专利名称：结合转化生长因子α且对Ras基因突变的癌具有增殖抑制活性的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及结合转化生长因子a (Transforming growth factor alpha,以下称为“TGFa ”)、并具有在体内抑制Ras蛋白质具有突变的癌细胞增殖的效果的单克隆抗体，以及含有该抗体的抗癌剂。
背景技术：
TGFa是1980年初期由Spawn ( ^ — )和Roberts (罗伯茨)等的小组，自小鼠肉瘤病毒转化的小鼠3T3细胞的培养上清中，作为对于软琼脂中诱导正常大鼠肾脏成纤维细胞(NRK细胞)集落形成所必要的2种因子之一而分离、精制的(非专利文献1-6)。
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TGFa作为由160个氨基酸组成的前体多肽生物合成，在细胞内糖链修饰以及棕榈酰化后，作为I型膜贯通蛋白质在细胞膜表面表达(膜型TGF a )(非专利文献7)。其后，细胞外结构域受到TACE/ADAM17等金属蛋白酶切断，由第40位至第89位的50个氨基酸(约6kDa)构成的单一多肽作为分泌型TGFa而游离(非专利文献8_10)。分泌型TGFa具有通过6个半胱氨酸残基于3个地方进行二硫键合的特征性结构(非专利文献11-13)。该结构最初在上皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF)中发现，以后称为EGF样结构域。具有EGF样结构域的蛋白质，除了 TGFa和EGF之外，还有双调蛋白(amphiregulin) >HB-EGF> β -动物纤维素、上皮调节蛋白(epiregulin)、epigen、神经调节蛋白-1、神经调节蛋白-2、神经调节蛋白-3、神经调节蛋白-4、神经调节蛋白-5以及神经调节蛋白_6(以下将神经调节蛋白-1 -6称为神经调节蛋白)，共计存在13种具有EGF样结构域的蛋白质，这些总称为EGF家族分子(非专利文献10、非专利文献14)。EGF家族分子与TGFa同样，全部作为I型膜蛋白质生物合成，细胞外结构域通过蛋白酶分解而成为游离型(非专利文献10)。物种间的氨基酸同源性高，EGF样结构域构造也是保守的。例如，人与小鼠的TGFa氨基酸同源性为92%，人TGFa作用于小鼠或大鼠(非专利文献15)。EGF家族分子作为直接结合受体型酪氨酸激酶EGF受体(EGFR)家族(别名ErbB家族)的配体发挥作用。EGFR家族根据结构上的类似性目前鉴定为4种，分别称为EGFR(ErbBl)、HER2 (ErbB2)、HER3 (ErbB3)以及 HER4 (ErbB4)(非专利文献 14、16)。存在的13种EGF家族分子中，作为结合EGFR的配体已知有TGF a、EGF、双调蛋白、β -动物纤维素、上皮调节蛋白(epiregulin)等。神经调节蛋白结合HER3,神经调节蛋白，β-动物纤维素、HB-EGF结合HER4。HER2不具有配体结合部位(非专利文献14，16)。EGF家族分子结合作为受体的EGFR家族分子后，受体形成二聚体的同时，通过位于细胞内结构域的酪氨酸激酶诱导酪氨酸残基磷酸化(非专利文献16)。接着将细胞内各种各样的蛋白质以级联状进行活化。作为这样的级联途径的代表例，已知有Ras/Raf/MAPK途径、PI3K/Akt/mT0R途径以及JAK-STAT途径。Ras/Raf/MAPK途径主要参与细胞的增殖和生存，PI3K/Akt/mT0R途径参与细胞生长或抗程序性细胞死亡、细胞浸润、细胞游走等(非专利文献17)。
向软琼脂中的大鼠正常成纤维细胞Rat-1添加分泌型TGFa时，Rat-1的细胞形态变化为转化细胞样，在琼脂中形成集落(非专利文献15)。另外，导入了 TGFa基因的CHO细胞也成为转化样细胞，移植至裸小鼠时容易形成肿瘤(非专利文献9)。可如下理解，此时CHO细胞表面上的EGFR通过有意地磷酸化，CHO分泌的TGF α自分泌性地诱导细胞增殖。作为TGFa的其他生理功能，已知有作为强力的血管新生诱导因子的功能。认为是通过TGFa作用于在血管内皮细胞表达的EGFR，诱导血管内皮细胞的游走和增殖(非专利文献 18-21)。健康正常人的TGFa的成体内分布特征是，在呼吸道上皮或大肠的粘膜上皮等的粘膜上皮细胞表达(非专利文献22-24)。该表达模式类似于EGFR的表达模式。另一方面，对于癌，以实体肿瘤为中心，广泛知道TGFa的过量表达(非专利文献22、23)。在头颈部癌、肺癌、乳癌、胃癌、大肠癌、肾脏癌、肝癌、卵巢癌、黑素瘤等各种各样的癌种类中确认在mRNA以及蛋白质水平上TGF α的表达增强。据报导，作为受体的EGFR也在各种癌组织中确认有过量表达，特别是在非小细胞肺癌或头颈部扁平上皮癌、肾癌中TGFa与EGFR的表达量正 相关(非专利文献25-29)。在实体瘤的周边部位由形成被称为间质的癌细胞立脚点的基质(stroma)(主要是成纤维细胞)和运送营养的血管所构成的组织发育。使用抗TGFa抗体进行癌组织的免疫组织染色的结果可知，TGFa不仅在癌部位存在，在间质也存在(非专利文献25、29)。由此认为TGFa不仅诱导癌细胞的自分泌性增殖，还通过作为支持癌生长的间质的生长因子发挥功能，有助于癌的恶性化(非专利文献18-21、30)。如上所述，含有TGF α的EGF家族分子或作为其受体的EGFR —定参与癌的增殖。因此，当然地期待将TGF α或EGFR作为靶标来控制癌细胞的增殖(非专利文献16_17、31)。1980年代初开始了将EGFR作为癌治疗靶标的单克隆抗体的研究(非专利文献32-34)。开发了与作为配体的EGF竞争结合、具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化、二聚体化的活性的单克隆抗体西妥昔单抗(cetuximab :商品名艾比特思(Erbitux))(非专利文献35、36)。西妥昔单抗抑制以A431细胞为首的培养癌细胞的增殖，确认在小鼠荷瘤模型中也发挥抗肿瘤效果，1990年以扁平上皮肺癌患者为对象开始了临床试验。在2001-2002年进行的随机比较临床试验中证明了对于大肠癌的效果，在2003年作为对于转移性大肠癌的治疗剂在瑞士开始受到认可。FDA也在2004年承认其作为对于表达EGFR的转移性大肠癌的治疗剂，在2006年追加承认其作为表达EGFR的头颈部癌的治疗剂。在日本于2008年作为EGFR阳性的不能治愈切除的进行性和/或再发性结肠直肠癌的治疗剂受到厚生劳动省的制造销售承认(非专利文献37)。作为同样与EGFR结合来抑制癌增殖的抗EGFR单克隆抗体已知有帕尼单抗(panitumumab)(品名Vectibix,安进公司(Amgen))(非专利文献38)。帕尼单抗(panitumumab)在欧美与西妥昔单抗同样地作为EGFR阳性的进行性和/或再发性大肠癌的治疗剂使用。任一抗EGFR封闭抗体都可改善化学疗法无效的大肠癌患者的总生存期间和无病情恶化生存期间，维持生活的质量，因此期望对于其他的EGFR阳性癌的适应扩大(非专利文献31、35、39)。但是，另一方面，西妥昔单抗抵抗性的大肠癌的频率高，50%以上的患者发现大肠癌的病情恶化(非专利文献40-41)。对于该西妥昔单抗抵抗性，指出与K-Ras基因突变相关。即，位于EGFR的下游的K-Ras的基因存在突变时，与西妥昔单抗或帕尼单抗(panitumumab)是否封闭了 EGFR无关,细胞活化,癌维持增殖(非专利文献42)。
1960年代自大鼠的Kirusten肉瘤病毒、Harbey肉瘤病毒分离出作为癌基因的K-Ras以及H-Ras。其后，从人膀胱癌细胞株分离出活性型H_Ras、从人肺癌细胞株分离出活性型K-Ras、从神经母细胞瘤分离出活性型N-Ras (非专利文献43_44)。这3种Ras基因的基因产物的同源性高达约85%。正常细胞的Ras基因产物是一种具有GTPase活性的低分子G蛋白，具有促进细胞增殖的作用。该Ras基因发生点突变时，所编码的氨基酸发生错义突变，存在本来的GTPase活性降低的情况。特别地，提示了密码子第12位或者第13位的甘氨酸残基的点突变与肿瘤化的关联，大肠癌患者中约40%确认密码子12或者13突变(非专利文献40)。认为该突变型Ras蛋白质由于维持了 GTP结合的活性型，向下游连续不断地传送信号，引起异常的细胞增殖或肿瘤化(非专利文献45)。此时以TGFa为首的各种EGF家族分子过量地表达，因此认为这加速癌细胞的增殖，增强了癌的增大(非专利文献46)。在K-Ras基因有突变的场合，即使使用西妥昔单抗或帕尼单抗也不能期待效果，仅承担副作用的风险。因此，这些治疗药物，在欧洲有仅限用于没有K-Ras基因突变的患者这样的附加条件。在日本使用西妥昔单抗时，期待效果地推荐以K-Ras基因正常的患者作为对象。作为其他的EGFR抑制剂，已知抑制存在于细胞内结构域的酪氨酸激酶的作用的低 分子剂吉非替尼(gefitinib)(商品名易瑞沙(Iressa))或厄洛替尼(erlotinib)(商品名特罗凯(Tarceva))，有报道这些治疗药物在具有K-Ras突变的患者中也效果不良(非专利文献39，47-48)。另一方面，在我们知道的范围里不存在以位于EGFR上游的TGFa作为靶标的单克隆抗体来对于来源于实际的癌患者的癌细胞抑制其增殖这样的报道或对于移植了人癌细胞的荷瘤模型小鼠抑制了肿瘤形成这样的报道。但是，存在使用针对TGF α的单克隆抗体抑制软琼脂中接种的培养细胞形成集落的例子。1986年Rosenthal等使用针对人TGF α的单克隆抗体TGF-a I进行了以下实验。正常大鼠成纤维细胞Rat-1在软琼脂中几乎不形成集落，但添加人TGF α时，容易诱导形成集落。另外强制性地导入人TGF α基因而建立的Rat-1细胞株的克隆16和克隆42也获得集落形成能力。在该培养体系中添加抗TGFa抗体的TGF-α I时阻止集落形成。另一方面，导入了活性型Ras基因的Rat-1也获得集落形成能力。但是，即使在该培养体系中添加抗TGFa抗体的TGF-a I也不能阻止集落形成(非专利文献15)。1990年由Ciardiello等实施了同样的实验(非专利文献49)。在正常乳腺上皮细胞的MCFlOA中导入TGFa基因，建立高表达TGFa的细胞株MCFlOA TGFaC13(以下称为C13)以及MCFlOA TGFaC14(以下称为C14)。亲本的MCFlOA细胞在软琼脂中几乎不形成集落，但C13和C14具有高的集落形成能力。在培养体系添加抗TGF α单克隆抗体Tabl时，C13以及C14的集落形成受抗体浓度依赖性抑制(抗体浓度50 μ g/mL以上阻止约90%集落形成)。在该实验体系中，EGFR的封闭抗体克隆528在通过抗体浓度进行评价的场合，与Tabl相比达到10倍以上强的抑制集落形成(抗体浓度5 μ g/mL以上时阻止90%以上集落形成)。在MCFlOA中导入活性型Ras基因建立的细胞株MCFlOA Ha_rasCll以及MCFlOAHa-ras C12在高表达TGFa的同时获得高的集落形成能力。这些活性型Ras导入细胞与上述的TGF α导入细胞相比，对EGFR封闭抗体和抗TGF α抗体显示强的抵抗性。EGFR的封闭抗体528在抗体浓度5 μ g/mL时仅达成60-70%左右的集落形成抑制，至于抗TGFa抗体Tabl,在50 μ g/mL 100 μ g/mL的抗体浓度也仅达成50%左右的集落形成抑制。1989 年 Oncogene Science 公司(才 >-'7'— >寸4工>7 公司)的 Sorvillo等取得了多个抗TGFa单克隆抗体的专利(专利文献I)。在专利说明书中，有关于克隆213-4. 4、克隆134A-2B3以及克隆137-178的针对TGF α的反应特异性的记载，但是没有关于通过这些抗体抑制TGF α生理功能的数据或者针对TGF α表达细胞的增殖抑制的数据。在1990年同一研究组对于专利说明书中记载的某种抗TGF α抗体以论文进行报道(非专利文献50)。在该论文中，显示了克隆189-2130抑制TGFa结合EGFR的效果，但是没有触及针对TGF α表达细胞或Ras突变癌增殖的影响等。如以上那样，目前为止关于癌细胞的增殖控制，不能期待针对存在于EGFR上游的TGFa的抗体比含有EGFR封闭抗体的EGFR抑制剂也显示优异的效果。进一步地，含有Ras的EGFR下游对于连续不断地活化的癌细胞，即使封闭位于上游的EGFR或进而封闭存在于上游的TGF α ,抑制癌细胞的增殖是更加困难的，目前为止这已成为常识(非专利文献31,46)。实际上在广泛的肿瘤中报道了 Ras的基因突变。人的癌全体的平均17-25%的患者中有K-Ras基因突变(非专利文献51)。特别是大肠癌中35-40%、肺癌中35%、甲状腺癌中55%以及胰癌中80-90%的患者发现基因突变(非专利文献52-53)。如上所述Ras基因的活性型突变成为对于含有西妥昔单抗或帕尼单抗的各种EGFR抑制剂显示强的耐性的原因(非专利文献42、54)。开发对于对现有药物抵抗性高的Ras突变癌的治疗药是直接关乎提高人类生活的重要课题，很多的癌患者以及医生们也强烈期待。但是，现在为止，不存在用于治疗Ras突变癌的有效手段。现有技术文献专利文献专利文献1:美国专利第5190858号公报非专利文献非专利文献I Proc. Natl. Acad. Sc1. USA (1978) 75，4001-4005非专利文献2 Proc. Natl. Acad. Sc1. USA (1980) 77，3494-3498非专利文献3 =Nature (1982) 295，417-419非专利文献4 :Cancer Res. (1982)42,4776-4778非专利文献5 Proc. Natl. Acad. Sc1. USA (1983) 80，4684-4688非专利文献6 Proc. Natl. Acad. Sc1. USA (1983) 80，6264-6268非专利文献7 J. Cell Biol. (1994) 125,903-916非专利文献8 Proc. Natl. Acad. Sc1. USA (1991) 88,1726-1730非专利文献9 EMB0 J. (2003) 22，1114-1124非专利文献10 =Cancer Sc1. (2008) 99，214-220非专利文献11 Proc. Natl. Acad. Sc1. USA (1986) 83，8082-8086非专利文献I2 Biochem. (1993)32,7334-7353非专利文献13 Cell (2002) 110, 763-773非专利文献14 Exp. Cell Res. (2003) 284，2-13
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发明内容
发明要解决的课题本发明是鉴于上述情况而完成，其目的在于，提供对Ras基因有突变的癌细胞具有优异的增殖抑制效果的抗体。进而本发明的目的在于，提供将这样的抗体作为有效成分的抗癌剂。解决课题的手段本发明人们为了达成上述课题反复深入研究的 结果，发现在对天然型TGFa显示反应性的抗体中，与G79A置换型TGF α的反应性低的抗体对Ras基因中具有突变的癌细胞具有优异的增殖抑制效果。进而，本发明人们发现，这些抗体很多具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性和/或抑制引诱血管内皮细胞的活性，从而完成本发明。S卩，本发明涉及对Ras基因中具有突变的癌细胞具有优异的增殖抑制效果的抗TGF α抗体、以及其制造方法和用途，更详细地说，提供下述的发明。〈1>针对人TGFa的抗体，所述抗体是对Ras基因中具有突变的癌细胞显示增殖抑制活性的抗体。〈2>与天然型人TGFa比较，与79位的甘氨酸具有突变的人TGF α的反应性低的抗体。<3>根据〈2>所述的抗体，其中，79位的甘氨酸具有突变的人TGFa是G79A置换型的人TGF α。<4>根据〈1> 〈3>的任一项所述的抗体，其具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性。<5>根据〈1> 〈4>的任一项所述的抗体，其具有抑制血管内皮细胞的引诱的活性。〈6>根据〈1>所述的抗体,其具有下述(a) (h)的任一项所述的特征，(a)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号19 21所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号22 24所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。(b)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号25 27所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号28 30所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。(c)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号31 33所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号34 36所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。(d)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号37 39所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号40 42所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。(e)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号43 45所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号46 48所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。 (f)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号49 51所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号52 54所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。(g)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号55 57所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号58 60所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。(h)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号61 63所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号64 66所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。<7>根据〈1>所述的抗体，其具有下述(a) (h)的任一项所述的特征，(a)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号3所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号4所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。(b)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号5所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号6所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。(C)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号7所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号8所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。
(d)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号9所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号10所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。(e)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号11所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号12所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。(f)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号13所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号14所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。
(g)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号15所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号16所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。(h)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号17所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号18所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。<8>由保藏编号FERM ABP-11377所特定的杂交瘤产生的抗体。<9>根据〈1>所述的抗体，其结合〈7>或〈8>所述的抗体的表位。<10>编码<1> 〈9>的任一项所述的抗体的DNA。<11>产生〈1> 〈9>的任一项所述的抗体或含有〈10>所述的DNA的杂交瘤。〈12>根据〈1>所述的抗体的制造方法，包括以下工序(a)制备结合人TGFa的抗体的工序，(b)由制备的抗体，挑选出与天然型人TGF α比较，与79位的甘氨酸具有突变的人TGFa的反应性低的抗体的工序。〈13>根据〈12>所述的方法，其中，79位的甘氨酸具有突变的人TGF α为G79A置换型的人TGF α。〈14>79位的甘氨酸具有突变的人TGFa。<15>G79A 置换型的人 TGFa。<16>将〈1> 〈9>的任一项所述的抗体作为有效成分的抗癌剂。〈17>根据〈16>所述的抗癌剂，其中，癌为Ras基因中具有突变的癌。<18>将〈2>、〈3>、<6> 〈8>的任一项所述的抗体作为有效成分的癌的诊断剂。〈19>根据〈18>所述的诊断剂，其中，癌是Ras基因中具有突变的癌。发明效果本发明提供了对Ras基因中具有突变的癌细胞具有优异的增殖抑制效果的抗TGF α抗体。特别地，与79位的甘氨酸具有突变的人TGF α的反应性低的抗TGF α抗体共同具有对Ras基因中具有突变的癌细胞的优异的增殖抑制活性。使用本发明的抗体，则癌的治疗成为可能。本发明的抗体对于对现有药物抵抗性高的Ras突变癌的治疗也有效。另夕卜，本发明的抗体可应用于癌的诊断。
图1 :显示在抗TGFa单克隆抗体的取得中使用的免疫原和抗体筛选用抗原的图。对于免疫原proTGF a-mH(a)及proTGF a-mFc (b)以及抗体筛选用抗TGF a-hFc (c)、proTGF a -hFc (d)及GITR-hFc (e)分别进行SDS电泳并在凝胶上展开，进行CBB染色。mFc显示小鼠IgG2a的Fe部,hFc显示人IgGl的Fe部。另外mH表示连续融合myc与His的标签。(f)显示瞬时表达膜型TGF α的293Τ细胞与抗TGF α抗体(R&Dsystems公司)(右)或与作为阴性对照的PBS(_)(左)的反应性。设计了根据TGFa的表达量，通过荧光蛋白(绿色荧光蛋白GFP，Cell Biolabs公司))发出荧光。对于二级抗体，使用以藻红蛋白(PE)标记的抗IgG抗体。在抗体反应细胞通过流式细胞术的二维展开中，抗体与TGFa反应的场合，荧光的点在右上展开(图1f右)。 图2 :显示使用免疫原及筛选用抗原的固相ELISA中，各抗TGF α抗体候补(精制生物素标记)的反应性的例图。对于各抗TGFa抗体(精制生物素标记)，显示了通过ELISA检测4个抗原的反应性的结果。将450nm/620nm的吸光度(纵轴OD值)，从左以GITR-hFc、TGF a -hFc、proTGF a -hFc、proTGF a -mH 顺序地排放并作图。图3 :显示对于强制表达膜型TGFa的293T细胞，通过流式细胞术分析的各抗TGFa抗体候补(精制抗体)的反应性结果的例图。在X轴展开通过GFP产生的荧光，在Y轴展开通过抗TGFa抗体和PE标记抗小鼠IgG抗体产生的荧光。与阴性对照相比抗体与膜型TGF α反应时点移动至右上。图4 :显示通过免疫沉淀法检测针对proTGF a -mH抗原，各抗TGF α抗体候补(杂交瘤上清)的反应性的结果的照片。使用抗myc标签抗体检测免疫沉淀的抗原。为了确认所检测的带为proTGF a _mH,在凝胶的右端泳道展开proTGF a -mH。图5a :显示对于EGFR高表达癌细胞A431细胞中EGFR的酪氨酸磷酸化，各抗TGFa抗体的抑制效果的照片。作为实验对照，使用TGFa中和抗体克隆189-2130(非专利文献50)及西妥昔单抗的亲本抗体225。显示p-EGFR通过抗磷酸化酪氨酸EGFR抗体的蛋白质印迹的结果，并显示了相同试验膜用抗EGFR抗体对EGFR进行再印迹(reblot)的结果。图5b :显示各抗TGF α抗体对于EGFR高表达癌细胞A431细胞中EGFR的酪氨酸磷酸化的抑制效果的图。作为实验对照，使用TGFa中和抗体克隆189-2130(非专利文献50)及西妥昔单抗的亲本抗体225。将TGFa未添加时的EGFR的磷酸化水平作为O %、将TGF α添加时的EGFR的磷酸化水平作为100%时，对各实验条件中EGFR的磷酸化水平的相对值进行作图。图6 :显示通过流式细胞术分析针对各种实体肿瘤细胞株，抗TGF α抗体MBL259-3的反应性的结果图。作为癌细胞，使用来源于大肠癌的K-Ras基因同突变(homomutation)细胞株SW620和来源于肺癌的K-Ras异突变(heteromutation)细胞株A427。显示了分别进行以下检测的结果在上部图检测与作为小鼠同种型对照抗体的小鼠IgG的反应性；在下部图检测与作为抗TGFa抗体的MBL259-3的反应性。
图7a :显示检测移植了肺癌细胞株A427的小鼠荷瘤模型的由各抗TGFa抗体产生的抗肿瘤活性的结果的图。作为对照使用作为EGFR封闭抗体的西妥昔单抗。以X轴表示自抗体投与开始的天数，Y轴表示肿瘤体积mm3。使用5只小鼠进行实验，对于全部的小鼠将其肿瘤尺寸的变化绘图。图的灰色线表示投与同种型对照的场合的结果，黑色线表示投与各抗TGF α抗体和投与西妥昔单抗的场合的结果。图7b :显示检测移植了肺癌细胞株A427的小鼠荷瘤模型的由各抗TGFa抗体产生的抗肿瘤活性的结果图。作为对照使用EGFR封闭抗体的西妥昔单抗。以X轴表示自抗体投与开始的天数，以Y轴表示肿瘤体积mm3。将抗体投与 第23天的肿瘤尺寸的平均值(5只的平均)示于图中。图8a:显示移植了大肠癌细胞株SW620的小鼠荷瘤模型的由各抗TGF α抗体产生的抗肿瘤活性。作为对照使用EGFR封闭抗体的西妥昔单抗。X轴表示自投与开始的天数，Y轴表示肿瘤体积mm3。使用4只小鼠进行实验，对于全部的小鼠将其肿瘤尺寸的变化绘图。图的灰色线表示投与PBS (-)的场合的结果，黑色线表示投与各抗TGF α抗体及西妥昔单抗·的场合的结果。图8b :显示移植了大肠癌细胞株SW620的小鼠荷瘤模型的由各抗TGF α抗体产生的抗肿瘤活性。作为对照使用EGFR封闭抗体的西妥昔单抗。X轴表示自投与开始的天数，Y轴表示肿瘤体积mm3。将抗体投与 第22天的肿瘤尺寸的平均值(4只的平均)绘图。图9 :显示对于三维细胞培养体系的癌细胞的各抗TGFa抗体的增殖抑制效果图。作为癌细胞，使用通过体内试验确认通过本发明的抗体产生的肿瘤抑制效果的A427和SW620。另外，作为用于确认西妥昔单抗的效果的阳性对照使用EGFR高表达细胞株A431。图10 :显示利用了小鼠皮下的血管新生评价体系中，各抗TGFa抗体的抑制效果图。(a)作为血管新生诱导因子的阳性对照使用VEGF和FGF-2的混合溶液，另外作为血管新生的抑制抗体的阳性对照使用VEGF封闭抗体的贝伐单抗(Bevacizumab)。显示血管内皮细胞的浸润的荧光强度(左)和显示将PBS添加时的荧光强度作为I时的相对值(右)。(b)研究TGFa存在下各种抗体的血管新生抑制能力。显示血管内皮细胞的浸润的荧光强度(左)和显示将PBS添加时的荧光强度作为I时的相对值(右)。图11 :对于使用抗TGFa抗体MBL259-3的大肠癌细胞株SW620以及大肠癌组织切片的免疫组织染色的照片。显示了对于使用同种型对照的小鼠IgG2a(a)和抗TGF α抗体MBL259-3 (b)的K-Ras基因同突变大肠癌细胞株SW620 (石蜡包埋)的免疫组织染色图像。显示了对于使用(c)MBL259-3的来源于大肠癌(腺癌)患者的癌组织切片(石蜡包埋)的免疫组织染色图像。图12a :显示通过流式细胞术(点阵图显示)来分析对于氨基酸点置换TGFa的各抗TGFa抗体的反应性的结果图。(a)将抗体的反应性降低的场合的数据用四角的框围住。用三维培养体系或荷瘤小鼠模型显示对于癌细胞具增殖抑制效果的MBL009-15至MBL352-34的9个抗体共同通过G79A置换失去反应性。另一方面，在没有确认对于癌具增殖抑制效果的TGFa中和抗体189-2130中，通过G79A置换而反应性没有变化，通过H74A置换的反应性消失。图12b :显示通过流式细胞术(柱状图显示)分析189-2130对于氨基酸点置换TGF α的反应性结果的曲线图。G79A置换保持反应性，而H74A置换反应性消失。
图13 :显示对于将TGFa的多肽片段固相化的板，各抗TGF α抗体的反应性图。各多肽有重叠部分。使用proTGF a -hFc作为抗原抗体反应的阳性对照。图14 :显示通过流式细胞术分析各人型嵌合抗TGFa抗体针对膜型TGF a /293T的反应性的结果图。图15 :显示MBL009-15的可变区的一级结构的图。图16 :显示MBLO16-8的可变区的一级结构的图。图17 :显示MBL018-1的可变区的一级结构的图。图18 :显示MBL144-1的可变区的一级结构的图。
图19 :显示MBL184-6的可变区的一级结构的图。图20 :显示MBL259-3的可变区的一级结构的图。图21 :显示MBL292-1的可变区的一级结构的图。图22 :显示MBL352-34的可变区的一级结构的图。
具体实施例方式本发明提供了针对TGFa的抗体，所述抗体是对Ras基因中具有突变的癌细胞显示增殖抑制活性的抗体。在本发明中所谓“对Ras基因中具有突变的癌细胞显示增殖抑制活性”，表示在体外和/或体内，对Ras基因中具有突变的癌细胞显示增殖抑制活性。本发明的抗体在对Ras基因中具有突变的癌细胞具增殖抑制活性的范围，进而，也可对Ras基因中没有突变的癌细胞具有增殖抑制活性。体外的活性，例如，使用在凝胶化的培养基中培养细胞的三维细胞培养体系，使Ras基因(例如，K-Ras基因)具有突变的癌细胞(例如，A427或SW620)增殖，向该培养体系中添加被检抗体，其后，可通过检测这些癌细胞的增殖进行评价(参照实施例5)。另外，体内的活性是例如将Ras基因中具有突变的癌细胞(例如，A427或SW620)进行皮下移植的裸小鼠，皮下投与被检抗体，可通过测量其后的肿瘤尺寸进行评价(参照实施例4)。作为具有该活性的抗体，可举出本实施例所述的MBL009-15、MBL016-8、MBL018-1、MBL023-1、MBL144-1、MBL184-6、MBL259-3、MBL292-1及 MBL352-34。将本发明的抗体结合的“人TGF α ”的典型的氨基酸序列(天然型氨基酸序列)以序列编号2表不，其编码的基因的典型的喊基序列以序列编号1表不。本发明抗体的优选方式是，与天然型人TGF α比较而言，与在79位的甘氨酸具有突变的人TGF α (例如，G79A置换型的人TGFa )的反应性低的抗体。本发明抗体的更优选方式，是与在79位的甘氨酸具有突变的人TGF a (例如，G79A置换型的人TGF a )的反应性消失的抗体。在本实施例中对Ras基因中具有突变的癌细胞显示增殖抑制活性的上述MBL009-15、MBLO16-8, MBLO18-1,MBL023-1、MBL144-1、MBL184-6、MBL259-3、MBL292-1 及 MBL352-34，共同地与 G79A 置换型的人TGFa的反应性显著降低。因此，抗体与在79位的甘氨酸具有突变的人TGF a (例如，G79A置换型的人TGFa )的反应性低，与抗体对Ras基因中具有突变的癌细胞的增殖抑制活性，具有闻的相关关系。本发明抗体的其他优选方式，是具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性的抗体。抗体对EGFR的酪氨酸磷酸化的抑制，例如，可如以下那样进行评价。对于用无血清培养基培养的EGFR高表达细胞(例如，A431)，添加TGFa时EGFR的酪氨酸磷酸化(P_Tyrll73)水平瞬时上升。被检抗体具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性的场合，预先使TGFa溶液与被检抗体反应后处理该EGFR高表达细胞的场合，EGFR的磷酸化水平显示比阴性对照(例如，PBS)低的值。这样，与使用阴性对照的场合比较，通过测定使用被检抗体的场合的EGFR的磷酸化水平，可评价被检抗体抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性(参照实施例2)。本发明的抗体，优选在抗体添加浓度10 μ g/mL时，将EGFR的酪氨酸磷酸化(P-Tyrl 173)抑制50%以上的抗体，更优选地抑制70%以上(例如80%以上、90%以上、100%以上)的抗体。作为具有该活性的抗体，可举出本实施例所述的MBL352-34、MBL292-1、MBL184-6、MBLO16-8,MBL144-UMBL023-1 及 MBL018-1。本发明抗体的其他优选方式，是具有抑制引诱血管内皮细胞的活性的抗体。该活性的评价例如可利用小鼠皮下的血管新生评价体系。例如，使用市售的体内血管形成分析系统(Directed In Vivo Angiogenesis Assay) (Trevigen 公司)，可将通过人 TGFa 引起的血管内皮细胞向血管反应器内的游走作为被检抗体抑制活性来评价该活性(参照实施例6)。作为具有该活性的抗体，可举出本实施例所述的MBL009-15、MBLO16-8, MBLO18-1,
MBL023-1、MBL292-1、及 MBL352-34。本发明的抗体特别优选作为兼具多个上述活性的抗体。本发明抗体的其他优选方式，是保持含有本实施例所述的抗体的轻链CDRl ⑶R3的轻链可变区、和含有重链⑶Rl ⑶R3的重链可变区的抗体或者它们的氨基酸序列变体。具体地说，具有下述(a) (h)的任一项所述特征的抗体。〈MBL009-15〉(a)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号19 21所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号22 24所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。〈MBL016-8〉(b)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号25 27所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号28 30所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。〈MBL018-1〉(c)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号31 33所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号34 36所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。〈MBL1444〉(d)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号37 39所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号40 42所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。〈MBL184-6〉(e)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号43 45所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号46 48所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。〈MBL259-3〉(f)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号49 51所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或 多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号52 54所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。〈MBL292-1〉(g)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号55 57所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号58 60所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。〈MBL352-34〉(h)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号61 63所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号64 66所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。本发明抗体的其他优选方式是保持本实施例所述的抗体的轻链可变区和重链可变区的抗体或者其氨基酸序列变体。具体地说，具有下述(a) (h)的任一项所述特征的抗体。〈MBL009-15〉(a)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号3所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号4所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。〈MBL016-8〉(b)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号5所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号6所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。〈MBL018-1〉(c)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号7所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号8所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。〈MBL144-1〉(d)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号9所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号10所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。〈MBL184-6〉(e)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号11所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号12所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。〈MBL259-3〉(f)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号13所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号14所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。〈MBL292-1〉(g)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号15所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号16所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。〈MBL352-34〉(h)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号17所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号18所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入1个或多个氨基酸的氨基酸序列。本发明抗体的其他优选方式是本实施例所述的MBL023-1抗体。产生该抗体的杂交瘤于2011年4月20日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6 (邮政编号305-8566))，赋予保藏编号FERMABP-11377。因此，MBL023-1抗体，具体地说，是由保藏编号FERM ABP-11377特定的杂交瘤所产生的抗体。一旦得到上述抗体(例如，本实施例的抗体)的场合，只要是本领域专业人员，可制作识别该抗体识别的表位的各种抗体。本发明的“抗体”包含免疫球蛋白的全部类及亚类。“抗体”包含多克隆抗体、单克隆抗体，另外，也意在包含抗体的功能性片段的形式。“多克隆抗体”是包含针对不同的表位不同抗体的抗体制备物。另外，“单克隆抗体”表示由实质上均一的抗体的集团得到的抗体(包含抗体片段)。与多克隆抗体进行对照，单克隆抗体是识别抗原上的单一决定基的抗体。本发明的抗体优选单克隆抗体。本发明的抗体是由自然环境的成分分离和/或回收的(即，分离的)抗体。本发明的抗体包含嵌合抗体、人源化抗体、人抗体及这些抗体的功能性片段。将本发明的抗体作为药品来投与人的场合，从降低副作用的观点出发，优选嵌合抗体、人源化抗体或者人抗体。在本发明所谓“嵌合抗体”，是将某个物种的抗体的可变区和与其异种的抗体的恒定区连接的抗体。嵌合抗体，例如，可通过用抗原免疫小鼠，由该小鼠单克隆抗体的基因切出与抗原结合的抗体可变部(可变区)，与来源于人骨髓的抗体恒定部(恒定区)基因结合，整合入表达载体、导入宿主来产生而取得(例如，特开平7-194384号公报、专利3238049号公报、美国专利第4816397号公报、美国专利第4816567号公报、美国专利第5807715号公报)。另外，在本发明中所谓“人源化抗体”，是将来源于非人的抗体的抗原结合部位 (CDR)的基因序列移植至人抗体基因(CDR移植)的抗体，其制作方法为公知(例如，参照专利2912618号、专利2828340号公报、专利3068507号公报、欧州专利239400号公报、欧州专利125023号公报、国际公开90/07861号公报、国际公开96/02576号公报)。在本发明中，所谓“人抗体”是全部区域来源于人的抗体。在人抗体的制作中，通过免疫，有可能利用可生产人抗体的抗体库的转基因动物(例如小鼠)。人抗体的制作手法为公知(例如，Nature,362 :255-258(1992), Intern. Rev.1mmunol, 13 :65-93 (1995) ；J. Mol. Biol,222 581-597(1991) ；Nature Genetics，15 :146-156 (1997) ；Proc. Natl. Acad. Sc1. USA,97 722-727(2000)、特开平10-146194号公报、特开平10-155492号公报、专利2938569号公报、特开平11-206387号公报、特表平8-509612号公报、特表平11-505107号公报)。在本发明中所谓抗体的“功能片段”，为抗体的一部分(部分片段)，表示特异性识别人TGFa。具体地可举出Fab、Fab’、F(ab’)2、可变区片段(Fv)、二硫键合Fv、单链Fv(scFv)、sc (Fv) 2、双功能抗体(Diabody)、多特异性抗体及它们的聚合物等。在这里所谓“Fab”，表示包含I条轻链和重链的一部分的免疫球蛋白的一价抗原结合片段。可通过抗体的木瓜蛋白酶消化，另外，可通过重组方法得到。“Fab’”，包含抗体的铰链区的I个或比I个要多的半胱氨酸，由于重链CHl结构域的羧基末端的些许残基的添加，与Fab不同。所谓“F(ab’)2”表示包含两方的轻链和两方的部分重链的免疫球蛋白的二价抗原结合片段。“可变区片段(Fv) ”，是具有完全的抗原识别及结合部位的最小抗体片段。Fv是重链可变区和轻链可变区通过非共价键较强连结的二聚体。“单链Fv(sFv) ”，包含抗体的重链可变区和轻链可变区，这些区域存在于单一的多肽链。“sc (Fv) 2”，通过接头等使2个重链可变区和2个轻链可变区结合成为单链。所谓“双功能抗体”是具有二个抗原结合部位的小的抗体片段，该片段在相同多肽链中包含结合了轻链可变区的重链可变区，各区域与其他链的互补区域成对。“多特异性抗体”，是对于至少2个不同的抗原具有结合特异性的单克隆抗体。例如，可通过同时表达二个重链具有不同特异性的二个免疫球蛋白重链/轻链对来制备。
本发明的抗体包含不减少期望的活性(例如，对Ras基因中具有突变的癌细胞的增殖抑制活性、与天然型人TGFa或679八置换型的人了6 (!的反应性、抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性或抑制血管内皮细胞的引诱的活性)，且其氨基酸序列得以修饰的抗体。本发明抗体的氨基酸序列变体，可通过向本发明的编码抗体链的DNA导入突变，或通过肽合成来制作。这样的修饰例如包含本发明抗体的氨基酸序列内的残基置换、缺失、添加和/或插入。抗体的氨基酸序列所改变的部位，只要具有与改变前的抗体同等的活性即可，所述部位可以是抗体的重链或轻链的恒定区，另外，也可以是可变区(构架区和CDR)。CDR以外的氨基酸的改变，考虑对于与抗原的结合亲和性的影响相对地小，现在，改变CDR的氨基酸，筛选对于抗原的亲和力提高的抗体的方法是公知的(PNAS，102 =8466-8471 (2005)，Protein Engineering, Design&Selection, 21 :485-493 (2008)、国际公开第 2002/051870号，J. Biol. Chem. , 280 :24880-24887(2005),· Protein Engineering, Design&Selection,21 :345-351(2008)) οCDR以外氨基酸的所改变氨基酸数，优选10个氨基酸以内，更优选5个氨基酸以内，最优选3个氨基酸以内(例如，2个氨基酸以内、I个氨基酸)。氨基酸的改变优选保守置换。在本发明中所谓“保守置换”，表示用化学上具有同样侧链的其他氨基酸残基置换。化学上具有同样的氨基酸侧链的氨基酸残基的组在属于本发明的技术领域已熟知。例如，可分类为酸性氨基酸(天冬氨酸及谷氨酸)；碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；在中性氨基酸中，具有烃链的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸)、具有羟基的氨基酸(丝氨酸、苏氨酸)、含硫氨基酸(半胱氨酸、甲硫氨酸)、具有酰胺基的氨基酸(天冬酰胺、谷酰胺)、具有亚氨基的氨基酸(脯氨酸)、具有芳香基的氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)。另外，本发明抗体的改变例如可以是糖基化部位的数、位置、种类变化等的抗体的翻译后加工的改变。由此，例如，可提高抗体的ADCC活性。所谓抗体的糖基化，典型地为N-键或O-键。抗体的糖基化，很大依赖于表达抗体所使用的宿主细胞。糖基化模式的改变可通过有关糖生产的特定酶的导入或缺失等公知方法进行(特开2008-113663号公报、专利4368530号公报、专利4290423号公报、美国专利第5047335号公报、美国专利第5510261号公报、美国专利第5278299号公报、国际公开第99/54342号公报)。进而，在本发明中，为了增加抗体的稳定性等目的，可通过以其他的氨基酸置换脱酰胺化氨基酸或邻接于脱酰胺化氨基酸的氨基酸来抑制脱酰胺化。另外，以其他的氨基酸置换谷氨酸，可增加抗体的稳定性。本发明也提供这样的稳定化抗体。本发明的抗体，如果是多克隆抗体，可通过抗原(TGFa、其部分肽或表达它们的细胞等)对免疫动物进行免疫，由其抗血清，通过以往的方法(例如，盐析、离心分离、透析、柱色谱等)，进行精制来取得。另外，单克隆抗体可通过杂交瘤法或重组DNA法来制作。作为杂交瘤法，代表性地可举出Kohler和Milstein的方法(Kohler &Milstein,Nature, 256 :495 (1975))。该方法的细胞融合工序中所使用的抗体产生细胞，是通过抗原(人TGFa、其部分肽或表达它们的细胞等)免疫的动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、猴、山羊)的脾脏细胞、淋巴节细胞、外周血白细胞等。也可使用从没有进行免疫的动物预先分离的上述细胞或者淋巴细胞等使抗原在培养基中进行作用而得到的抗体产生细胞。对于骨髓瘤细胞可使用公知的各种的细胞株。抗体产生细胞及骨髓瘤细胞，如果它们可融合，则可以是不同的动物种起源的细胞，优选相同的动物种起源的细胞。杂交瘤，例如，通过用抗原免疫的小鼠得到的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞之间的细胞融合来产生，通过其后的筛选，可得到产生对于人TGFa特异性的单克隆抗体的杂交瘤。针对人TGFa的单克隆抗体，通过培养杂交瘤，另外，可通过投与了杂交瘤的哺乳动物的腹水来取得。重组DNA法是将编码上述本发明的抗体或肽的DNA自杂交瘤或B细胞等克隆化，整合入适当的载体中，将其导入宿主细胞(例如哺乳类细胞株、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞等)中，作为重组抗体产生本发明抗体的方法(例如,P. J. Delves, AntibodyProduction Essential Techniques,1997WILEY ；P.Shepherd and C. Dean MonoclonalAntibodies,2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS ；Vandamme A. M.等，Eur.J.Biochem. 192 :767-775 (1990))。对于编码本发明抗体的DNA的表达，可通过分别将编码重链或轻链的DNA整合入表达载体来转化宿主细胞，也可通过将编码重链及轻链的DNA整合入单一的表达载体来转化宿主细胞(参照国际公开94/11523号公报)。培养上述宿主细胞，由宿主细胞内 或培养液进行分离、精制，能够以实质上纯粹且均一的形式取得本发明的抗体。可使用在通常的多肽的精制中所使用的方法实施抗体的分离、精制。可使用转基因动物制作技术制作植入了抗体基因的转基因动物(牛、山羊、绵羊或猪等)，由该转基因动物的奶，大量取得来源于抗体基因的单克隆抗体。本发明还提供了编码上述本发明的抗体或肽的DNA ;包含该DNA的载体；保持该DNA的宿主细胞；及包括培养该宿主细胞并回收抗体的抗体的生产方法。由上述，在本发明中发现，抗人TGFa抗体中，与79位的甘氨酸具有突变的人TGFa (例如，679八置换型的人了6 (!)的反应性低，与对Ras基因中具有突变的癌细胞的增殖抑制活性，具有高的相关关系。根据该认识，通过挑选与天然型人TGFa进行比较，与79位的甘氨酸具有突变的人TGFa (例如，G79A置换型的人TGFa)的反应性低的抗体，可制造对Ras基因中具有突变的癌细胞显示增殖抑制活性的抗人TGFa抗体。因此，本发明还提供对Ras基因中具有突变的癌细胞显示增殖抑制活性的抗人TGFa抗体的制造方法，所述方法包括以下工序(a)制备与人TGFa结合的抗体的工序；和(b)由制备的抗体，挑选出与天然型人TGFa相比，与79位的甘氨酸具有突变的人TGFa的反应性低的抗体的工序。天然型人TGF α或79位的甘氨酸具有突变的人TGF a (例如，G79A置换型的人TGF a )与抗体的反应性，例如，制备使各TGF α在表面表达的293T细胞，可通过用流式细胞术分析该细胞与被检抗体的反应性来评价(参照实施例7)。进而，本发明还提供在这样的抗人TGFa抗体的制造方法中有用的79位甘氨酸具有突变的人TGF a (例如，G79A置换型的人TGF a )。本发明的抗体由于对Ras基因中具有突变的癌细胞具有增殖抑制活性，可作为抗癌剂利用。因此，本发明还提供癌的治疗方法，所述方法包括将本发明的抗体作为有效成分的抗癌剂及将本发明的抗体以治疗有效量投与包含人的哺乳类的工序。本发明的治疗方法，除了人以外，例如，还可应用于包含狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔子等各种哺乳动物。本发明的抗体，在对于现有药物抵抗性高的Ras突变癌的治疗中有效。将本发明的抗体作为有效成分的抗癌剂，可以本发明的抗体与任意的成分，例如含有生理食盐水、葡萄糖水溶液或磷酸盐缓冲液等的组合物的形式来使用。本发明的抗癌齐U，可根据需要以液体或冷冻干燥的形式来制形化，也可含有任意药学上允许的载体或者介质，例如，稳定化剂、防腐剂、等渗剂等。
作为药学上允许的载体，在冷冻干燥的制剂的场合，可例举甘露醇、乳糖、蔗糖、人白蛋白等，在液状制剂的场合，可例举生理食盐水、注射用水、磷酸盐缓冲液、氢氧化铝等，但不限定于这些。本发明的抗癌剂的投与方法，根据投与对象的年龄、体重、性别、健康状态等而不同，可通过经口投与、非经口投与(例如，静脉投与、动脉投与、局部投与)的任一种投与途径来投与。优选的投与方法为非经口投与。本发明的抗癌剂的投与量，根据患者的年龄、体重、性别、健康状态、癌的进行程度及投与的抗癌剂的成分而变动，一般地在静脉内投与的场合，成人每IKg体重为I日O.1 IOOOmg,优选I lOOmg。本发明的抗体不仅用于癌的治疗，也可考虑用于癌的诊断。由本发明人们所发现的，与天然型人TGFa进行比较，与79位的甘氨酸具有突变的人TGF a (例如，G79A置换型的人TGFa)的反应性低的抗体，特别在Ras基因中具有突变的癌的诊断中有用。在癌的诊断中使用本发明抗体的场合或者用于癌的检测的场合，本发明的抗体也可以是标记的抗体。作为标记，例如，可使用放射性物质、荧光色素、化学发光物质、酶、辅酶，具体地可举出放射性同位素、荧光素、若丹明、丹磺酰氯、萤光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、溶菌酶、生 物素/抗生物素蛋白等。对于将本发明的抗体作为诊断剂进行调剂，可采用符合目的任意手段并以任意的剂型来得到它们。例如，对于精制的抗体测定其抗体价，适当地用PBS(含有生理食盐的磷酸缓冲液)等稀释后，可添加O.1 %叠氮化钠等作为防腐剂。另外，例如，对于胶乳等吸附本发明抗体的物质，也可来求抗体效价，适当地进行稀释，添加防腐剂来使用。实施例以下，根据实施例及比较例更具体地说明本发明，但本发明并不限定于以下实施例。[材料及方法]1.抗TGFa单克隆抗体的制作方法(I)免疫原以及抗体筛选用抗原的制备为了获得针对TGFa的小鼠单克隆抗体，制备了以下2个免疫原。第一个免疫原是如下制备的，将对应于人TGFa的氨基酸序列第24位 第89位(碱基序列第70位 第267位)的基因自胎盘cDNA文库通过PCR法扩增，将得到的PCR产物克隆入动物培养细胞表达载体pSecTag2 (Invitrogen公司)，进而将包含来源于pSecTag2的前导序列(leader sequence)的人TGF α (碱基序列第70位 第267位)亚克隆入逆转录病毒载体pQCXIP(TakaraBio公司)。设计载体以在TGFa的C末侧连续融合有作为标记的myc和His。使用脂质转染胺2000 (Lipofectamine 2000) 一同将制作的载体和env载体(pVSVG)基因导入至作为病毒包装细胞的GP293细胞中。接着使用由培养上清得到的病毒液感染293T细胞，得到TGFa稳定产生细胞株。将10天培养后得到的上清通过填充了TALON树脂(TakaraBio公司)的柱，用10倍量树脂的5mM含有咪唑的结合缓冲液洗涤柱后，以IOOmM的咪唑溶液将结合物洗脱。以PBS过夜透析后，对于一部分洗脱物进行SDS电泳，在分子量19-22KDa附近确认目的带(图1a)，将其作为免疫原(以下，将该免疫原称为proTGF a -mH)。第二个免疫原是如下制备的，将对应于人TGF α的氨基酸序列第I位 第89位(碱基序列第I位 第267位)的基因自胎盘cDNA文库通过PCR法扩增，克隆入pCAGGS (由大阪大学大学院医学系研究科教授宫崎纯一先生转让。Gene (1991) 108 (2)193-199)。设计载体以在3’侧融合了小鼠免疫球蛋白G2a的Fe部基因。使用作为基因导入试剂的脂质转染胺2000 (Invitrogen公司)导入人培养细胞293T中，通过离心操作回收其培养上清用。根据制品说明书添加质粒DNA的量、细胞数、脂质转染胺的量。将得到的上清通过填充了蛋白G珠(GE公司)的柱，用10倍珠量的结合缓冲液洗涤柱后，用pH2. 3的甘氨酸盐酸溶液洗脱柱吸附物。用PH8. O的Tris-HCl缓冲液迅速中和后，用PBS过夜透析。对于提取物的一部分进行SDS电泳，在分子量40-44KDa附近确认目的单带(图1b)，将其作为免疫原(以下，将该免疫原称为proTGF a -mFc)。另外，为了制备用于确认得到的抗体与TGFa的反应性的筛选用抗原，构建下述4个表达载体。在第一个载体中，将对应于人TGF α的氨基酸序列第40位 第89位(碱基序列第118位 第267位)的成熟型TGFa的基因自胎盘cDNA文库通过PCR法扩增，将得到的PCR产物克隆入动物培养细胞表达载体pSecTag2后，将包含来源于pSecTag2的前导序列的人TGF α (碱基序列第118位 第267位)亚克隆入pcDNA3.1载体(Invitrogen公司)。设计载体以在TGFa的C末侧融合有人免疫球蛋白Gl的Fe部的基因(以下，将通过该表 达载体制备的抗原称为TGF a -hFc)。在第二个载体中，将对应于人TGF α的氨基酸序列第I位 第89位(碱基序列第I位 第267位)的基因自胎盘cDNA文库通过PCR法扩增，将得到的PCR产物克隆入动物培养细胞表达载体pcDNA3.1。设计载体以在TGFa的C末侧融合有人免疫球蛋白Gl的Fe部(以下，将通过该表达载体制备的抗原称为proTGF a -hFc)。作为第三个载体，为了研究针对人免疫球蛋白Gl的Fe部的抗体的非特异反应，构建融合了人GITR的细胞外区域的部分长基因序列(第1-495位碱基)和人免疫球蛋白Gl的Fe部基因的载体pcDNA-GITR-hFc (以下，将通过该表达载体制备的抗原称为GITR-hFc)。将各表达载体通过脂质体导入人培养细胞293T，于3-4日后回收培养上清。按照上述的免疫原制备法实施培养上清中所含有的抗体筛选用抗原TGFa -hFc、proTGF a -hFc以及GITR-hFc的回收、精制(图lc-e)。以研究与在细胞表面表达的膜型TGF α的反应性为目的构建了第四个表达载体。将对应于人TGF α的氨基酸序列第I位 第160位(碱基序列第I位 第480位)的基因克隆入动物细胞表达载体pcDNA3.1。设计载体以在TGFa基因的3’侧连接有核糖体进入位点IRES以及荧光蛋白GFP(Cell Biolabs公司)的基因(以下，将该表达载体称为PDIG-TGF α )。该表达载体的特征是在通过脂质体瞬时导入293T细胞时，仅表达膜型TGF α的细胞具有发出GFP的荧光这样的结构。使该细胞与一级抗体以及PE标记的二级抗体反应后，用流式细胞术二维展开时，在发生抗原抗体反应的场合，仅发出GFP荧光的细胞得到在右上点移动的数据(图1f)(以下，将瞬时导入了该表达载体的293Τ细胞称为 TGF α /293Τ)。(2)免疫原的免疫和杂交瘤的建立作为免疫原单独使用proTGF a-mFc或者使用proTGF a-mFc和proTGF a-mH。在这些溶液中等量混合弗氏完全佐剂(Complete Freund’ sAdjuvant)后,对于BALB/c系统、C57BL/6系统、C3H系统以及MRL系统的小鼠计60只进行每周2次、共计6 8次的免疫。最终投与后至第3天由免疫小鼠摘出脾脏或者淋巴节，由组织内部采取淋巴细胞。混合作为小鼠骨髓瘤细胞株P3U1回收的淋巴细胞，以RPMI培养基(Sigma公司)洗涤2次后，向细胞沉淀等量添加以RPMI稀释至50%的聚乙二醇4000溶液(和光纯药公司)。抽吸细胞悬浮液I分钟后，用20倍量的RPMI洗涤细胞3次。其后，将细胞用含有15%牛血清(Extech公司)、2% HAT (Invitrogen公司)、1/100量的BM培养基(Roche公司)、终浓度5ng/mL的链霉素和青霉素的RPMI培养基悬浮，接种至96孔板中并在37度的CO2培养箱内静置培养。接种 第5天将培养液换成新鲜培养基，然后继续5天的培养。(3)抗体筛选1:抗原固相ELISA接种 第10天由杂交瘤增加的孔回收培养上清，使用以筛选用抗原proTGF a -hFc O. 2 μ g/孔量固相化的96孔板,进行酶免疫测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)(以下，称为 ELISA)。将 ELISA 发色的 OD 值(450nm/620nm 吸光度)为O. 2-0. 5以上的上清判断为一次阳性，选择1007种类的杂交瘤。将阳性杂交瘤 移至24孔板
进一步培养3天。(4)抗体筛选2 :流式细胞术使用使293T细胞瞬时地表达全长TGFa的TGF a/293T细胞，通过下述的方法来进行对于上述的24孔板上清的流式细胞术分析。对于杂交瘤上清I样品50 μ L，使IxlO5个细胞数的TGF a /293T于4度反应60分钟。用含有2mM EDTA和O. 5% BSA的PBS洗涤细胞后，与PE标记的抗小鼠IgG抗体(MBL公司)于4度反应30分钟。进而，以400xg离心洗涤细胞后，将细胞沉淀悬浮于500 μ L的含有2mM EDTA和O. 5 % BSA的PBS中，通过流式细胞仪(FC500, BecmannCoulter公司)进行分析。(5)抗体筛选3 :免疫沉淀法对于以流式细胞术显示与膜型TGFa的反应性的杂交瘤上清进一步以proTGF a -mH为抗原通过以下方法进行免疫沉淀。每I杂交瘤回收700 μ L的培养上清，添加15 μ L的蛋白G琼脂糖(GE公司)后，于4度搅拌的同时过夜反应。向以PBS洗涤琼脂糖4次得到的琼脂糖沉淀中添加ImL的3 μ g/mLproTGF a -mH,于4度过夜搅拌反应。向PBS洗涤后得到的琼脂糖沉淀添加与沉淀等量的SDS样品缓冲液后，进行10分钟的煮沸，得到其上清。以每15 μ L量应用于15% SDS电泳用凝胶。使用市售的抗myc抗体(MBL公司)和抗TGFa多克隆抗体(R&D systems公司)作为免疫沉淀的阳性对照抗体。另外，同时应用proTGF a -mH作为免疫印迹的阳性对照。进行SDS电泳，将蛋白质转移至PVDF膜后，用含有5%脱脂奶的PBS室温I小时封闭处理膜。检测用抗体使用稀释500倍的抗myc抗体(MBL公司)，与PVDF膜室温反应I小时。用含有0. 05%吐温20的PBS (以下，称为洗涤液)洗涤膜后，使用市售的化学发光底物(Milipore公司)进行目的条带的检测(图4)。自抗原固相ELISA、流式细胞术以及免疫沉淀的结果挑选杂交瘤上清，通过极限稀释法进行杂交瘤的单克隆化。为了确认精制抗体与TGFa的反应性，图2显示研究与使用GITR-hFc、TGF a -hFc、proTGF a -hFc 及 proTGF a -mH(各 0· 2 μ g/ 孔量)固相化的 ELISA板的精制抗体(生物素标记)的反应性的数据的一部分。确认了阴性对照GITR-hFc的OD值为O.1以上不反应，TGF a -hFc,proTGF a -hFc及proTGF a -mH在OD值为O. 5以上反应。图3显示通过流式细胞术确认针对TGF a /293T细胞的精制抗体的反应性的结果。各抗体的同种型使用IsoStrip试剂盒(Roche公司)来确定。其结果，将39种杂交瘤产生的单一抗体作为抗TGFa单克隆抗体列表，用于以后的实验(表I)。[表 I]
权利要求
1.针对人TGFa的抗体，其是对Ras基因中具有突变的癌细胞显示增殖抑制活性的抗体。
2.抗体，其是与79位的甘氨酸具有突变的人TGFa的反应性低于与天然型人TGFa的反应性的抗体。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中，79位的甘氨酸具有突变的人TGFa是G79A置换型的人TGF a。
4.根据权利要求1 3任一项所述的抗体，其具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性。
5.根据权利要求1 4任一项所述的抗体，其具有抑制血管内皮细胞的诱导的活性。
6.根据权利要求1所述的抗体，其具有下述(a) (h)的任一项所述的特征， (a)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号19 21所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号22 24所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (b)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号25 27所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号28 30所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (c)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号31 33所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号34 36所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (d)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号37 39所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号40 42所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (e)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号43 45所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号46 48所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (f)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号49 51所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号52 54所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (g)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号55 57所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号58 60所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (h)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号61 63所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号64 66所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的抗体，其具有下述(a) (h)的任一项所述的特征， (a)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号3所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号4所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (b)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号5所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号6所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (c)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号7所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号8所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (d)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号9所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号10所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (e)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号11所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号12所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (f)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号13所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号14所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (g)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号15所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号16所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (h)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号17所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号18所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。
8.抗体，其是由保藏编号FERMABP-11377所特定的杂交瘤产生的抗体。
9.根据权利要求1所述的抗体，其与权利要求7或8所述的抗体的表位结合。
10.DNA，其编码权利要求1 9中任一项所述的抗体。
11.杂交瘤，其是产生权利要求1 9中任一项所述的抗体的杂交瘤，或是含有权利要求10所述的DNA的杂交瘤。
12.权利要求1所述的抗体的制造方法，其包括以下工序 (a)制备与人TGFa结合的抗体的工序， (b)由制备的抗体，挑选出与79位的甘氨酸具有突变的人TGFa的反应性低于与天然型人TGF a的反应性的抗体的工序。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，79位的甘氨酸具有突变的人TGFa是G79A置换型的人TGF a。
14.79位的甘氨酸具有突变的人TGF a。
15.679々置换型的人了6 0。
16.抗癌剂，其以权利要求1 9中任一项所述的抗体作为有效成分。
17.根据权利要求16所述的抗癌剂，其中，癌是Ras基因中具有突变的癌。
18.癌的诊断剂，其以权利要求2、3、6 8中任一项所述的抗体作为有效成分。
19.根据权利要求18所述的诊断剂，其中，癌是Ras基因中具有突变的癌。
全文摘要
本发明发现了在显示与天然型TGFα的反应性的抗体中，与G79A置换型TGFα的反应性低的抗体对Ras基因中具有突变的癌细胞具有优异的增殖抑制效果。本发明进一步发现了，这些抗体中的很多抗体也具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性和/或抑制引诱血管内皮细胞的活性。
文档编号A61K39/395GK103003424SQ20118002451
公开日2013年3月27日 申请日期2011年5月17日 优先权日2010年5月18日
发明者金田诚, 藤井庆宏, 早田芳弘, 岸义朗, 矢原一郎 申请人:株式会社医学生物学研究所