专利名称：一种抗血栓和血小板聚集的小肽的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一类由5个氨基酸组成的小肽，尤其涉及一类由5个氨基酸为核心序列的具有抗血小板聚集、抗血栓形成作用的小肽衍生物及其应用。
背景技术：
血栓形成是多种心脑血管疾病共同的病理过程，包括心脑血管性血栓性栓塞、肺栓塞和深静脉血栓形成等，是指在一定条件下，血液有形成分在血管(多数为小血管)形成栓子，造成血管部分或完全堵塞、相应部位血供障碍的病理过程而形成的一系列综合征。随着社会的发展和人口老龄化的进程，血栓性疾病的发病率逐年增加。据世界卫生组织统计，全球每年有1500万人死于血栓性疾病。据统计，我国每年的发病人数有1000万，病死人数有100万，致残率也很高。血栓性疾病已经占据全球疾病总死亡率的第一位。提高血栓性疾病的防治水平，减少其发病率，降低致残率、死亡率，降低由此而产生的社会问题，已成为当务之急。血栓形成主要有动脉血栓形成和静脉血栓形成两种。大部分心肌梗死及80%的中风是由于动脉血栓形成引起，而心血管疾病引起死亡的病因中，静脉血栓栓塞位列第三位。一般说来，以血小板为靶点的药物用于治疗动脉血栓，而以凝血因子为靶点的药物对治疗静脉血栓有显著优势。抗血小板药物，维生素K拮抗剂，肝素及低分子量肝素是用于防治血栓形成最常用的药物。但是，这些药物的安全性、有效性使其临床应用受到很大的限制。例如，抗血小板药物阿司匹林(aspirin)、氯吡格雷(clopidogrel)、噻氯匹定(Prasugrel)等，GPIIbIIIa抑制剂阿昔单抗(abciximab)、伊替巴肽(印tifibatide)等在抑制血小板聚集和血栓素A2合成的同时，具有胃肠道刺激和出血倾向等不良反应。而肝素的抗凝效应具有很大的个体差异，必需密切监控出凝血时间。此外，不良反应血小板减少症虽然少见却可严重威胁病人生命，进一步限制了肝素和低分子量肝素在临床的使用。维生素K拮抗剂具有更多的局限性，诸如与其他药物的相互作用以及反应性的个体差异。因此，研究开发新的高效低毒的抗血栓药物具有十分重要的临床意义。血小板参与血液凝固的过程并在血栓形成的启动和扩大中起着十分重要的作用。当血管内皮损伤，内皮下大分子物质如胶原和凝血酶暴露，血小板可粘附其上，进一步引发血小板聚集和血小板颗粒内容物的释放。多种血小板激活剂，如ADP，凝血酶和5-羟色胺等加强血小板反应性。血小板活化后，血小板P选择素和GPIIb/IIIa活性位点的暴露，促进血小板和白细胞募集，而使血栓进一步扩大。随机设计的大型临床实验已证明血小板是心脑血管疾病的治疗靶点，通过抑制血小板反应性可显著改善急性冠脉综合征和经皮血管再通术病人的愈后。但是，由于现有的抗血小板药物存在着出血并发症、血小板减少症和药物抵抗等不良反应，新型抗血小板药物仍然是目前的研究重点。通过前期大量的活性筛选，首次发现了由5个氨基酸组成的核心小肽序列具有抗血小板聚集、抗体内血栓形成作用。
发明内容
解决的技术问题本发明提供一种小肽，可抑制血栓形成和血小板聚集。可用于制备抗血栓和血小板聚集的药物。技术方案一种抗血栓和血小板聚集的小肽，序列为X-Arg-Y-X-Lys (X-精氨酸-Y-X-赖氨酸)，其中，χ为非极性氨基酸，所述非极性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或苯丙氨酸；Y代表极性氨基酸，所述极性氨基酸为甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。上述结构组成核心序列的任意位置用有机物或无机物进行修饰所产生的系列衍生物。上述结构组成核心序列的上游和/或下游添加任意1 5个氨基酸序列所产生的衍生物。用上述结构的小肽及其衍生物单独或组合使用作为其它药物的辅料或添加剂。一种抗血栓和血小板聚集的小肽，优选序列为Ile Arg Thr Pro Lys。上述蛋白质在制备抗血栓形成和血小板聚集药物中的应用。有益效果通过体外血小板聚集试验、体内血栓形成试验表明，该小肽能以浓度依赖的方式抑制血小板聚集；同时，可明显抑制大鼠体内动静脉旁路血栓的形成。该小肽及其衍生物可以用于抗血小板聚集、抗血栓形成治疗。综上，该小肽可用于制备抗血栓和血小板聚集的药物。
图1. HPLC法分析纯度；图2. LC/MS确定分子量；图3.对血小板聚集的抑制作用。
具体实施例方式实施例1小肽的固相合成以FMOC (9-芴甲氧羰基)为保护基团进行固相合成，用95% (ν/ν)三氟乙酸、2. 5% (ν/ν)水和2. 5% (ν/ν)三异丙甲硅烷(TIA)将其从树脂上裂解。用乙醚沉淀3次后，通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化多肽，以含0. 05% (ν/ν)三氟乙酸的0% 60%(ν/ν)乙腈为流动相，3mL/min的流速进行梯度洗脱。洗脱后样品进行冷冻干燥，以高效液相色谱法(HPLC)鉴定纯度为95% (图1)，用液-质联用分析仪(LC-MS)确定分子量为613. 76 (图2)，与理论分子量一致。实施例2体外抗血小板聚集实验人肘静脉穿刺抽血，用A⑶液(9 1) (ν/ν)抗凝，150g离心8min，吸取富血小板血浆，再以650g离心IOmin ；弃去上清液，加入含lg/L的牛血清白蛋白的羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPEQ缓冲液吹散沉淀，调整血小板数至QOO 300)X109/L，每次测试取300 μ L，加入不同浓度的小肽10 μ L (0 2. Ommol/L)，最后加入诱导剂二磷酸腺苷(美国Sigma-Aldrich公司)15 μ L至终浓度5 μ mol/L ；在LBY-NJ4血小板凝集仪(北京普利生)上连续测定60s，180s，300s，及最大血小板聚集率(RPA)；实验重复3次；同时计算血小板聚集抑制率{抑制率=[1-(RPA未加药-RPA加药后)/RPA未加药]XlOO% }。结果显示，随小肽(IRTPK)浓度的增加，60s、180s、300s及最大血小板聚集率(Max)逐渐减小，呈浓度依赖特性；IC50约为lmmol/L(图3)。在小肽N 端或 C 端修饰 H2N- (CH2) 即 H2N- (CH2) 7-IRTPK 和 IRTPK- (CH2) 7-H2N(由上海科肽公司合成)，用上述相同方法考察修饰产物对血小板聚集的影响，结果显示，修饰物对60s、180s、300s及最大血小板聚集率(Max)的影响与核心序列一致。在小肽C端修饰氨基(即IRIPK-H2N)(由上海科肽公司合成)，用上述相同方法考察修饰产物对血小板聚集的影响，结果显示，对60s、180s、300s及最大血小板聚集率(Max)的影响与核心序列一致。在小肽N端或C端修饰磷酸基团(即p-IRIPK和IRIPK-p)(由上海科肽公司合成)，用上述相同方法考察修饰产物对血小板聚集的影响，结果显示，对60s、180s、300s及最大血小板聚集率(Max)的影响与核心序列一致。在小肽N端和C端修饰氨基酸序列ISKPI (即ISKPIIRTPK和IRIPKISKPI)(由上海科肽公司合成)，用上述相同方法考察修饰产物对血小板聚集的影响，结果显示，对60s、180s、300s及最大血小板聚集率(Max)的影响与核心序列一致。实施例3小肽单独使用或与阿司匹林合用对大鼠动静脉旁路血栓形成的影响(1)实验动物雄性SD大鼠15只，体重250_280g，购自浙江省实验动物中心，动物许可证号为SCXK (浙)2008-0033。(2)实验过程将大鼠随机分为8组，每组3只，分别为空白对照组(给予等体积的生理盐水)，阳性药对照阿司匹林组(Sigma，10mg/kg)，低、中、高剂量小肽(IRTPK)组(0. 65,1.3,2. 6mg/kg)及低、中、高剂量与阿司匹林合用(10mg/kg阿司匹林+0. 65，1. 3，2.6mg/kg小肽)组。给药容积为0.5mL/100g，除阿司匹林组灌胃给药外，其余组均股静脉注射给药。手术前，在三段聚乙烯管的中段放入一根长5cm的1号手术丝线，丝线两端各多出0. 5cm固定于两端聚乙烯管外，将生理盐水溶液充满聚乙烯管，作为插管。大鼠给予阿司匹林Ih后，其他组给药5min后，用20% (ν/ν)乌拉坦按lg/kg麻醉，颈部正中切口，分离右侧颈总动脉及左颈外静脉，将聚乙烯管一端插入右侧颈总动脉，另一端插入左颈外静脉，打开动脉夹，血液从右颈总动脉经聚乙烯管返回左颈外静脉。开放血流15min后停止，迅速取出丝线，用滤纸吸取血栓表面的血液，精确称重，总重量减去丝线重量，即为血栓湿重。以t检验同生理盐水组进行比较，同时计算出血栓抑制率。血栓抑制率(％ )=
血栓湿重(生理盐水组)_血栓湿重(试验组)-χ100%
血栓湿重(生理盐水组)结果发现，除了低剂量组，阳性药阿司匹林、高、中剂量小肽组及阿司匹林与小肽合用组能使血栓湿重显著下降，与生理盐水组比较，差异显著(P < 0. 05)(表1)；且剂量与血栓形成抑制率呈明显正相关(r = 0. 997 ；P < 0. 05)。表1对大鼠动静脉旁路血栓形成的影响(n = 3)
权利要求
1.一种抗血栓和血小板聚集的小肽，其特征在于序列为X-Arg-Y-X-LyS，其中，X为非极性氨基酸，所述非极性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或苯丙氨酸；Y代表极性氨基酸，所述极性氨基酸为甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。
2.根据权利要求1所述抗血栓和血小板聚集的小肽，其特征在于在上述结构组成核心序列的任意位置用有机物或无机物进行修饰所产生的系列衍生物。
3.根据权利要求1所述抗血栓和血小板聚集的小肽，其特征在于在上述结构组成核心序列的上游和/或下游添加任意广5个氨基酸序列所产生的衍生物。
4.根据权利要求1所述抗血栓和血小板聚集的小肽，其特征在于用上述结构的小肽及其衍生物单独或组合使用作为其它药物的辅料或添加剂。
5.一种抗血栓和血小板聚集的小肽，其特征在于优选序列为Ile Arg Thr Pro Lys0
6.权利要求1或5所述蛋白质在制备抗血栓形成和血小板聚集药物中的应用。
全文摘要
一种抗血栓和血小板聚集的小肽，序列为X-Arg-Y-X-Lys，其中，X为非极性氨基酸，所述非极性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或苯丙氨酸；Y代表极性氨基酸，所述极性氨基酸为甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。通过体外血小板聚集试验、体内血栓形成试验表明，该小肽能以浓度依赖的方式抑制血小板聚集；同时，可明显抑制大鼠体内动静脉旁路血栓的形成。该小肽及其衍生物可以用于抗血小板聚集、抗血栓形成治疗。综上，该小肽可用于制备抗血栓和血小板聚集的药物。
文档编号A61P7/02GK102391360SQ20111034129
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月2日 优先权日2011年11月2日
发明者吴国球 申请人:东南大学