专利名称：一种黄芪提取物的应用的制作方法
技术领域：
本发明属中医药领域，涉及一种黄芪提取物；此外，本发明还涉及该黄芪提取物的制备方法和应用。
背景技术：
糖尿病的并发症之一 HAAF是糖尿病患者难以获得接近正常血糖控制的重要障碍。数据显示为了减少I型糖尿病远期并发症而采用的胰岛素强化治疗使得低血糖的发生率增加了近3倍。HAAF产生的机制主要是反复发作的低血糖大大削弱了肾上腺素、胰高糖素等反向调节激素对低血糖的应急调节，使得交感肾上腺系统对低血糖的反应明显迟钝，并且由于神经系统对低血糖的敏感性下降，患者自身往往对低血糖症状缺乏觉醒，尤其是睡眠过程中患者经常会在不自知的状态中血糖持续走低直至死亡，这一现象被命名为低
血糖相关的自主神经系统调节失败-简称HAAF(Hypoglycemia-Associated Autonomic
Failure)。HAAF的存在使得患者低血糖的发生率明显上升，而反复发生的低血糖又会进一步加重HAAF的程度，如此以来往往会陷入一个恶性循环，严重影响着患者的血糖控制。国外目前以耶鲁大学为首的几所著名内分泌实验室均在积极探讨HAAF发生的机制及应对措施，但在治疗方面尚无突破性进展。而治疗领域则主要是寻找能够重建机体肾上腺素、去甲肾上腺素、胰高糖素对低血糖的反应，提高机体对低血糖的预警机制的有效成分。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种黄芪提取物，可以用于治疗糖尿病并发症之一 HAAF，能够部分重建机体肾上腺素、去甲肾上腺素对低血糖的反应，提高机体对低血糖的预警机制。本发明要解决的技术问题之二是提供上述黄芪提取物的制备方法。本发明要解决的技术问题之三是提供上述黄芪提取物在制备防治糖尿病患者对低血糖荷尔蒙反向调节受损的药物中的应用。为解决上述技术问题，本发明提供一种黄芪提取物，含有黄芪甲甙IV，其含量不低于 O. 08mg/ml。中医学无HAAF这一病名，但是低血糖状态的乏力、心慌、肢冷、出汗甚至昏迷等现象和中医范畴的阳气暴脱极为相似，属于脱症的一种，多因久病消渴，气虚渐至阳虚，一个意外的原因或者治疗不当阳气脱于外，气衰而见乏力委顿，阳衰不能敛阴，则汗液妄泄，心气不足则心慌惊惕，甚者汗出如油，伴有肢冷、脉微、呼吸低弱甚至意识不清等见症，均合于阳气衰微所致。因此益气升阳是其法，黄芪首当其属。其次在临床实践中我们发现经常低血糖发作的患者往往伴有气虚见证，经过黄芪 (包括黄芪胶囊及黄芪注射液)治疗后患者的低血糖发生次数较前明显减少，血糖相对较为稳定，因此提示黄芪能够通过某些机制对抗HAAF。本发明的黄芪提取物，它是由一组有效成分组成，所述有效成分主要是皂甙类，特别是黄芪甲甙IV。本发明所涉及的原料药材黄芪为中国药典2000年版一部所收载中药，并符合药典质量要求。本发明还提供上述黄芪提取物的制备方法，包括如下步骤(I)将黄芪原药材加水煎煮3次，每次I. 5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至每 Iml相当于原药材I 2g ;(2)以75%及85%的乙醇两次沉淀，每次均冷藏放置12小时，回收乙醇并浓缩至每Iml相当于原药材IOg,用注射用水稀释至每Iml相当于原药材O. 75 Ig,冷藏放置12 小时，滤过，滤液浓缩至每Iml相当于原药材5 6g,放冷；(3)用20%氢氧化钠溶液调节pH值至7. 5，煮沸，加入O. 125%的活性炭，煮沸5 分钟，趁热滤过，加注射用水，滤过，再用20%氢氧化钠溶液调节pH值为6. 0-7. 5，滤过，灌封，灭菌，即得。本发明黄芪提取物通过上述水醇法提取制备，即水提取，醇沉淀法，并且使用两次醇沉，使该提取液中黄芪甲甙IV的含量不低于O. 08mg/ml，PH值约为6. 0-7. 5，可直接进入大鼠静脉系统。本发明的黄芪提取物在使用时，可以将其浓缩液灭菌后按照常规制剂方法制备成口服液，也可以将其干燥后与药学上常用的辅料制备成颗粒剂、胶囊剂、片剂、冲剂等。所述辅料包含稀释剂如乳糖、木糖醇、甘露醇、甲壳胺等，根据选择剂型的不同，可以按照现有的常规制剂方法(《药物制剂方法》，张劲主编，化学工业出版社，2005年8月出版)选择不同的辅料。可以选择的崩解剂如羧甲基淀粉钠CMS-Na、微晶纤维素等；粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、低取代羟丙基纤维素(L-HPC)、聚乙二醇(PEG)等； 稳定剂如山梨酸、对羟基苯甲酸酯、乙醇、枸橼酸等；包合剂如ο-环糊精(a-⑶)、p-环糊精 (P-CD)和N-LOK变性淀粉等；包衣剂如羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙二醇(PEG)、丙烯酸树脂等；矫味剂如蜂蜜、蔗糖等。在上述各种剂型药物的每日剂量中，黄芪提取物的含量比例因剂型的不同又很大差别，以其中的黄芪甲甙IV作为其有效成分含量标准，要保证成人每日服药量中含有黄芪甲甙IV 2.4mg及以上。本发明还提供上述黄芪提取物在制备防治糖尿病患者对低血糖荷尔蒙反向调节受损的药物中的应用。本发明黄芪提取物在HAAF模型大鼠低血糖钳夹实验中能够部分重建肾上腺素、 去甲肾上腺素对低血糖的反应曲线，胰高糖素也随之轻度升高；在正常老鼠的低血糖钳夹过程中也可使肾上腺素、去甲肾上腺素升高水平明显高于对照组。证明本发明中的黄芪有效组分具有重建HAAF模型大鼠部分荷尔蒙反应的作用。同时我们也发现了该有效组分能够激活大脑PVN、VMH、NTS等糖敏感部位的C-Fos基因蛋白表达，尤其是对下丘脑CRF神经核团的激活，从而提高了机体对低血糖的预警机制。本发明对糖尿病的并发症之一 HAAF具有很好的治疗前景。
图I-图3是本发明实验例I中黄芪有效组分对HAAF模型大鼠低血糖钳夹过程中荷尔蒙的重建示意图，包括肾上腺素(图I)，去甲肾上腺素(图2)以及葡萄糖输注率(图 3)。图4-图5是本发明实验例2中黄芪有效组分对正常大鼠脑组织糖敏感部位的激活作用示意图，包括PVN、NTS部位的c-Fos染色，以及PVN部位CRF与c-Fos的双重染色。图6是本发明实验例3中黄芪组及对照组c-Fos基因在PVN及NTS部位的表达情况示意图。图7是本发明实验例3中PVN部位CRF、Fos双重染色示意图，图7a中标尺长 200 μ m，图7b中标尺长30 μ m。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述实施例I取黄芪原药材2000g，加水煎煮三次，每次I. 5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至每Iml相当于原药材lg，用乙醇沉淀处理二次，第一次溶液中含乙醇量为75%，第二次为 85%，每次均冷藏放置12小时，回收乙醇并浓缩至每Iml相当于原药材10g，用注射用水稀释至每Iml相当于原药材O. 75g,冷藏放置12小时,滤过,滤液浓缩至每Iml相当于原药材 5g，放冷，用20%氢氧化钠溶液调节pH值至7. 5，煮沸，加入O. 125%的活性炭，煮沸5分钟， 趁热滤过，加注射用水使成1000ml，滤过，再用20%氢氧化钠溶液调节pH值至6. O 7. 5， 滤过，灌封，灭菌，即得。实施例2取黄芪原药材2000g，加水煎煮三次，每次I. 5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至每Iml相当于原药材2g，用乙醇沉淀处理二次，第一次溶液中含乙醇量为75%，第二次为 85%，每次均冷藏放置12小时，回收乙醇并浓缩至每Iml相当于原药材10g，用注射用水稀释至每Iml相当于原药材lg，冷藏放置12小时,滤过,滤液浓缩至每Iml相当于原药材6g, 放冷，用20%氢氧化钠溶液调节pH值至7. 5，煮沸，加入O. 125%的活性炭，煮沸5分钟，趁热滤过，加注射用水使成1000ml，滤过，再用20%氢氧化钠溶液调节pH值至6. O 7. 5，滤过，灌封，灭菌，即得。实施例3取黄芪原药材2000g，加水煎煮三次，每次I. 5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至每Iml相当于原药材I. 5g，用乙醇沉淀处理二次，第一次溶液中含乙醇量为75%，第二次为 85%，每次均冷藏放置12小时，回收乙醇并浓缩至每Iml相当于原药材10g，用注射用水稀释至每Iml相当于原药材O. 9g,冷藏放置12小时,滤过,滤液浓缩至每Iml相当于原药材
5.5g，放冷，用20%氢氧化钠溶液调节pH值至7. 5，煮沸，加入O. 125%的活性炭，煮沸5分钟，趁热滤过，加注射用水使成1000ml,滤过,再用20%氢氧化钠溶液调节pH值至6. O
7.5，滤过，灌封，灭菌，即得。以下通过实验例对本发明的有益效果作进一步的阐述实验例I黄芪有效组分对HAAF模型大鼠荷尔蒙重建作用I、药物该实验组使用药物均是按照实施例I制备的黄芪提取物，每I毫升液体含生药2 克，黄芪甲甙IV含量不低于O. 08毫克。对照组使用的药物是等体积无菌生理盐水。2、实验动物及HAAF动物模型造模SD大鼠，全部来自耶鲁大学实验动物中心。体重300g_350g，12-12小时昼夜节律
饲养，常规饮食。造模方法(参照 Feeding and neuroendocrine responses after recurrent insulin-induced hypoglycemia. Physiol Behav. 2006 Apr 15 ；87 (4) :700-6. Epub 2006 Feb 21等文献)连续3天早上9AM给予大鼠正规胰岛素腹腔注射，使之每次低血糖状态(PG < 2. 8mmol/L)持续2小时左右。其中第一天胰岛素剂量为10U/Kg，第二天胰岛素剂量为 9U/Kg，第三天降至6U/Kg。具体剂量可以根据动物的实际情况予以调整。每隔15分钟尾端采血测血糖，如血糖持续一小时仍高于2. 8mmol/L者，重新给予半量胰岛素腹腔注射，同时尽量避免动物因低血糖诱发癫痫发作或死亡。实验结束后恢复动物正常进食。3、实验方法实验第I天，大鼠在麻醉情况下于胸锁关节上方开一 Icm切口，左侧颈动脉和右侧颈内静脉分别放置自制心脏套管，交叉绕过颈部，动脉PVP封管，静脉肝素盐水封管，以备每天注射黄芪或生理盐水使用。术后恢复3天，从实验第4天开始每天通过静脉留置套管给药，比照60公斤成人体重黄芪常规用量，按照体表面积换算法，I. 5ml原液稀释至3ml，(含生药约3克)，对照组给等量生理盐水。实验第8天开始连续三天动物造模。实验第10天动物当晚5PM开始禁食，实验第11天进行低血糖钳夹实验。采用20% 葡萄糖和20mU/min/kg的正规胰岛素微泵推注，通过调整葡萄糖推注速率使目标血糖维持在2. 8mmol/L左右。两组大鼠开管后预置一小时，待其充分安静下来，分别微泵给予黄芪注射液和生理盐水推注30分钟，速率20ul/min，30分钟后接通胰岛素和糖。从O分钟开始每隔30分钟取一次大样以供各种荷尔蒙检测之用，每隔10分钟取小样一次，检测中心血糖， 根据血糖及时调整葡萄糖用量。钳夹实验共持续120分钟。4、实验结果经过黄芪的干预，HAAF模型大鼠在低血糖钳夹实验中荷尔蒙得到了很大程度的重建，具体见表I及图I-图3。如图I所示，HAAF模型大鼠低血糖钳夹实验中显示黄芪组肾上腺水平明显高于对照组。如图2所示，HAAF模型大鼠低血糖钳夹实验中显示黄芪组去甲肾上腺水平明显高于对照组。如图3所示，HAAF模型大鼠低血糖钳夹实验中显示黄芪组需糖量略低于于对照组。表I黄芪组与对照组60-120分钟各种荷尔蒙平均水平比较(X 土SD) (pg/ml)肾上腺素去甲肾上腺素胰高糖素肾上腺皮质激素
黄芪组(n=9) 对照组(n=10)2303. 33±652. 94 1417. 20±606. 32**970. 30±623. 94 510. 20±173· 83*213. 59±138· 12 133. 17±65. 54906. 33±201. 28 693. 81 ±120. 54注与对照组比较，*p < O. 05，林P < O. 01实验例2黄芪有效组分对普通大鼠低血糖钳夹过程中荷尔蒙的影响I、药物及动物来源均同实验例I2、实验方法手术方法同实验例1，动物无需造模，实验第7天开始每天通过静脉留置套管给药，比照60公斤成人体重黄芪常规用量，按照体表面积换算法，I. 5ml原液稀释至3ml，(含生药约3克)，对照组给等量生理盐水。实验第10天动物当晚5PM开始禁食，实验第11天进行低血糖钳夹实验。采用20% 葡萄糖和20mU/min/kg的正规胰岛素微泵推注，通过调整葡萄糖推注速率使目标血糖维持在2.8mmol/L左右。两组大鼠开管后预置一小时，待其充分安静下来开始高胰岛素低血糖钳夹实验，实验过程不再推注黄芪提取液，其他同实验例I。实验结果具体见表2及图4-图5。如图4所示，正常大鼠低血糖钳夹实验中显示黄芪组肾上腺素水平明显高于对照组。如图5所示，正常大鼠低血糖钳夹实验中显示黄芪组需糖量明显低于对照组。表2黄芪组与对照组60-120分钟各种荷尔蒙平均水平比较^土 SD) (pg/ml)
肾上腺素去甲肾上腺素胰高糖素黄芪组(η=7)4460. 18 ±2012. 39739. 33 ±540. 97326. 11 ±207. 05对照组(η=6)2613. 06±1117· 21*564. 83±250. 41237. 28±110· 54注与对照组比较，*p < O. 05实验例3脑组织切片染色脑组织切片PBS清洗10分钟，放入PBT-叠氮化物(PBT-azide)溶液中，加入O. 3% 新鲜驴血清和I : 10000兔抗FOS抗体过夜。次日PBS清洗后分别放入加有生物素酰基化驴抗兔血清和O. 3%新鲜驴血清的PBT溶液中以及加有抗生物素蛋白生物素酰基化过氧化物酶混合物(ABC-Elite试剂盒，Vector实验室；1 250)的PBT溶液中各反应一小时，最后用0.04% 3,3’ -二氨基联苯胺四氢氯化物(DAB ；Sigma)and O. 003%过氧化氢显色,镜检成功后封片，完成C-Fos的染色。脑组织切片PBS清洗10分钟，放入PBT-azide溶液中，加入O. 3%新鲜驴血清和 I 500羊抗-FOS抗体以及I : 1000的生物素酰基化CRF抗兔血清避光过夜。次日PBS 清洗后加入含有I : 1000生物素酰基化驴抗兔血清和O. 3%新鲜驴血清的PBT中避光孵化一小时，最后加入含有O. 3%新鲜驴血清以及I : 1000亚历山大荧光594共轭抗生蛋白链菌素和I : 400亚历山大荧光488驴抗兔抗体的PBT溶液中避光反应一小时，完成C-Fos 和CRF神经核团的染色。上述染色方法均经多次验证，染色稳定，可重复性强。结果显示与对照组相比黄芪组下丘脑PVN、NTS部位C-Fos基因表达明显活跃，见图6，黄芪组CRF神经核团染色与c-Fos 双重染色后可见其共同表达于同一细胞当中，说明其有效激活了 CRF神经核团，而对照组 CRF神经核团中则几乎看不到c-Fos的表达，见图7。由此我们推测黄芪注射液存在某种机制能够通过促进PVN分泌CRF，提高机体在低血糖状态下儿茶酚胺的水平，从而对HAAF有效。
权利要求
1.一种黄芪提取物在制备防治糖尿病患者对低血糖荷尔蒙反向调节受损的药物中的应用，所述黄芪提取物含有黄芪甲甙IV，其含量不低于O. 08mg/ml。
全文摘要
本发明公开了一种黄芪提取物在制备防治糖尿病患者对低血糖荷尔蒙反向调节受损的药物中的应用，所述黄芪提取物含有黄芪甲甙IV，其含量不低于0.08mg/ml。本发明动物实验表明本发明中的黄芪有效组分具有重建HAAF模型大鼠部分荷尔蒙反应的作用，能够激活大脑中PVN、NTS等糖敏感部位以及激活CRF神经核团，从而提高了机体对低血糖的预警机制。该发明对糖尿病的并发症之一HAAF具有很好的治疗前景。
文档编号A61K36/481GK102600230SQ20121006192
公开日2012年7月25日 申请日期2009年1月20日 优先权日2009年1月20日
发明者周里钢, 桑珍, 范晓宁 申请人:上海中医药大学附属曙光医院