专利名称：用细胞系生产鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒与活疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用细胞系生产的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒及鸡嗜肾型传染性支气管炎活疫苗及其制备方法，属于兽用疫苗领域。
背景技术：
鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是由鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的一种高度接触性的病毒性传染病。按病毒感染后出现的致病症状，即致病型，可以分为呼吸型、嗜肾型等。嗜肾型传染性支气管炎以肾脏病变为主，还出现泌尿生殖系统病症，伴有呼吸道症状，表现为肾脏苍白肿大、肾小管和输尿管扩张充满尿酸盐、排出白色稀粪等。目前防治本病多采用弱毒株W93的鸡胚组织弱毒苗。虽然目前该苗安全性好，免疫效果理想，但鸡胚苗的生产，除了劳动强度大、产量偏低外，还面临着我国目前SPF鸡胚紧缺，而采用一般鸡胚制苗，不仅可能受鸡胚中母源抗体干扰，使疫苗效价不稳定，而且胚源性病原体极易随着疫苗的研制、生产和发放使用造成某些疫病的人为传播。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种用细胞系生产的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒及鸡嗜肾型传染性支气管炎活疫苗的方法及产品，以实现以更安全、更有效地生产鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒及疫苗的目的。技术方案本发明提供一种用细胞系生产鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒的方法，包括以下步骤I)将细胞系经消化传代，以细胞生长液进行培养，形成生长良好的细胞单层；2)将鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒接种于上述细胞单层，进行鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒的吸附；3)将上述吸附病毒的细胞，换用细胞维持液培养，进行鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒的增殖；4)当CPE达到75%以上时，收获鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒。优选地，本发明所述细胞系为Vero细胞系、BHK-21细胞系、PK-15细胞系、Mar cl 45细胞系、ST细胞系、IBRS-2细胞系任意一种或几种细胞系。优选地，本发明所述细胞系为VeiX)细胞系。优选地，本发明步骤2)中在接种病毒后，还包括加入孵育剂对细胞进行孵育20-40分钟的过程。优选地，本发明所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖、干扰素或脂多糖。更优选地，本发明所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖。优选地，本发明所述的孵育时间为30分钟。
优选地，本发明所述的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒是鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒W93株。优选地，本发明步骤2)中接种用的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒是在鸡胚中传代获得的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒。由上可见，本发明可以获得一种根据上述所述的方法制备的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒，所述病毒为使用细胞系生产的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒。本发明另一目的在于提供一种用细胞系生产鸡嗜肾型传染性支气管炎活疫苗的·方法，包括使用上述方法获得的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒，加入冻干保护剂，制备为鸡嗜肾型传染性支气管炎活疫苗。由上可见，本发明可以获得一种鸡嗜肾型传染性支气管炎活疫苗，其特征在于，使用细胞系生产鸡嗜肾型传染性支气管炎活疫苗。由上面的技术方案及本发明后续的具体实施方式
可以看出，发明人意外地发现在鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒繁殖时对细胞进行孵育可以帮助鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒适应细胞系，使得用细胞系繁殖鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒成为了可能，从而实现了用细胞系生产鸡嗜肾型传染性支气管炎疫苗。而在现有技术中，国内外无论使用Vero细胞、BHK-21细胞、PK-15细胞、Marcl45细胞、ST细胞、IBRS-2细胞等何种细胞或细胞系，或者使用同步培养、带毒传代等方法，都没有实现鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒在细胞系(细胞)中获得有效的增殖，并达到利用细胞系生产鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒或疫苗的程度。其次，发明人还发现在传染性支气管炎病毒接种细胞前可先在鸡胚上进行传代，可以帮助传染性支气管炎病毒更容易适应于细胞系，促进病毒在细胞系的增殖并加快产生细胞病变的速度及提高细胞生产传染性支气管炎病毒的滴度和质量。
具体实施例方式本发明实施例中使用了常见的商业化的容易培养的细胞系如Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)、BHK-21细胞(幼仓鼠肾传代细胞)、PK-15细胞(猪肾细胞)、Marcl45细胞(上皮样细胞，来源于猴肾细胞)、ST细胞(猪睾丸细胞)、IBRS-2细胞(猪肾细胞)等细胞或细胞系生产鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒及疫苗。本发明实施例中接种用的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒优选使用鸡胚传代适应的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒，或优选使用细胞系生产获得的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒；但是使用鸡胚传代适应的或细胞系生产的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒用于接种，其目的仅为了提高接种用的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒的效价，并使得接种用的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒更适应在细胞中生长，以及使鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒在细胞上能更快的出现细胞病变，获得的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒的滴度更高、鸡嗜肾型传染性支气管炎疫苗的效力更佳。因此，本发明的接种用鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒并不限于使用经鸡胚传代适应的鸡嗜肾型传染性支气管炎以及经细胞系培养的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒，其他来源的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒如组织来源的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒液也可以用于接种细胞系生产鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒及疫苗。本发明实施例使用细胞系生产鸡嗜肾型传染性支气管炎的疫苗为冻干活疫苗，还可以利用本发明实施例的方法获得的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒，加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂，获得鸡嗜肾型传染性支气管炎灭活疫苗。本发明的细胞培养液中血清为牛血清，优选胎牛血清,其他的动物性血清如兔血清、羊血清等均可以作为细胞培养液。为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。实施例I Veix)细胞生产鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒及鸡嗜肾型传染性支气管炎活疫苗本实施例中，选择非洲绿猴肾细胞系VeiO细胞(购自中国科学院上海生命科学研 究院细胞资源中心)作为生产鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒与鸡传染性支气管炎活疫苗的细胞系，鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒W93株毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是94% v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液,6% v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为 . 2 ;所用细胞维持液的配方是99% v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，1% v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7. 2。以下为使用Vero细胞生产鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒与疫苗的具体步骤I.生产用鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒种的制备首先可先将鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒W93株用无菌pH7. 2磷酸盐缓冲液按体积比I : 100倍稀释后，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚O. 1ml，置37°C继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有胚放入4°C冰箱过夜，收集尿囊液，用SPF鸡胚连续传10代，无菌收集尿囊液并以3000rpm高速4°C离心50min取上清液即为所需的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒(对鸡胚毒力为108· 7EID50/0. 1ml)，备用。将Vero细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于37°C继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；接种100倍稀释的上述步骤制备的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒，37°C吸附1-2小时，然后加入细胞维持液在37°C中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时，后用pH7. 2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时CPE大于75%时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于_20°C保存，作为生产用毒种。2.制苗用鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒的制备使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒，具体步骤为将上述细胞生长液培养获得的生长良好的VeiO细胞单层，加入含3% v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37°C吸附1-2小时；吸附病毒后,在Vero细胞系加入细胞维持液，在37°C中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时。用pH7. 2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时CPE大于75%时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒液。
制苗用鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒液的检验按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验及EID5tl的测定，每O. Iml病毒液的病毒含量为IO8 9EID5tl，且对I %的鸡红细胞无凝集。将得到的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒液置于-20°C进行保存。3.疫苗的制备经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒液混合后再与蔗糖明胶保护剂按9 1(病毒液保护剂)配苗，冻干保护剂以40°C-50°C为宜(8%明胶、40%蔗糖保护剂，经115°C高压灭菌40分钟，放4°C保存，72小时内用完)。在添加的过程中应摇动病毒液，充分混合均匀后，即为疫苗原液。将疫苗原液无菌定量分装，迅速冷冻真空干燥，加盖密封即可得到鸡传染性支气管炎冻干活疫苗。制备三批，批号为2010501、2010502、2010503，其中每羽份中病毒含量为IO4EID5tlt54.鸡传染性支气管炎活疫苗安全性及效力检验安全性试验用I日龄、7日龄和14日龄SPF雏鸡各60只，每批疫苗使用各10只，同时设立同批同日龄对照组鸡各10只，将上述冻干活疫苗10羽份稀释至O. Iml的剂量，实验组滴鼻接种稀释好的疫苗O. 1ml，对照组滴鼻等量的生理盐水，在相同条件下饲养管理，观察28日。结果显示，该疫苗安全可靠，所有雏鸡生理活动正常，无死亡及呼吸异常、神经症状等反应。经剖检观察，实验组和对照组雏鸡均无肾脏肿大和尿酸盐沉积等病理变化。试验证明疫苗安全，结果如表I。表I鸡传染性支气管炎活疫苗安全检验结果
权利要求
1.一种用细胞系生产鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)将细胞系经消化传代，以细胞生长液进行培养，形成生长良好的细胞单层； 2)将鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒接种于上述细胞单层，进行鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒的吸附； 3)将上述吸附病毒的细胞，换用细胞维持液培养，进行鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒的增殖； 4)当CPE达到75%以上时，收获鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述细胞系为VeiO细胞系、BHK-21细胞系、PK-15细胞系、Marcl45细胞系、ST细胞系、IBRS-2细胞系任意一种或几种细胞系。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2)中在接种病毒后，还包括加入孵育剂对细胞进行孵育20-40分钟的过程。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖、干扰素或脂多糖。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的孵育时间为30分钟。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒是鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒W93株。
7.根据权利要求I 6所述的方法，其特征在于，步骤2)中接种用的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒是在鸡胚中传代获得的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒。
8.一种根据权利要求I 7任意一项所述的方法制备的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒，其特征在于，使用细胞系生产鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒。
9.一种用细胞系生产鸡嗜肾型传染性支气管炎活疫苗的方法，其特征在于，使用权利要求8所述的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒，加入冻干保护剂，制备为鸡嗜肾型传染性支气管炎活疫苗。
10.一种根据权利要求9所述的方法制备的鸡嗜肾型传染性支气管炎活疫苗，其特征在于，使用细胞系生产鸡嗜肾型传染性支气管炎活疫苗。
全文摘要
本发明提供了一种用细胞系生产鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒W93及其疫苗的方法，包括使用如Vero细胞系、BHK-21细胞系、PK-15细胞系、Marc145细胞系、ST细胞系、IBRS-2细胞系，在上述细胞系形成生长良好的细胞单层后，接种鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒，并使之吸附于上述细胞系；换用细胞维持液培养后，加入孵育剂对细胞进行孵育20-40分钟，以进行鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒的增殖；当CPE达到75％以上时，收获鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒。本发明用细胞系生产的鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒疫苗的方法，可以实现以更安全、更有效地生产鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒及疫苗的目的。
文档编号A61K39/215GK102978167SQ20111039197
公开日2013年3月20日 申请日期2011年11月30日 优先权日2011年11月30日
发明者张许科, 孙进忠 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司