专利名称：Nad、氢氧化铝复合佐剂及含该复合佐剂的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种复合佐剂，具体涉及一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与氢氧化铝的复合佐剂，属于免疫学技术领域。
背景技术：
近年来，随着免疫学研究的不断深入及基因工程技术的迅速发展，活载体疫苗、 DNA疫苗和蛋白质疫苗等新型疫苗的研究取得了可喜的进步。这些新型疫苗纯度高、特异性强，但免疫原性弱，诱导机体免疫应答不够强，因此应用佐剂来增强其免疫原性或增强宿主对抗原免疫应答就显得尤为重要。人们在寻找新型佐剂的同时，对常规佐剂的改良研究也更加重视起来。虽已涌现不少新型佐剂，但都处于试验研究阶段。目前在疫苗产业中铝佐剂是最传统、最重要也是应用最多的疫苗佐剂。铝佐剂的作用机理主要是在组织中形成抗原贮藏库产生颗粒性抗原，促进抗原递呈给免疫细胞，使抗原滞留，缓慢释放，从而吸引活性淋巴细胞，激活补体系统。但作为疫苗佐剂，其靶向性存在缺陷，不能引起机体的特异性细胞免疫应反应。而其他一些正在研究中的已证实有佐剂作用的物质，由于安全性、有效性或经济方面问题，未能被批准用于人体。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是生物代谢过程中的一种重要辅酶，其结构式如图所示(图I)。它的基本生理功能是维持细胞的生长、分化和能量的代谢，不仅对细胞内的氧化还原状态具有重要的调节作用，而且常被作为活体内的代谢指标，与细胞的代谢、节律、 衰老、病变、死亡等重大生命过程有着极其紧密的联系。Friedrich Haag证实NAD是一种细胞内源性危险信号。同时其可作为T细胞的免疫调节分子，诱导鼠类CD4+及CD8+T细胞的凋亡，但其是否具有佐剂作用尚不明确。
发明内容
为解决现有疫苗佐剂存在毒副作用、价格昂贵等问题，本发明提供一种安全、有效、稳定、便宜的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与氢氧化铝的复合佐剂。本发明还提供一种含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与氢氧化铝的复合佐剂的疫苗。本发明提供的是这样一种NAD、氢氧化铝复合佐剂，其特征在于由下列质量比的组分组成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氢氧化铝=I 5 50 100。所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为市购医用产品，分子式为C21H26N7O14P2,分子量为 663. 4177，结构式如图I所示，在人体中的推荐剂量为10 50 μ g。所述氢氧化铝为目前常用的氢氧化铝胶体佐剂，其制法参照《中国药典(三部)》， (国家药典委员会.北京人民卫生出版社.2005:118-119)，在人体中的剂量为I. 8 2. 7mg 本发明提供的是这样一种含有复合佐剂的疫苗，其特征在于在每100 μ L抗原液中加入O. 51 I. 05mg的复合佐剂，且复合佐剂由下列质量比的组分组成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氢氧化铝=I 5 50 100。所述抗原液是在每100 μ L生理盐水中，混溶有2Pg抗原。所述抗原为常规乙肝表面抗原。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与氢氧化铝的复合佐剂诱导的免疫反应为体液免疫反应。本发明与现有技术相比具有下列优点和效果(I)本复合佐剂无毒、副作用，不积累毒性，在免疫剂量范围内使用是安全可靠的；(2)本复合佐剂能够有效的诱导抗原特异性的体液免疫应答，且其所诱导的体液免疫应答效果优于单一的铝佐剂及单一的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；(3)本复合佐剂原料易得，均为市售产品，制备工艺简单，成本低，性能稳定，可作为乙肝疫苗、蛋白疫苗及病毒疫苗等佐剂；(4)本复合佐剂与疫苗联合应用能有效增强疫苗体液免疫应答，增强效果优于单一的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸佐剂和单一的氢氧化铝佐剂。
图I为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸分子结构式；
图2为使用实施例I提供的复合佐剂后，14周内，各实验组小鼠血清抗-HBsIgG抗体水
平；
图3为使用实施例2提供的复合佐剂后，14周内，各实验组小鼠血清抗-HBsIgG抗体水
平；
图4为使用实施例3提供的复合佐剂后，14周内，各实验组小鼠血清抗-HBsIgG抗体水
平；
图5为使用实施例4提供的复合佐剂后，14周内，各实验组小鼠血清抗-HBsIgG抗体水平。
具体实施例方式下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。文中所述的较佳条件实施方法仅作示范之用。实施例I
本发明提供的复合佐剂由下列质量比的组分组成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氢氧化铝 =I 100。本发明提供的含有复合佐剂的疫苗是在每100 μ L抗原液中，加入I. Olmg的复合佐剂混合而成的，其中，复合佐剂由下列质量比的组分组成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氢氧化铝=I 100，抗原液是在每100 μ L生理盐水中，混溶有2Pg抗原，该抗原为常规乙肝表面抗原，购自深圳康泰生物制品有限公司，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD购自上海基米生物科技有限公司，氢氧化铝为常用的氢氧化铝胶体佐剂，其制法参照《中国药典(三部)》，(国家药典委员会·北京人民卫生出版社.2005:118-119)。本实施例I所得乙肝表面抗原的免疫试验和效果如下
A、免疫
将ICR小鼠分为复合佐剂组、氢氧化铝单一佐剂组、无佐剂组和空白组，共五组，每组25只。注射实施例I的含有复合佐剂的疫苗总体积为100μ L，经腿部肌肉注射到小鼠体内。氢氧化铝单一佐剂组是将氢氧化铝Img和乙肝表面抗原2Pg混溶于100 μ L生理盐水中，再经腿部肌肉注射到小鼠体内。无佐剂组是将乙肝表面抗原2Pg溶于100 μ L生理盐水中，再经腿部肌肉注射到小鼠体内。空白组是对每只小鼠注射100 μ L生理盐水。免疫方案在第O周经腿部肌肉免疫小鼠，免疫次数为一次。B、ELISA检测血清抗一 HBsIgG水平
在第O周免疫后第4、6、8、10、12、14周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗一 HBs IgG水平，按蛋白微孔试剂盒方法进行检测，具体方法是40μ1 HBsAg溶于IOml IX包被稀释液，混匀，包被96孔酶标板，ΙΟΟμΙ/孔；酶标板放于湿盒，4°C下过夜；倒掉孔内液体，拍净板子；加入1ΧΒ8Α,200μ1/孔，酶标板在37°C湿盒放置Ih ;倒掉孔内液体，拍净板子；血清经倍比稀释后，加入酶标板，ΙΟΟμΙ/孔，37°C湿盒放置Ih ;用试剂盒配制的洗液洗板4次，每次5min，末次拍净酶标板；加入试剂盒配制的二抗，ΙΟΟμΙ/孔，37°C湿盒放置 Ih ;用洗液洗板4次，每次5min，末次拍净酶标板；加入试剂盒配制的显色液，ΙΟΟμΙ/孔，避光显色10 25min ;加终止液,每孔ΙΟΟμΙ ;酶标板放入酶标仪,在405nm处读板。C、数据分析
对所获得的实验数据以SPSS11. 5统计软件进行单因素方差分析，以P < 0. 05为差异的统计学意义。表I为使用实施例I提供的复合佐剂后，14周内，各实验组小鼠血清抗-HBsIgG抗体水平(0D值)。表I
权利要求
1.一种NAD、氢氧化铝复合佐剂，其特征在于由下列质量比的组分组成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氢氧化铝=I 5 50 100。
2.根据权利要求I所述的NAD、氢氧化铝复合佐剂，其特征在于所述氢氧化铝为常规氢氧化招佐剂。
3.根据权利要求I所述的NAD、氢氧化铝复合佐剂，其特征在于所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为市购医用产品，分子式为C21H26N7O14P2，分子量为663. 4177。
4.一种含有复合佐剂的疫苗，其特征在于在每100 μ L抗原液中加入O. 51 1.05mg 的复合佐剂，且所述复合佐剂由下列质量比的组分组成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氢氧化铝=I 5 50 100。
5.根据权利要求4所述的含有复合佐剂的疫苗，其特征在于所述抗原液是在每100μ L 生理盐水中，混溶有2Pg抗原。
6.根据权利要求5所述的含有复合佐剂的疫苗，其特征在于所述抗原为常规乙肝表面抗原。
全文摘要
本发明提供一种NAD、氢氧化铝复合佐剂及含该复合佐剂的疫苗，复合佐剂由下列质量比的组分组成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸︰氢氧化铝＝1～5︰50～100。所述含有复合佐剂的疫苗，是在每100μL抗原液中加入0.51～1.05mg的复合佐剂。本发明提供的复合佐剂原料易得、制备工艺简单、成本较低、较为稳定、可以作为乙型肝炎疫苗、蛋白疫苗、病毒疫苗等佐剂。该复合佐剂与疫苗联合应用能有效增强疫苗体液免疫应答，增强效果优于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单一佐剂和氢氧化铝佐剂，而且无毒、副作用，在免疫剂量范围内使用是安全可靠的。
文档编号A61K39/39GK102580081SQ20121004089
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月22日 优先权日2012年2月22日
发明者王海漩, 王琳, 胡云章, 胡凝珠 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所