专利名称：CaM结合肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于抗肿瘤的多肽药物领域，具体涉及一种CaM结合肽及其应用。
背景技术：
目前，癌症的猖獗危胁着人们的身体健康.对顽症的攻克是摆在人类面前的一大难题。在科学发达的今天，人们的着眼点仍放在寻找抗癌作用强而本身副作用小的药物来对付肿瘤。大量资料证实细胞内钙调蛋白(CaM)与肿瘤的形成、生长和增殖密切相关。20世纪70、80年代人们就证实了钙调素拮抗剂对肿瘤增殖、转移有肯定的抑制作用。CaM作为胞内Ca2+的受体蛋自，参与胞内Ca2+浓度的调节，而正常细胞增殖需要钙，因此人们认为CaM是正常细胞增殖所必需的。现已发现某此肿瘤的发生与发展也与CaM密切相关20世纪80年代末，人们就已经发现肿瘤细胞内CaM含量高于正常细胞。许多实验证明细胞内CaM水平与细胞的无序增殖，特别是恶性肿瘤细胞增殖是正相关。如CaM水平与肝癌生长速度呈正相关，啮齿类及鸟类肿瘤中CaM含量为正常的2-4倍，牛皮癣患者病变区域CaM浓度比正常的区域高30倍。由此可见，CaM含量的变化会引起细胞的不正常增殖与细咆变异.其次，CaM分子结构的改变可使CaM与其部分靶体，甚至所有靶体间的相互作用发生变化，从而促使癌细胞的生长，例如癌蛋白的发现，就是恶性细胞中CaM分子发生质的改变的一个倒证，它可以促进癌细胞的生长，使肿瘤细胞在缺Ca2+条件下仍然保持旺盛的DNA合成能力。另外CaM结合蛋白发生结构或构象的改变及CaM对Ca2+激活的敏感性发生改变，cAMP含量发生改变都与肿瘤的形成密切相关，因此CaM成为化学抗癌治疗剂的新靶点，从而引起人们极大的关注。迁移和侵袭是恶性肿瘤发展的关键，也是临床治疗的难题，控制肿瘤的迁移和侵袭是抗肿瘤药物研究的一个重要方向，肿瘤的迁移是一个多阶段的复杂过程，肿瘤侵袭和转移可分为三步，即黏附、降解和移动。黏附是肿瘤细胞侵袭的起始，肿瘤细胞通过表面特定受体与基底膜的层黏连蛋白、纤维连接蛋白和IV型胶原等相黏连，然后在蛋白水解酶和相关因子的作用下，侵袭基底膜，降解细胞外基质，肿瘤细胞一旦突破基底膜即在基质内较快侵袭性生长并发生转移。因此，阻断其中任何一个过程，都可以抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。有文献证实CaM与肿瘤的迁移侵袭密切相关。肿瘤的生长有两个不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段。如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过l_2mm3。肿瘤血管为肿瘤组织提供新陈代谢所必需的氧气和营养，从而使肿瘤得以迅速的生长并同时为肿瘤的远端转移提供转运。因此近年来抑制血管生成成为抗肿瘤治疗的新策略。近来有文献报道CaM与肿瘤血管新生也有着密切的关系，CaM抑制剂可以抑制血管新生。因此关于CaM与肿瘤的研究又焕发出新的活力。不过，目前已知的大部分已知的钙调素拮抗剂专一性不强，且具有不良反应。人们试图寻找专一性强、不良反应小的钙调素拮抗剂，用于肿瘤治疗。本发明的多肽可能成为有效地选择。
发明内容
本发明的目的是提供一种CaM结合肽及其应用，该发明不仅可以抑制HeLa细胞的增殖，迁移，粘附，还可以抑制HUVEC的体外血管新生，因此其可能开发成为一种新型的抗肿瘤药物。为实现上述目的，本发明提供的CaM结合肽，类型为氨基酸，分子类型为肽，所述CaM结合肽为实验室合成的Sema4D钙调蛋白结合肽，其含有编码对应于Sema4D结合 CaM的序列，所述Sema4D钙调蛋白结合肽分子的序列由氨基酸的一字简码组成，表述如下:NH2-GYL PRQ CLK FRS ALL IGK KKP KS-⑶OH。CaM是一种单链酸性小分子可溶性球蛋白，由十九种、148个氨基酸组成，分子量为I. 67万，等电点为4. 3，是酸性蛋白质。不同生物来源的钙调蛋白，其氨基酸组成和顺序或完全一样，或仅有少许差异，具有分布的广泛性和进化上高度的保守性.它耐酸，耐热， 90°C，加热5分钟仍可保留完全的活性。CaM的外形似哑铃，有两个球形的末端，中间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连，每个末端有两个Ca2+结构域，每个结构域可以结合一个Ca2+。因而CaM分子内与Ca2+ 有四个结合位点。CaM分子本身并无酶的活性，在无Ca2+的情况下，也不表现生物活性。在非刺激的细胞中钙调蛋白与Ca2+结合的亲和力很低；然而，如果由于刺激使细胞中Ca2+浓度升高时，Ca2+同钙调蛋白结合形成钙-钙调蛋白复合物(Ca2+/CaM)，就会引起钙调蛋白构型的变化，增强了钙调蛋白与许多靶蛋白结合的亲和力，从而执行其生物功能，与钙结合后，CaM发生构型上的变化，成为一些酶的激活物。再与酶结合时，又引起酶的构型变化，使由非活性态转为活性态，CaM-Ca2+成了这些酶作用时必不可缺的成分。CaM参与的生化反应很多，涉及不少关键性的酶，如控制信息传递中，第二信使 cAMP合成与分解的腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶；在糖原合成与分解中能提供和储存能量的磷酸化酶激酶和糖原合酶激酶，与蛋白质磷酸化及脱磷酸化有关蛋白激酶和蛋白磷酸解酶，能调节细胞内钙离子浓度，起着钙泵作用的Ca2+-ATPase,还有与平滑肌收缩有关的肌球蛋白轻链激酶等。故本发明所述的CaM结合肽可用于抗肿瘤和抗血管新生的应用。本发明所述CaM结合肽可用于抑制人宫颈癌HeLa细胞体外增殖的应用。本发明所述CaM结合肽可用于抑制人宫颈癌HeLa细胞迁移、粘附的应用。与现有技术相比，本发明具有以下优点
本发明所述的CaM结合肽即Sema4D钙调蛋白结合肽不仅具有血管新生抑制剂的功效， 还具有抑制肿瘤细胞增殖，粘附，迁移的特异性作用，有望开发成为一种新型的血管新生抑制剂，为临床提供一种新的抗肿瘤药物。上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图
详细说明如后。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。一、Sema4D I丐调蛋白结合肽抑制HeLa细胞的增殖
本实验选择人宫颈癌HeLa细胞,初步探讨了 Sema4D I丐调蛋白结合肽对HeLa细胞体外增殖的作用。HeLa细胞接种在含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素IOOug / ml的 RPMI-1640培养液中，置于37 ° C、5% C02培养箱内培养。每48h换液、传代I次，实验选取对数生长期细胞。步骤
O接种细胞用O. 25%胰酶消化对数生长期细胞，用完全培养基将细胞配成单细胞悬液，以适当密度接种于96孔板中，每孔IOOul;
2)培养细胞将培养板放入培养箱，在37°C，5%C02培养24h后给药；
3)实验设置药物处理组与空白对照组药物处理组每孔加入含有不同浓度(0.2、1、 5、25uM) Sema4D钙调蛋白结合肽的RPMI-1640完全培养液，各浓度均设3个复孔。空白对照组每孔加入IOOul不含多肽的RPMI-1640培养液。4)呈色培养48 h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20uL，37度继续孵育4h，终止培养，小心弃去孔内培养基和MTT，每孔加入IOOul DMS0,震荡IOmin,使甲臜充分溶解；
5)比色选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光值，记录结果。结果显示Sema4D钙调蛋白结合肽处理组与空白对照组比较，除了 O. 2uM组外，各浓度药物组OD值均明显低于对照组(P〈0. 01)，IuM多肽即可以显著抑制HeLa细胞的增殖。 且随给药浓度的升高，各浓度药物组OD值逐渐降低。说明Sema4D钙调蛋白结合肽对HeLa 细胞的增殖具有显著的抑制作用。二、Sema4D钙调蛋白结合肽抑制HeLa细胞的粘附
肿瘤细胞通过膜表面受体(整合素、钙粘蛋白和层粘蛋白受体等)黏附于基底膜及细胞外基质成分上(如纤维链接蛋白、层粘蛋白和IV型胶原蛋白)。黏附是癌细胞侵袭的始动步骤，高侵袭的肿瘤细胞与基底膜成分的异质性黏附能力通常增高，而肿瘤细胞间的同质性黏附能力则会下降。上述特性有利于肿瘤细胞与母体细胞分离，并侵犯基底膜等正常组织。本实验主要采用MTT比色实验测定HeLa细胞在细胞外基质上(Matrigel)的黏附。Matrigel是从EHS小鼠肉瘤中提取得到的可溶性基底膜抽提物，又被称作“人工基底膜胶”，其主要成分是IV型胶原和层黏连蛋白，与基底膜极为相似，因而在实验中被用作基底膜的替代品。步骤
O灭菌水分别配制2种溶液10g/L BSA (1%)，50mg/L Matrigel，1:8稀释液；
2)包被基底膜=Matrigel以50ul/孔分别加入96孔培养板，4°C过夜，BSA为对照基底 (阴性对照)；
3)水化基底膜吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37°C，30min;
4)接种细胞用O.25%胰蛋白酶消化细胞(正常培养或加药24h)，用含10g/L BSA的 1%培养基调整细胞密度为IO5个/ml，分别将IOOul细胞悬液接种于包被Matrigel的96孔培养板中，每组平行3个样本；
5)培养细胞37°C常规培养lh，观察并照相；
56) MTT比色法检测培养Ih后，酶标仪读数。结果显示与空白对照组比较，Sema4D钙调蛋白结合肽处理组能明显抑制HeLa 细胞在Matrigel上的粘附，20uMSema4D钙调蛋白结合肽可以将细胞粘附减少至72%，说明 Sema4D钙调蛋白结合肽可以抑制癌细胞侵袭的始动步骤，从而可能抑制癌细胞的转移。三、Sema4D钙调蛋白结合肽抑制HeLa细胞的迁移
迁移是肿瘤细胞转移过程中必不可少的环节之一。肿瘤细胞与母体瘤分离，穿越血管壁，侵袭周边正常组织时，需要一定的运动能力。我们采取了两种实验方法验证Sema4D钙调蛋白结合肽对HeLa细胞运动的影响。划痕实验步骤
O灭菌水分别配制2种溶液10g/L BSA (1%)，50mg/L Matrigel，1:8稀释液；
2)包被基底膜=Matrigel以50ul/孔分别加入96孔培养板，4°C过夜，BSA为对照基底 (阴性对照)
3)水化基底膜吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液， 37°C,30min;
4)制备培养单层细胞将肿瘤细胞密度调整为5XIO5个/ml，接种于包被Matrigel的 96孔培养板，每组平行3个样本，用10%的完全培养基培养直至形成细胞单层；
5)人工划痕在单层培养细胞上，用枪头划出“一”字型划痕，镜下记录划痕区相对距离，然后用无血清培养液洗涤；
6)更换含10g/LBSA的1%培养基，实验组加药，培养24h更换10%的完全培养基，继续培养24h并照相。Migration 实验步骤
O实验前一天，将Transwell小室放置于24孔板中，下室加入600ul的RPMI-1640培养液，上室加入IOOul的RPMI-1640培养液，培养箱过夜待用；
2)实验当天，首先向下室加入600ul的含10%FBS的RPMI-1640培养液，然后插入 Transwell小室，再将HeLa细胞用RPMI-1640培养基调节成5X IO5 cells/ ml的浓度， 向Transwell小室的上室内加入IOOul HeLa细胞(含5 X IO4个细胞)。在37 °C、5 % C02 的培养箱中；
3)培养24h后，用棉签擦去膜上方表面的HeLa细胞，紧贴上室边缘剪切下渗透膜， 置于4%的多聚甲醒中固定20min;
4)PBS洗三次后，1%的结晶紫染色30min，显微镜下随机6个视野计数穿过小室的细胞数。细胞划痕实验结果表明，Sema4D钙调蛋白结合肽也可以降低HeLa细胞的运动， 20uMSema4D I丐调蛋白结合肽处理组细胞愈合速度明显低于对照组；Transwell小室结果进一步显示Sema4D I丐调蛋白结合肽可以降低HeLa细胞的迁移能力。暗示Sema4D I丐调蛋白结合肽可以抑制肿瘤细胞的迁移，可能开发为抗肿瘤转移的药物。四、Sema4D钙调蛋白结合肽抑制HUVEC细胞的体外血管新生
如前述，抑制血管新生成为抗肿瘤治疗的新策略。实验中，内皮细胞在Matrigel上可形成类似于管腔的网格状结构，因此，体外实验中常用Matrigel胶模型模拟体内的血管新生。
步骤
O实验前一天将Matrigel从_20度取出，与实验所需枪头等置于放置于4度冰箱中备用;
2)实验当天，将Matrigel与无血清培养基I:I混合后，取50ul置于96孔板中，细胞培养箱孵育Ih ；
3)取实验用内皮细胞，完全培养基稀释至3XIO5个/ml，每孔IOOul加入预先孵育的 96孔板中，设对照组，实验组加药；
4)24h后显微镜下观察血管生成情况，并计血管形成数目。结果显示与空白对照组比较，Sema4D钙调蛋白结合肽处理后，细胞多形成不完整的网状结构。说明处理组HUVEC细胞在Matrigel上形成类似于管腔的网格状结构的能力明显下降。Sema4D钙调蛋白结合肽可开发为抗血管新生的有效药物。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.CaM结合肽，类型为氨基酸，分子类型为肽，其特征在于，所述CaM结合肽为实验室合成的Sema4D钙调蛋白结合肽，其含有编码对应于Sema4D结合CaM的序列，所述Sema4D钙调蛋白结合肽分子的序列由氨基酸的一字简码组成，表述如下NH2-GYL PRQ CLK FRS ALL IGK KKP KS-C00H。
2.根据权利要求I所述的CaM结合肽，其特征在于所述CaM结合肽在用于抗肿瘤的应用。
3.根据权利要求I所述的CaM结合肽，其特征在于所述CaM结合肽在用于抑制HUVEC 的体外血管新生的应用。
4.根据权利要求I或2所述的CaM结合肽，其特征在于所述CaM结合肽在用于抑制人宫颈癌HeLa细胞体外增殖的应用。
5.根据权利要求I或2所述的CaM结合肽，其特征在于所述CaM结合肽在用于抑制人宫颈癌HeLa细胞的迁移。
6.根据权利要求I或2所述的CaM结合肽，其特征在于所述CaM结合在肽用于抑制人宫颈癌HeLa细胞的粘附。
全文摘要
本发明公开了CaM结合肽，类型为氨基酸，分子类型为肽，所述CaM结合肽为实验室合成的Sema4D钙调蛋白结合肽，其含有编码对应于Sema4D结合CaM的序列，所述Sema4D钙调蛋白结合肽分子结构式为NH2-GYLPRQCLKFRSALLIGKKKPKS-COOH，所述CaM结合肽用于抗肿瘤和抑制HUVEC的体外血管新生的应用。该发明有望开发成为一种新型的血管新生抑制剂，为临床提供一种新的抗肿瘤药物。
文档编号A61K38/08GK102584946SQ20121006211
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者曾招, 朱力, 朱鹏飞 申请人:苏州大学