缓释核酸基质组合物的制作方法

专利名称：缓释核酸基质组合物的制作方法
技术领域：
本发明提供了用于延长释放和/或控释基于核酸的药物/药剂(试剂)的组合物，该组合物包含含有生物相容性聚合物的基于脂质的基质(脂质类基质)。本发明还提供了制备基质组合物(matrix compositions)的方法以及利用基质组合物来提供核酸活性剂的控释的方法。
背景技术：
治疗性核酸基因疗法是药物开发中的主要研究领域。已认为基因疗法是这样的期望的机制，其用来纠正导致与无法产生某些蛋白质有关的疾病的遗传缺损并且用来克服获得性疾病如自身免疫病和癌症。基因疗法可以为许多疾病的治疗提供新的预防途径。然而，基因疗法的商业化的技术障碍在于，对于多核苷酸的递送以及缓释和/或控释，需要实用、有效和安全的方式。由于在带负电荷的细胞膜和在多核苷酸上的高负电荷之间的电荷排斥，多核苷酸并不容易渗透细胞膜。因此，多核苷酸具有较差的生物利用度，并且摄取进入细胞，通常〈1%。在动物模型中，基于病毒的载体已成功用来将基因给予期望的组织。在一些情况下，这些途径已导致治疗水平的蛋白质的长期(>2年)表达。然而，已广泛地报告了基于病毒途径的限度。例如，借助于这些载体的重新给予是不可能的，这是由于相对于病毒蛋白产生的体液免疫反应。除为获得适当的可重复的载体供应所面临的制造挑战以外，还存在与病毒载体有关的显著的安全问题，尤其是对于那些靶向肝用于基因表达的病毒载体。尽管存在与病毒基因疗法有关的问题，但许多人已认为病毒比非病毒递送载体更有效。通过寡核酸并利用称作反义疗法、RNA干扰(RNAi)、和酶核酸分子的技术，可以影响在细胞中特定基因表达的沉默或下调。反义疗法是指通过使用互补DNA或RNA寡核酸来灭活靶DNA或mRNA序列从而抑制基因转录或翻译的方法。反义分子可以是单链、双链或三链螺旋。能够抑制表达的其它药剂是例如酶核酸分子如DNA酶和核酶，其能够特异性地切割感兴趣的mRNA转录物。DNA酶是单链脱氧核糖核苷酸，其能够切割单和双链靶序列。核酶是催化核糖核酸分子，其越来越多地用于基因表达的序列特异性抑制，其中通过编码感兴趣的蛋白质的mRNA的切割。RNA干扰是基因表达的转录后抑制的方法，其中上述基因表达在许多真核生物体中是保守的。它有助于控制哪些基因是主动的以及它们是如何主动的。对于RNA干扰来说，两种类型的小RNA分子-微RNA (miRNA)和小分子干扰RNA (siRNA)-是重要的。RNA是基因的直接产物，并且这些小RNA可以结合于特定的其它RNA并增加或降低它们的活性，例如通过防止信使RNA产生蛋白质。RNA干扰在防卫细胞以抵抗寄生基因(病毒和转座子)方面以及一般地在引导扩生和基因表达方面具有重要作用。虽然RNA干扰效应(其是通过小分子干扰RNA (siRNA)或微RNA加以介导)对人类治疗具有潜在的应用，但通常用于寡核苷酸的快速给予的流体力学方法不适用于人类。对于制药业来说，基于RNAi的疗法的开发是相对较新的。虽然已克服开发上述药物的许多障碍，但RNAi化合物到适当组织并进入细胞的最佳递送仍然是一种挑战。
核酸的递送非病毒基因疗法的一个问题是实现足够核酸的递送和表达以导致有形的、生理有关的表达。虽然数年以前已表明，在等渗盐水中的DNA质粒(所谓的“裸’DNA)可以体内转染各种细胞，但这样的未受保护的质粒易被酶降解，从而导致在动物模型中摄取的不可重现性以及高度可变的表达和生物反应。在大多数组织中“裸”质粒的非常低的生物利用度还需要给予高剂量的质粒以产生药理反应。因而，非病毒基因递送的领域已被引向开发更加有效的合成递送系统，其能够增加质粒递送的效率、赋予长期表达并提供储存稳定剂型(如其它药剂剂型所预期的)。促进细胞摄取DNA的化学方法包括使用DEAE-葡聚糖。然而，这可以导致细胞活力的丧失。磷酸钙也是常用的化学药剂，当 和DNA共沉淀时，其将DNA引入细胞。引入DNA的物理方法已变成用来再现地转染细胞的有效方式。直接微注射是一种这样的方法，其可以将DNA直接递送到细胞核(Capecchi 1980，Cell, 22，479)。这便于分析单细胞转染子。所谓的“生物导弹”方法利用涂布有DNA的高速颗粒物理上将DNA插入到细胞和/或细胞器中。电穿孔是用来转染DNA的最常用的方法之一。该方法涉及使用高电压电荷来瞬间通透细胞膜，从而使它们可渗透大分子复合物。然而，由于细胞内损伤，用来引入DNA的物理方法确实会导致细胞活力的相当大的丧失。最近一种称作免疫穿孔的方法已变成用于将核酸引入细胞的公认的技术(Bildirici et al 2000，Nature, 405，298)。取决于所使用的核酸，可以实现40-50%的转染效率。因而这些方法需要广泛的优化并且还需要昂贵的设备。为了克服核酸(通常质粒DNA( “pDNA”)、或siRNAs/微RNA)的降解问题和增强基因转染的效率，已开发了阳离子缩合剂(如多聚季铵盐、树状聚物、壳聚糖、脂质、和肽)来保护核酸，其中通过借助于静电相互作用来缩合它。然而，与“裸”DNA的转染相比，缩合质粒颗粒用于体内转染大量的例如肌细胞并不成功。另外的策略，其包括通过与保护性的、可相互作用的非缩合系统的相互作用来调节质粒表面电荷和疏水性，已显示出优越于使用“裸"DNA来直接给予实体组织(例如，国际申请公开号WO 96/21470)。封装核酸的生物可降解微球体也已用于基因递送。例如，国际申请公开号WO00/78357披露了包括透明质酸的基质、薄膜、凝胶和水凝胶，其用二肼加以衍生化并交联于核酸，以形成缓慢释放微球体。基于脂质的药物递送系统在医药科学领域中是众所周知的。通常它们用来配制具有较差的生物利用度或高毒性或两者的药物。在已获得接受的流行的剂型中，有许多不同类型的脂质体，其包括小单层囊泡、多片层囊泡和许多其它类型的脂质体；不同类型的乳液，其包括油包水乳液、水包油乳液、水中油包水双重乳液、亚微米乳液、微乳状液；胶束和许多其它疏水性药物载体。这些类型的基于脂质的递送系统可以高度专门用来允许靶向药物递送或降低的毒性或增加的代谢稳定性等。在数天、数周和更长时间内的延长释放并不是通常伴随基于脂质的体内药物递送系统的分布。对于体外和体内基因递送，由两亲阳离子分子构成的脂质体是有用的非病毒载体。在理论上，脂质的阳离子头缔合于DNA的带负电荷的核酸主链以形成脂质核酸复合物。作为基因转移载体，脂质核酸复合物具有许多优点。不同于病毒载体，脂质核酸复合物可以用来转移基本上大小不受限制的表达盒。因为上述复合物缺乏蛋白质，所以它们可以诱发很少免疫原性和炎性反应。另外，它们不能复制或重组以形成传染剂并且具有低整合频率。阳离子脂质(例如脂质体)的使用已变成常用方法，因为它并不具有化学方法所显示的毒性度。存在许多出版物，通过显示在体外培养细胞中报道基因的可检测表达，其令人信服地表明，两亲阳离子脂质可以体内和体外介导基因递送。由于脂质核酸复合物有时并不和病毒载体同样有效地实现成功的基因转移，所以很多努力已致力于发现具有增加的转染效率的阳离子脂质(Gao et al. , 1995, Gene Therapy 2,710-722)。许多工作已报道了在动物中以及在人类中两亲阳离子脂质核酸复合物用于体内转染(在 Thierry et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995，92，9742-9746 中加以评论)。然而，用于制备具有稳定保质期的复合物的技术问题还没有得到解决。例如，不同于病毒载体制备，就颗粒尺寸而言，脂质核酸复合物是不稳定的。因而难以获得具有适用于全身注射的尺寸分布的均匀的脂质核酸复合物。脂质核酸复合物的大多数制剂是相对稳定的。因而，通常必须在30分钟至数小时的短时期内使用这些复合物。在使用阳离子脂质作为用 于DNA递送的载体的临床试验中，在床侧混合两种成分并立即使用。结构不稳定性以及随着时间的推移脂质核酸复合物的转染活性的丧失一直是脂质介导基因疗法的未来开发的挑战。在本领域中的许多的最新发展已专注于通过结合经过证实的阳离子递送剂与另一个部分来改进阳离子系统。然而，阳离子主链共轭物(结合物)还没有成功克服毒性并且没有一种被批准用于治疗用途。国际申请公开号WO95/24929披露了基因在生物相容性基质中的封装或分散，优选可生物降解的聚合物基质，其中在延长期间内基因能够扩散出基质。优选地，基质具有以下形式微颗粒如微球体、微胶囊、薄膜、植入物、或在装置如支架上的涂层。美国专利号6，048，551披露了控释基因递送系统，其采用聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、和Ludragit R、L、和E系列的聚合物以及共聚物微球体来封装基因载体。美国申请公开号20070141134披露了可以增强多核苷酸的细胞内递送的组合物，其中可以将多核苷酸加入PEG屏蔽胶束颗粒以促进多核苷酸穿过细胞膜的递送。通过共价和非共价方式来将多核苷酸加入屏蔽胶束颗粒。还可以将其它细胞靶向剂共价偶联于屏蔽胶束颗粒以增强在体内的定位。国际专利申请公开号WO 2008/124634披露了一种方法，该方法用于在可生物降解聚合物中封装核酸，尤其是siRNA、shRNA、微RNA、基因疗法质粒、和其它寡核苷酸，从而在通过纳米沉淀来形成纳米颗粒以前将核酸配制成由无毒性和/或天然存在的脂质构成的反胶团。国际申请公开号WO 2009/127060披露一种核酸-脂质颗粒，该颗粒，除核酸以外，还包含阳离子脂质、非阳离子脂质和结合的脂质，其可以抑制颗粒的聚集。国际专利申请公开号WO 2010/007623(授权给本发明的一些发明人并在本发明的优先权日以后公布)披露了用于延长释放疏水性分子如类固醇和抗生素的组合物，该组合物包含含有可生物降解聚合物的基于脂质的基质。理想地，缓释药物递送系统应呈现通过所使用的特定赋形剂的类型和比例容易控制的动力学和其它特性。目前仍然未得到满足的需求是改善的核酸组合物和方法，用于受控和延长递送治疗性核酸药剂以接近组织和进入细胞，进而进行基因疗法。在现有技术中，并没有提出，包含脂质和生物相容性聚合物的基质组合物将具有用于递送基于核酸的药剂的改善的性能。

发明内容
本发明提供了用于延长释放核酸药剂，尤其是基于核酸的药物的组合物，该组合物包含含有生物相容性聚合物的基于脂质的基质。基质组合物特别适用于核酸药剂(核酸齐IJ)的局部递送或局部应用。本发明还提供了用来产生基质组合物的方法和用来利用基质组合物以提供活性核酸组分的受控和/或缓释的方法。本发明部分地基于以下意外的发现可以有效地将在包含聚乙二醇(PEG)的水基溶液中存在的带负电荷的核酸加载到包含至少一种生物相容性聚合物的基于脂质的基质， 其中聚合物可以是可生物降解聚合物、不可生物降解聚合物(非生物降解聚合物，不能生物降解聚合物)或它们的组合。另外，核酸可以以受控和/或延长的方式释放自基质。本发明的基质组合物优越于迄今已知的用于核酸递送的组合物和基质，这是因为它结合了核酸药剂到细胞或组织的有效局部递送和核酸药剂的受控和/或持续释放。在一个方面，本发明提供了基质组合物，该组合物包含(a)药用生物相容性聚合物连同第一脂质成分，其包含至少一种具有极性基团的脂质；(b)第二脂质成分，其包含至少一种具有至少14个碳子的脂肪酸部分的磷脂；(c)至少一种核酸药剂(试剂)；以及(d)聚乙二醇(PEG)，其中基质组合物适应于提供核酸的缓释和/或控释。具有治疗或诊断效用的任何核酸分子可以用作本发明的基质组合物的一部分。核酸药剂可以包括DNA分子、RNA分子、单链、双链、三链或四链。核酸药剂的非限制性清单包括质粒0嫩、线状0嫩(多核苷酸和寡核苷酸)、染色体0嫩、信使1 應(1111 應)、反义DNA/RNA、RNAi, siRNA、微RNA (miRNA)、核糖体RNA、锁定核酸类似物(LNA)、寡核苷酸DNA(ODN)单和双链、免疫刺激序列(ISS)、和核酶。根据本发明的核酸药剂可以包括天然分子、修饰分子或人造分子。根据某些实施方式，核酸具有与PEG的非共价相互作用。根据某些实施方式，PEG是分子量为1，000-10，000的线性PEG。根据典型的实施方式，PEG分子量为1，000-8，000，更通常低于8，000。根据本发明的教导，还可以使用生物可降解PEG分子，尤其是包含可降解间隔区并具有较高分子量的PEG分子。分子量为5，000以下的PEG分子目前被批准用于制药用途。因而，根据某些典型的实施方式，活性PEG分子具有可达5，000的分子量。根据一些实施方式，基质组合物包含至少一种阳离子脂质。根据某些实施方式，阳离子脂质选自由DC-胆固醇、1，2- 二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、二甲基双十八烷基铵(DDAB)、I, 2- 二月桂酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(乙基PC)、1，2- 二 -O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、和其它阳离子脂质组成的组。每种可能性表示本发明的单独的实施方式。根据某些实施方式，生物相容性聚合物选自由可生物降解聚合物、不可生物降解聚合物和它们的组合组成的组。根据某些实施方式，可生物降解聚合物包含聚酯，其选自由PLA(聚乳酸)、PGA(聚乙醇酸)、PLGA(聚(乳酸-共-乙醇酸))和它们的组合组成的组。根据其它实施方式，不可生物降解聚合物选自由聚乙二醇(PEG)、PEG丙烯酸酯、PEG甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸-2-乙基己酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸羟乙酯、2-甲基丙烯酰羟乙基磷酰胆碱(2-甲基丙烯酰基乙氧基磷酰胆碱)(MPC)、聚苯乙烯、衍生化聚苯乙烯、聚赖氨酸、聚N-乙基-4-乙烯基吡啶溴化物、聚甲基丙烯酸酯、硅氧烷、聚甲醛、聚氨酯、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸、和它们的单独的衍生物或它们的共聚混合物组成的组。每种可能性表示本发明的单独的实施方式。根据另外的实施方式，不可生物降解聚合物和可生物降解聚合物形成嵌段共聚物，例如，PLGA-PEG-PLGA 等。根据某些实施方式，具有极性基团的脂质选自由留醇、生育酚和磷脂酰乙醇胺组成的组。根据某些特定的实施方式，具有极性基团的脂质是留醇或其衍生物。根据典型的实施方式，留醇是胆固醇。根据某些实施方式，混合第一脂质成分与生物相容性聚合物以形成非共价缔合。·
根据某些特定的实施方式，第一脂质成分是留醇或其衍生物，而生物相容性聚合物是可生物降解聚酯。根据这些实施方式，借助于非共价键，可生物降解聚酯缔合于甾醇。根据一些实施方式，第二脂质成分包含磷脂酰胆碱(卵磷脂)或其衍生物。根据其它实施方式，第二脂质成分包含磷脂酰胆碱或其衍生物的混合物。根据另一些实施方式，第二脂质成分包含磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺或它们的衍生物的混合物。根据另外的实施方式，第二脂质成分进一步包含留醇和其衍生物。根据典型的实施方式，留醇是胆固醇。根据进一步的实施方式，第二脂质成分包含各种类型的磷脂的混合物。根据某些典型的实施方式，第二脂质成分进一步包含鞘脂、生育酚和聚乙二醇化脂质中的至少一种。根据另外的实施方式，总脂质与生物相容性聚合物的重量比为1:1以上至9:1以下。根据某些实施方式，基质组合物是均匀的(均质的，均相的)。在其它实施方式中，基质组合物具有基于脂质的基质的形式，其形状和边界由可生物降解聚合物来确定。在进一步的实施方式中，基质组合物具有植入物的形式。在某些特定的实施方式中，本发明提供了基质组合物，该组合物包含(a)可生物降解聚酯；(b)留醇；(c)磷脂酰乙醇胺，其具有至少14个碳原子的脂肪酸部分；(d)磷脂酰胆碱，其具有至少14个碳原子的脂肪酸部分；(e)核酸药剂；和(f)PEG。在某些实施方式中，基质组合物包含按重量计至少50%脂质。在某些另外的实施方式中，基质组合物进一步包含靶向部分。在某些实施方式中，基质组合物能够体内被降解成小泡，释放核酸的一些或所有质量被整合到其中。在其它实施方式中，基质组合物能够体内被降解以形成小泡，其中整合有活性剂和靶向部分。每种可能性表示本发明的单独的实施方式。根据另外的方面，本发明提供了一种药物组合物，该组合物包含本发明的基质组合物和药用赋形剂。根据某些实施方式，在除去有机溶剂和水以后，本发明的基质组合物具有植入物的形式。在另一种实施方式中，植入物是均匀的。每种可能性表示本发明的单独的实施方式。
根据某些实施方式，从本发明的组合物产生植入物的方法包括以下步骤(a)根据本发明的方法，产生散装材料(bulk material)形式的基质组合物；以及(b)将散装材料转移到期望形状的模具或固体容器中。按照另一个方面，本发明提供了用来制备用于递送以及缓释和/或控释核酸药剂的基质组合物的方法，该方法包括(a)将(i)生物相容性聚合物和(ii)包含至少一种具有极性基团的脂质的第一脂质成分混合到第一挥发性有机溶剂中；(b)将聚乙二醇混合到核酸药剂的水基溶液中；(C)将在步骤(b)中获得的溶液与第二挥发性有机溶剂和第二脂质成分混合，所述第二脂质成分包含至少一种具有至少14个碳原子的脂肪酸部分的磷脂；
(d)混合在步骤(a)和(C)中获得的溶液以形成均匀混合物；以及(e)除去挥发性溶剂和水，从而产生包含核酸药剂的均匀多聚体-磷脂基质。根据某些实施方式，步骤(C)可选地进一步包括(i)通过蒸发除去溶剂，冷冻干燥或离心，以形成沉积物；以及(ii)将获得的沉积物悬浮于第二挥发性有机溶剂中。根据在特定制剂中所使用的特定核酸和其它物质和活性核酸的预期用途，以及根据本文描述的本发明的实施方式，来选择特定溶剂。按照核酸所期望的释放速率并根据本文描述的本发明的实施方式来选择形成本发明的基质的特定脂质。通常在根据所获得的溶液的性能确定的受控温度下通过蒸发来除去溶剂。利用真空进一步除去有机溶剂和水的残留物。根据本发明，不同类型的挥发性有机溶液的使用使得能够形成均匀的防水的基于脂质的基质组合物。根据各种实施方式，第一和第二溶剂可以是相同或不同的。根据一些实施方式，一种溶剂可以是非极性溶液而其它溶剂优选为水混溶性溶剂。根据某些实施方式，基质组合物是基本上没有水。术语〃基本上没有水〃是指包含按重量计小于1%水的组合物。在另一种实施方式中，该术语是指包含按重量计小于O. 8%水的组合物。在另一种实施方式中，该术语是指包含按重量计小于O. 6%水的组合物。在另一种实施方式中，该术语是指包含按重量计小于O. 4%水的组合物。在另一种实施方式中，该术语是指包含按重量计小于O. 2%水的组合物。在另一种实施方式中，该术语是指不存在影响基质的防水性能的水量。每种可能性表示本发明的单独的实施方式。在其它实施方式中，基质组合物是基本上没有水。〃基本上没有〃是指包含按重量计小于O. 1%水的组合物。在另一种实施方式中，该术语是指包含按重量计小于O. 08%水的组合物。在另一种实施方式中，该术语是指包含按重量计小于O. 06%水的组合物。在另一种实施方式中，该术语是指包含按重量计小于O. 04%水的组合物。在另一种实施方式中，该术语是指包含按重量计小于O. 02%水的组合物。在另一种实施方式中，该术语是指包含按重量计小于O. 01%水的组合物。每种可能性表示本发明的单独的实施方式。在另一种实施方式中，基质组合物没有水。在另一种实施方式中，该术语是指不包含可检出量水的组合物。每种可能性表示本发明的单独的实施方式。根据某些典型的实施方式，本发明提供了制备基质组合物的方法，该方法包括以下步骤
(a)将⑴可生物降解聚酯与(ii)甾醇混合到非极性挥发性有机溶剂中；(b)将分子量为1，000-8, 000的聚乙二醇混合到核酸药剂的水基溶液中；(c)混合在步骤(b)中获得的溶液与水混溶性挥发性有机溶剂，所述有机溶剂包含磷脂酰乙醇胺和/或磷脂酰胆碱和/或留醇；以及(d)混合在步骤(a)和(C)中获得的溶液以形成均匀混合物；(e)除去有机溶剂和水；以及(f)通过真空进一步除去剩余溶剂。根据某些实施方式，可生物降解聚酯选自由PLA、PGA和PLGA组成的组。在其它实 施方式中，可生物降解聚酯是本领域已知的任何其它适宜的可生物降解聚酯或聚胺。在另外的实施方式中，在混合与水混溶性挥发性有机溶剂混合物以前，均化包含非极性有机溶剂的混合物。在其它实施方式中，在混合与包含非极性有机溶剂的混合物以前，均化包含水混溶性有机溶剂的混合物。在某些实施方式中，在步骤(a)的混合物中的聚合物是脂质饱和的。在另外的实施方式中，基质组合物是脂质饱和的。每种可能性表示本发明的单独的实施方式。本发明的基质组合物可以用于完全或部分地涂布不同基体(基底，衬底，底物)的表面。根据某些实施方式，待涂布的基体包括至少一种材料，该材料选自由碳纤维、不锈钢、钴铬、钛合金、钽、陶瓷和胶原或明胶组成的组。在其它实施方式中，基体可以包括任何医疗装置和骨填料颗粒。骨填料颗粒可以是任何以下一种同种异体骨颗粒(即，来自人源)、异种骨颗粒(即，来自动物源)和人工骨颗粒。在其它实施方式中，利用涂布基体的治疗和涂布基体的给予将按照本领域已知的用于类似的未涂布基体的治疗和给予的程序。必须强调的是，可以考虑到以下4个主要因素来计划利用本发明的组合物的缓释期(i)聚合物和脂质含量之间的重量比，尤其是具有至少14个碳原子的脂肪酸部分的磷脂；( )生物聚合物和脂质的生化和/或生物物理特性；(iii)在给定组合物中所使用的不同脂质之间的比例；以及(iv)核酸药剂与聚乙二醇的温育时间。具体地，应考虑聚合物的降解速率和脂质的流动性。例如，PLGA(85:15)聚合物将比PLGA(50:50)聚合物更慢地降解。在体温下，磷脂酰胆碱(14:0)比磷脂酰胆碱(18:0)是更为流体的(更小刚性和更少有序的)。因此，例如，与加入由PLGA(50:50)和磷脂酰胆碱(14:0)构成的基质中的核酸药剂的释放速率相比，加入包含PLGA(85:15)和磷脂酰胆碱(18:0)的基质组合物中的核酸药剂的释放速率将更慢。将确定释放速率的另一个方面是核酸的物理特性。另外，通过在第二脂质成分的配方中添加其它脂质可以进一步控制核酸药齐U，尤其是基于核酸的药物的释放速率。这可以包括不同长度的脂肪酸如月桂酸(C12:0)、膜活性留醇(如胆固醇)或其它磷脂如磷脂酰乙醇胺。核酸药剂与聚乙二醇的温育时间会影响核酸从基质的释放速率。较长温育时间(许多小时)导致较高释放速率。根据各种实施方式，经所期望的数天至数月的时间，活性剂释放自组合物。根据某些实施方式，至少30%的基于核酸的药剂以零级动力学释放自基质组合物。根据其它实施方式，至少50%的基于核酸的药剂以零级动力学释放自组合物。根据下文的本发明的详细描述，本发明的这些和其它特点和优点将变得更容易理解和显而易见。


图I是标准曲线，其示出在ssDNA浓度和连接于ssDNA的5’端的荧光探针的荧光强度之间的关系。图2示出随着时间的推移(天数)加载到在没有聚乙二醇(PEG)的情况下制备的基质组合物中的ssDNA的释放速率。相对于加载的ssDNA的估计量来归一化释放速率。图3A和3B表示光学显微镜(X400)图片，其示出在来自实施例2中描述的基质组合物的ssDNA的水合以后释放的脂小泡。图3A示出在水合以后释放到介质中的典型的脂小泡。图3B示出来自相同小泡的绿色荧光发射，其表明这些小泡包含荧光探针。图4示出用释放自基质组合物的ssDNA扩增的PCR产物的琼脂糖凝胶。
图5示出通过基因扫描分析测得的释放自基质组合物的ssDNA的大小。图6示出在ssDNA和PEG的不同温育时间下随着时间的推移(天数)加载到用聚乙二醇(PEG)制备的基质组合物中的ssDNA的释放速率。图7示出在基质组合物内使用具有不同长度的脂肪酸链作为主要脂质的磷脂对加载的ssDNA的释放速率的影响。
具体实施例方式本发明提供了用于延长释放和/或控释核酸的组合物，该组合物包含含有生物相容性聚合物的基于脂质的基质。尤其是，本发明的基质组合物适用于核酸的局部释放。本发明还提供了制备基质组合物的方法以及利用基质组合物来在对需要其的受试者体内提供活性组分的控释的方法。根据一个方面，本发明提供了一种基质组合物，该组合物包含(a)药用生物相容性聚合物连同第一脂质成分，所述第一脂质成分包含至少一种具有极性基团的脂质；(b)第二脂质成分，其包含至少一种具有至少14个碳原子的脂肪酸部分的磷脂；(c)至少一种核酸药剂；以及(d)聚乙二醇(PEG)，其中基质组合物适于提供核酸的缓释。根据某些实施方式，生物相容性聚合物是可生物降解的。根据其它实施方式，生物相容性聚合物是非生物可降解的。根据另外的实施方式，生物相容性聚合物包含生物可降解和不可生物降解聚合物的组合，可选地作为嵌段共聚物。根据某些实施方式，本发明提供了一种基质组合物，该组合物包含(a)药用可生物降解聚酯；(b)磷脂，其具有至少14个碳原子的脂肪酸部分；(c)药物活性核酸药剂；以及(d)PEG。核酸药剂包含具有治疗或诊断效用的任何核酸分子。根据一些实施方式，核酸药剂包含DNA分子、RNA分子、单链、双链、三链或四链。根据其它实施方式，基于核酸的药剂选自由质粒DNA、线状DNA(多核苷酸和寡核苷酸)、染色体DNA、信使RNA(mRNA)、反义DNA/RNA、RNAi, siRNA、微RNA (miRNA)、核糖体RNA、锁定核酸类似物(LNA)、单和双链寡核苷酸DNA(ODN)、免疫刺激序列(ISS)、和核酶组成的组。根据某些典型的实施方式，核酸药剂用于治疗用途。根据一些实施方式，脂质饱和的基质组合物包含至少一种阳离子脂质。术语“阳离子脂质”是指任何数目的脂质物质，其在所选PH值(如生理pH值)下携带净正电荷。这样的脂质包括但不限于N，N- 二油基-N，N- 二甲基氯化铵(“DODAC”)；N-(2, 3- 二油基氧基)丙基)-N, N, N-三甲基氯化铵("DOTMA") ；N, N- 二硬脂酰-N, N- 二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(2，3- 二油酰基氧基)丙基)_N，N, N-三甲基氯化铵(“DOTAP”);3-(N_(N，，N’ -二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基)胆固醇(“DC-ChoI”)和N-(I，2-二肉豆蘧基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”) 。另外，可获得阳离子脂质的许多商业制剂，其可以用于本发明。这些商业制剂包括，例如，UP0FEGT丨N1;(市售阳离子脂质体，其包含DOTMA 和 I, 2- 二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(“DOPE”)，来自 GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y., USA) iLIPOFECTAMINE"(市售阳离子脂质体，其包含N-(I-(2，3-二油基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰胺)乙基)N，N-二甲基三氟乙酸铵(“D0SPA”)和(“DOPE”)，来自GIBC0/BRL);以及TRANSFEC.TAM (市售阳离子脂质，其包含在乙醇中的双十八烷基酰胺基甘氨酰羧基精胺(“DOGS”)，来自Promega Corp.，Madison, ffis.，USA)。在生理pH值以下，以下脂质是阳离子脂质并具有正电荷DODAP、DODMA、DMDMA等。不希望受限于任何具体理论或作用机制，基质的阳离子脂质可以促进将本发明的基质(包含核酸药剂)内化到细胞或组织中。根据某些实施方式，细胞和/或组织形成人体的一部分。根据其它实施方式，可生物降解聚合物包含阳离子聚合物，如阳离子化瓜尔胶、二烯丙基季铵盐/丙烯酰胺共聚物、季铵化聚乙烯吡咯烷酮和它们的衍生物、以及各种聚季铵盐化合物。根据某些实施方式，第二脂质成分的磷脂是具有至少14个碳原子的脂肪酸部分的磷脂酰胆碱。在另一种实施方式中，第二脂质成分的磷脂进一步包含具有至少14个碳原子的脂肪酸部分的磷脂酰乙醇胺。在另一种实施方式中，第二脂质成分的磷脂进一步包括甾醇，尤其是胆固醇。在某些实施方式中，基质组合物是脂质饱和的。如在本文中所使用的，“脂质饱和的”是指在基质组合物的聚合物中脂质(包括磷脂)的饱和度，连同在基质中存在的任何核酸药剂和可选的靶向部分，以及可以存在的任何其它脂质。基质组合物由存在的无论什么脂质来饱和。本发明的脂质饱和基质呈现另外的优点不需要合成乳化剂或表面活性剂如聚乙烯醇；因而，本发明的组合物通常基本上没有聚乙烯醇。为获得脂质饱和度来确定聚合物脂质比率的方法和确定基质的脂质饱和度的方法在本领域中是已知的。在其它实施方式中，基质组合物是均匀的。在另外的实施方式中，基质组合物具有脂质饱和基质的形式，其形状和边界由可生物降解聚合物来确定。根据某些实施方式，基质组合物具有植入物的形式。在某些特定的实施方式中，本发明提供了一种基质组合物，该组合物包含(a)可生物降解聚酯；(b)留醇；(c)具有至少14个碳原子的脂肪酸部分的磷脂酰乙醇胺；(d)具有至少14个碳原子的脂肪酸部分的磷脂酰胆碱；(e)至少一种基于核酸的药物；以及(f)PEG。在其它典型的实施方式中，基质组合物是脂质饱和的。在其它典型的实施方式中，本发明提供了一种基质组合物，该组合物包含(a)可生物降解聚酯；(b)留醇；(c)具有至少14个碳原子的脂肪酸部分的磷脂酰乙醇胺；(d)具有至少14个碳原子的脂肪酸部分的磷脂酰胆碱；(e)基于核酸的活性剂；以及(f)PEG。根据某些实施方式，可生物降解聚酯经由非共价键而缔合于甾醇。如在本文中所提供的，本发明的基质能够被模塑成具有不同厚度和形状的三维构造。因此，可以产生成形的基质以呈现特定的形状，包括球体、立方体、棒、管、片、或带子。在基质的制备期间采用冷冻干燥步骤的情况下，形状取决于模具或支撑物的形状，上述模具或支撑物可以制造自任何惰性材料并且可以在所有侧面(对于球体或立方体)或在有限数目的侧面(对于片)接触基质。当植入物设计需要时，可以将基质成形为体腔的形式。借助于剪刀、解剖刀、激光束或任何其它切割仪器来除去部分基质可以产生三维结构所需要的任何完善。每种可能性表示本发明的单独的实施方式。根据另外的实施方式，本发明的基质组合物提供了骨移植材料的涂层。根据某种实施方式，骨移植材料选自由同种异体移植物、异质移植物、和异种移植物组成的组。根据另外的实施方式，本发明的基质可以结合于胶原或胶原基质蛋白。MM“磷脂酰胆碱”是指具有磷酸胆碱首基的磷酸甘油酯。在另一种实施方式中，磷脂酰胆碱化合物具有以下结构
权利要求
1.一种基质组合物，包含 a.生物相容性聚合物连同第一脂质成分，所述第一脂质成分包含至少一种具有极性基团的脂质； b.第二脂质成分，所述第二脂质成分包含具有至少14个碳的脂肪酸部分的至少一种憐脂；和 c.至少一种基于核酸的药剂；以及 d.聚乙二醇(PEG)； 其中所述基质组合物适于提供核酸成分的缓释和/或控释。
2.根据权利要求I所述的基质组合物，其中，所述PEG是分子量在1，000-10,000范围内的线性PEG。
3.根据权利要求2所述的基质组合物，其中，所述PEG具有可达5，000的分子量。
4.根据权利要求I所述的基质组合物，其中，所述具有极性基团的脂质选自由留醇、生育酚、磷脂酰乙醇胺和它们的衍生物组成的组。
5.根据权利要求4所述的基质组合物，其中，所述留醇是胆固醇。
6.根据权利要求5所述的基质组合物，其中，所述胆固醇以所述基质组合物的总脂质含量的5-50摩尔％的量存在。
7.根据权利要求I所述的基质组合物，其中，所述第二脂质成分包括选自由磷脂酰胆碱或其衍生物；磷脂酰胆碱或其衍生物的混合物； 磷脂酰乙醇胺或其衍生物；以及它们的任意组合组成的组中的磷脂。
8.根据权利要求I所述的基质组合物，还包含阳离子脂质，所述阳离子脂质选自由DC-胆固醇、1，2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、二甲基双十八烷基铵(DDAB)、1, 2- 二月桂酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(乙基PC)、1，2- 二 -O-十八烯基_3_三甲基铵丙烷(DOTMA)以及它们的任意组合组成的组。
9.根据权利要求I所述的基质组合物，其中，所述生物相容性聚合物选自由可生物降解聚合物、不可生物降解聚合物和它们的组合组成的组。
10.根据权利要求9所述的基质组合物，其中，所述可生物降解聚合物是可生物降解聚酯，所述可生物降解聚酯选自由PLA (聚乳酸)、PGA (聚乙醇酸)、PLGA (聚(乳酸共乙醇酸))和它们的组合组成的组。
11.根据权利要求10所述的基质组合物，其中，所述不可生物降解聚合物选自由聚乙二醇(PEG)、PEG丙烯酸酯、PEG甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸-2-乙基己酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸羟乙酯、2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酰胆碱(MPC)、聚苯乙烯、衍生化聚苯乙烯、聚赖氨酸、聚N-乙基-4-乙烯基-吡啶溴化物、聚甲基丙烯酸酯、硅酮、聚甲醛、聚氨酯、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸和它们的组合组成的组。
12.根据权利要求11所述的基质组合物，其中，所述生物相容性聚合物包含可生物降解聚合物和不可生物降解聚合物的共嵌段。
13.根据权利要求I所述的基质组合物，其中，总脂质与所述可生物降解聚合物的重量比为1:1以上至9:1以下。
14.根据权利要求I所述的基质组合物，其中，所述基质组合物是均匀的。
15.根据权利要求I所述的基质组合物，还包含鞘脂。
16.根据权利要求I所述的基质组合物，还包含生育酚。
17.根据权利要求I所述的基质组合物，其中，所述基质组合物基本上没有水。
18.根据权利要求I所述的基质组合物，还包含选自由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、和磷脂酰肌醇组成的组中的另外的磷脂。
19.根据权利要求I所述的基质组合物，还包含具有14个以上碳原子的游离脂肪酸。
20.根据权利要求I所述的基质组合物，还包含聚乙二醇化脂质。
21.根据权利要求I所述的基质组合物，用于所述基于核酸的药剂的缓释，其中至少 30%的所述药剂以零级动力学从所述组合物释放。
22.根据权利要求21所述的基质组合物，用于所述基于核酸的药剂的缓释，其中至少50%的所述药剂以零级动力学从所述组合物释放。
23.根据权利要求I所述的基质组合物，其中，所述基于核酸的药剂选自由质粒DNA、选自多核苷酸和寡核苷酸的线状DNA、染色体DNA、信使RNA (mRNA)、反义DNA/RNA、RNAi,siRNA、微RNA (miRNA)、核糖体RNA、寡核苷酸DNA (ODN)单和双链、siRNA、CpG免疫刺激序列(ISS)、锁定核酸(LNA)以及核酶组成的组。
24.根据权利要求I所述的基质组合物，所述基质包含(a)可生物降解聚酯；(b)甾醇；(c)具有至少14个碳的脂肪酸部分的磷脂酰乙醇胺；(d)具有至少14个碳的脂肪酸部分的磷脂酰胆碱；(e)核酸药剂；以及(f) PEG。
25.一种植入物，包含根据权利要求I所述的基质组合物。
26.一种用于将基于核酸的药剂给予需要其的受试者的药物组合物，包含根据权利要求I所述的基质组合物。
27.一种用于将基于核酸的药剂给予需要其的受试者的方法，所述方法包括将根据权利要求I所述的基质组合物给予所述受试者，从而将基于核酸的药剂给予需要其的受试者的步骤。
28.一种医疗装置，包括基体和沉积在所述基体的至少一部分上的生物相容性涂层，其中所述生物相容性涂层包含根据权利要求I所述的基质组合物。
29.根据权利要求28所述的医疗装置，其中，所述生物相容性涂层包括多层。
30.一种生产用于核酸药剂的递送和缓释和/或控释的基质组合物的方法，包括以下步骤 a.将(i)生物相容性聚合物和(ii)包含至少一种具有极性基团的脂质的第一脂质成分混合到第一挥发性有机溶剂中； b.将聚乙二醇混合到所述核酸药剂的水基溶液中； c.将在步骤(b)中获得的溶液与第二挥发性有机溶剂和包含至少一种磷脂的第二脂质成分混合，其中所述磷脂具有至少14个碳的脂肪酸部分； d.混合在步骤(a)和(c)中获得的溶液以形成均匀混合物； 以及 e.除去所述挥发性溶剂和水， 从而生产包含所述核酸药剂的均匀聚合物-磷脂基质。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，步骤(c)还包括(i)通过蒸发、冷冻干燥或离心来除去所述溶剂以形成沉积物；以及(ii)将所得的沉积物悬浮在所述第二挥发性有机溶剂中。
32.根据权利要求30所述的方法，其中，所述PEG是分子量在1，000-10，000范围内的线性PEG。
33.根据权利要求30所述的方法，其中，具有极性基团的所述脂质选自由留醇、生育酚、磷脂酰乙醇胺和它们的衍生物组成的组。
34.根据权利要求30所述的方法，其中，所述第二脂质成分包含选自由磷脂酰胆碱或其衍生物；磷脂酰胆碱或其衍生物的混合物；磷脂酰乙醇胺或其衍生物；以及它们的任意组合组成的组中的磷脂。
35.根据权利要求30所述的方法，其中，所述生物相容性聚合物选自由可生物降解聚合物、不可生物降解聚合物和它们的组合组成的组。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述可生物降解聚合物是选自由PLA(聚乳酸)、PGA (聚乙醇酸)、PLGA (聚(乳酸-共-乙醇酸))、阳离子生物相容性聚合物和它们的组合组成的组中的可生物降解聚酯。
37.根据权利要求35所述的方法，其中，所述不可生物降解聚合物选自由聚乙二醇(PEG)、PEG丙烯酸酯、PEG甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸-2-乙基己酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸羟乙酯、2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酰胆碱(MPC)、聚苯乙烯、衍生化聚苯乙烯、聚赖氨酸、聚N-乙基-4-乙烯基-吡啶溴化物、聚甲基丙烯酸酯、硅酮、聚甲醛、聚氨酯、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸和它们的组合组成的组。
38.根据权利要求30所述的方法，其中，在步骤(d)以后，将所获得的溶液注入到液氮中，到水或热空气(喷雾干燥器)，以产生小泡。
39.根据权利要求30所述的方法，其中，在步骤(d)以后，将所获得的溶液引入到模具中，并随后除去液体，以获得特定结构的基质。
全文摘要
本发明提供了用于延长释放核酸药剂，一种可生物降解聚合物的组合物。本发明还提供了生产基质组合物的方法和用于利用基质组合物来提供核酸药剂的控释的方法。
文档编号A61K9/00GK102892406SQ201180006572
公开日2013年1月23日 申请日期2011年1月18日 优先权日2010年1月19日
发明者诺姆·埃马努埃尔, 优素福·波森菲尔德 申请人:波利皮得有限公司