高剂量组和青、老年对照组SD大鼠心、肝、脑组织
切片对照图谱
图I-A SD大鼠心脏HE染色组织学观察X200 图l-B SD大鼠肝脏HE染色组织学观察X 200 图1-C SD大鼠大脑皮质HE染色组织学观察X 200
图2.贻贝多糖低、高剂量组和青、老年对照组SD大鼠大脑皮质0-半乳
糖苷酶表达量及分布比较图谱
图3 .贻贝多糖低、高剂量组和青、老年对照组SD大鼠脑组织SOD总活
5力比较图
图4贻贝多糖低、高剂量组和青、老年对照组SD大鼠脑组织MDA的含量 比较图。
具体实施方式
现结合附图和实施例，对本发明作洋细描述。 实施例l:制备贻贝多糖
1. 材料
东海厚壳贻贝由浙江省嵊泗嵊山镇贻贝养殖基地提供。
2. 试剂
苯酚、硫酸、氯仿、乙醇(分析纯)，中国医药集团上海化学试剂公司产品。
葡萄糖标准品，SIGMA公司产品。BCA-100蛋白定量试剂盒由上海申能博彩公司 提供。 '
3. 仪器
BEC隨N CUOLTER J-251型高速离心机，BECKMAN CUOLTER公司产品。 制备贻贝多糖
1. 制备贻贝提取液
取东海厚壳贻贝的新鲜贻贝肉1000g，用高速搅拌器将其搅拌匀浆，
按常规加水煮沸后改用小火煮约4h，纱布过滤得提取液；
2. 制备贻贝多糖
将贻贝提取液浓縮后，低速离心弃沉淀，上清液用体积比为氯仿正
丁醇=4: l的sevage法萃取3次，水相无蛋白质沉淀出现，再加三倍体积的 95%乙醇，搅拌均匀，室温静置过夜，离心弃上清，将沉淀冷冻干燥得贻贝 多糖51g,呈淡黄色粉末状,吸水性强，溶解性好。贻贝提取物和贻贝多糖的糖含量和蛋白含量测定
1. 用分光光度法测定贻贝多糖的糖含量
(1) 葡萄糖标准曲线的绘制先用标准葡萄糖配制成浓度分别为50
ug/ml 、 100yg/ml、 200iig/ml、 400yg/ml、 800ug/ml的水溶液，然后使用苯酚硫酸法分别进行显色反应，再用分光光度计测定OD值，以糖浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
(2) 测定贻贝多糖的糖含量将贻贝多糖配制成10mg/ml浓度的溶液，按常规用苯酚硫酸法进行显色反应，然后用分光光度计测定OD值，对照葡萄糖标准曲线，得对应的糖浓度。计算出贻贝多糖的糖含量为91%。
2. 用BCA法测定贻贝多糖的蛋白含量
将贻贝多糖配制成10mg/ml浓度的溶液，按BCA法蛋白定量试剂盒说明书操作，测定贻贝多糖溶液的蛋白浓度，计算出贻贝多糖的蛋白含量为5%。
贻贝多糖的抗衰老活性动物试验
1. 材料
贻贝多糖由实施例l制得。
雄性SD大鼠24月龄20只，3月龄5只，由上海西普尔-必凯实验动物公司[SYXK (沪)2003-0018]提供，啮齿类饲料喂养，自由饮食，分笼饲养于第二军医大学实验动物中心SPF级动物房。
2. 试剂
甲醛溶液由上海太平洋化工(集团)公司产品提供，批号GB685-93。BCA-100蛋白定量试剂盒由上海申能博彩公司提供。超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，丙二醛(MDA)试剂盒，谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-px)试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供，P -半乳糖苷酶染色试剂盒由上海杰美基因医药科技有限公司提供。
3. 仪器
酶标仪Versa Max (Molecular Devices)H-S电热恒温水浴锅(江苏东台电器厂)Bechman coulter J-251型高速离心机(Bechman )
4. 实验方法及结果4.1实验方法
雄性SD大鼠24月龄15只，随机分成3组，即老年对照组、贻贝多糖低剂量组和贻贝多糖高剂量组，每组5只;3月龄SD大鼠5只，作为青年对照组。
老年对照组和青年对照组大鼠喂食啮齿类动物饲料，贻贝多糖低、高剂量组分别喂食贻贝多糖和啮齿类动物饲料按相应比例混合的混合词料，贻贝多糖低剂量组的给药剂量为200mg/kg/d，贻贝多糖高剂量组的给药剂量为400mg/kg/d，连续饲养90天。
观察如下指标l).大鼠活动、反应、毛色等一般情况；2)大鼠心脏、肝脏、肾、脾的脏器指数；3)心脏、肝脏、脑组织的组织切片病理学变化；4)血清、肝脏和脑组织中SOD、 MDA、 GSH-px水平；5)血清主要生化指标；6) e-半乳糖苷酶在大脑皮质的分布和量。4.2结果
4. 2. 1 _动物一般情况
老年对照组大鼠迟钝少动，反应缓慢，缺少灵敏性，毛发枯黄；贻贝多糖低、高剂量组，大鼠在初期烦躁不安，毛蓬乱少光泽，随后逐渐活泼好动，反应灵敏，毛发尚光滑；青年对照组大鼠明显活泼好动，反应灵敏，
8毛发光洁呈白色。
4.2.2脏器指数测定结果
所谓脏器指数，是指脏器与体重之比(％)=内脏重量(g) /体重(g)
X100%。经统计分析，各组大鼠的心、肝脏、肾、脾的脏器指数见表l。
表l SD大鼠脏器指数结果n-5，单位％ )
心脏指数肝脏指数肾脏指数 一—；指数~~老年对照组 0. 32±0,052. 48±0. 46 0. 29±0. 02 0, 32土0. —
贻贝多糖低剂量组0.42±0.092. 13±0.63 0.37±0. 14 0. 18土0. 04
贻贝多糖高剂量组0.37±0.06 2.47±0.210.32±0.03 0,21±0.05
青年对照组 0. 39士0.03___3.61士0. 46*___0. 42±0.08__0. 27土0. 02 —
'P<0.05，与老年对照组由表1可见，除青年对照组的肝脏指数比老年对照组高(有统计学差异，*P<0.05)#，余各脏器指数无组间差异。贻贝多糖未造成器官的肥大或者蒌縮，间接提示贻贝多糖无脏器毒性。
4.2.3 'SD大鼠心、肝、脑组织切片病理学变化
对大鼠的心脏、肝脏、脑组织进行切片观察，结果见图l。由图1-A、图1-B和图1-C可见，老年对照组中，心脏局部小灶性心肌蒌縮伴少量纤维组织增生，肝脏中央静脉周围肝细胞中度脂肪变性，大脑出现大量空泡样衰老性变化，说明老年对照组大鼠的心脏、肝脏、脑组织均出现了衮老性变化；而贻贝多糖低、高剂量组和奢年对照组中，除贻贝多糖低剂量组出现轻度脂肪变形外，心脏、肝脏、脑组织均正常，未见特殊变化，从而提示贻贝多糖可以延缓重要脏器的衰老进程。
4.2.4 '大鼠脑组织0 -半乳糖苷酶含量测定
免疫组化测定P -半乳糖苷酶在大脑皮质的分布和含量结果见图2 。由图2可见，老年对照组大鼠大脑皮质中e-半乳糖苷酶表达较多，而在贻贝多糖低、高剂量组和青年对照组大鼠大脑皮质中的表达均明显减少，P-半乳糖苷酶的含量通常被视为脑组织衰老的相关牛物标记，从而说明贻贝多糖可以延缓脑组织衰老进程。
4.2.5血清主要生化指标测定
血清的血糖(Glu)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌苷(CRE)、胆固醇(CH)检测的统计分析结果见^2。
表2.各组大鼠血清主要生化指标的测定结果G土s ， n=5)
Glu ALTASTBUN CRE TG CH
老年对照祖 5.3il :i 52.:ii112 IBS l±il 2 29 9I±S. ，K () 3:i:tl' O'J | W 55=zq. .57±〃) W
贻贝多糖低剂l组 5.(>±l)2 ti2.5±IH. I I76.3±.it)4 39 2<*±5 II (13I±(U)2 75 11 = 10 61 K 3<J±I()21
断贝多糖条别S组 5 2士().3 47 ()±7 2 242.6±II5 2() H7±h 59 (' l()土()().隱> |W. I5±24 4 * H(l C二l2 l
夷年对照组 5.4±0.2 49.9±ll.fi I33.7±lb.() :，7b4工fi.41 ().33±).()9 168.52±2b. 73* 111.5f>±lh. 20
' *P<0.05
由表2可见，贻贝多糖低、高剂量组和青年、老年对照组相比各项指标无统计学差异，说明贻贝多糖无心、肝、肾毒性，对血糖也无明显影响。
4.2.6血清中SOD、 MDA、 GSH-px测定，结果见表3。由农3可见
(l)贻贝多糖高剂量组SOD活性较老年对照组显著增高(P<0.01)，贻贝多糖低剂量组较老年对照组高(P<0.05)，而与青年对照组相比均无统计学
差异(P>0.05);
(2) 贻贝多糖高剂量组GSH-px活性比老年对照组显著增高(P<0.01)，贻贝多糖低剂量组比老年对照组高(P<0.05)，而与青年对照组相比均无统计学差异；
(3) 贻贝多糖高剂量组MDA含量显著低于老年对照组(P<0.01)，与青年对照组相比无统计学差异。
由此可见，贻贝多糖具有较明显的抗衰老作用，抗氧化作用可能是其抗衰老作用的机理之一。
10表3.各组大鼠血清S0D、 MDA、 GSH-PX酶活力的测定结果(；土《，n二5)
老年对照组 贻贝多糖低剂量组 贻贝多糖离剂鼉组 育年对照组
SOD (U/ml) 107,04±24.03 135. 62± 13. 74神157. 51十17. 6(T 1S7.92土9.31
GSH-PX(U/ml) 728.28±96.10 798.28±96.03935.17± 140.25神 943.45±95.49
MDA(nmol/ml) 10.53 ±1.96 8.75上1.5* 7.29土0.96神6.94 ±0.54
"P<0.01,与老年对照组；*P<0.05，与老年对照组贻贝多糖在此剂量下对老年SD大鼠具有较明显的抗衰老作用，抗氧化
作用可能是其抗衰老作用的机理之一 。
4.2.7大鼠肝脏组织中SOD、 MDA、 GSH-px测定，结果见表4。由表4可见
(1) 贻贝多糖高剂量组SOD活性较老年对照组明显增高(P<0.05)，而与青年对照组比较无统计学差异(P>0.05);
(2) 贻贝多糖高剂量组GSH-px活性与老年对照组相比，具有显著性差异(P<0.01)且明显高于贻贝多糖低剂量组(P<0.05)，而与青年对照组相
比无统计学差异；
(3) 贻贝多糖高剂量组MDA含量低于老年对照组(P<0.05)。
表4,各组大鼠肝脏组织S0D、 MDA、 GSH-PX酶活力的测定结果G士^n二5)老年对照组贻贝多糖低剂量组贻贝多糖萬剂量组 靑年对照沮SOD (U/m抑ro)107.0±24.03 135.62±13.74 157.51 ± 17.60** 167.92土9.31GSH-PX(U/mgpro) 183.18±24.14 257. 26±28. 94** 303.91±24. 85** 328.79±37.11MDA(nmozm印ro) 5.51±1.44 4.24±0.62 3. 17±1. 11* 2.6丄±0.49
*><0.01，与老年对照组；'P<0.05，与老年对照组
由此可见，贻贝多糖具有较明显的抗氧化作用，表明其具有抗衰老作用。
114.2.8火鼠脑组织中SOD、 MDA测定，结果见图3 。由图3可见
(1) 大脑皮质SOD活性发现，贻贝多糖低、高剂量组大鼠的大脑皮质SOD活性显著高于老年对照组(p<0.01)，而与青年对照组相比无统计学差异；
(2) 贻贝多糖高剂量组大脑皮质MDA含量显著低:P老年对照组(p<0.01)，与而青年对照组无统计学差异；表明贻贝多糖具有较明显的抗衰老作用，抗氧化作用可能是其抗衰老作用的机理之一 。
上述动物实验结果表明，贻贝多糖能分别提高血清、肝脏、脑组织中SOD和GSH-px的活性，降低MDA的含量，肉此贻贝多糖具有抗衰老的活性，可用于制备延缓衰老的药物或食物。
权利要求
1. 贻贝多糖在制备抗衰老药物或食品的应用。
2. 权利要求1所述贻贝多糖的制备方法，步骤如下 1)制备贻贝提取物取东海厚壳贻贝的新鲜贻贝肉，用高速搅拌器将其搅拌匀浆，按常规 加水煮沸后改用小火煮4-5h，过滤得滤液，此为贻贝提取液； 2)制备贻贝多糖将贻贝提取液浓縮后离心弃沉淀，上清液用体积比为氯仿正丁醇二4: 1的sevage法分次萃取，直至水相不见蛋白质沉淀，再加三倍休积的 90-95%乙醇，搅拌均匀，室温静置过夜，离心弃i:清，将沉淀冷冻千燥， 得贻贝多糖。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是从海洋生物贻贝的提取物中分离到的贻贝多糖用于制备抗衰老药物或食品的一种新用途。本发明从东海厚壳贻贝的新鲜贻贝肉提取贻贝多糖，经动物实验，贻贝多糖能分别提高血清、肝脏、脑组织中SOD和GSH-px的活性，降低MDA的含量，因此贻贝多糖具有抗衰老的活性，可用于制备延缓衰老的药物或食物。本发明为贻贝多糖提供了一种新的用途。有利于海洋生物的开发利用。
文档编号A61K31/715GK101455676SQ20091004488
公开日2009年6月17日 申请日期2009年1月5日 优先权日2009年1月5日
发明者冯伟华, 刘军华, 周婷婷, 周文丽, 张建鹏, 焦炳华 申请人:中国人民解放军第二军医大学