专利名称：一种免疫类毒素的制备方法
技术领域：
[O本发明涉及一种药品原料的制备方法，尤其是ー种免疫类毒素的制备方法。
背景技术：
一种致病性细菌所产生的特异性毒性物质ー细菌毒素经脱毒处理而保留免疫原性称之为类毒素。类毒素是ー种自动免疫制剂，用于细菌毒素性疾病的预防及治疗。现常用生产类毒素的方法是选择培养基和菌种，菌种经人工培养后产生毒素，毒素脱毒后形成类毒素。目前，非常成熟的类毒素有破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱类毒素
寸ア ΡΠ οCN101869704A公开了单剂免疫破伤风类毒素阳离子葡聚糖微球及其制备方法，其特特征是由破伤风类毒素通过静电作用后栽在阳离子甲基丙烯酸羟こ酯葡聚糖微球上制·得。ZL87104279公开了类毒素制备新方法，包括用一定量氧化剂处理至少部分分离的毒素，以对所说毒素进行化学灭活，但同时保留其免疫性，此后从中获得灭活的毒素。CN1798548公开了基于含吸附类毒素和含多糖抗原微粒体的免疫原性组合物，该发明是将类毒素抗原或含多糖的抗原吸附在微粒体上形成免疫原性组合物。蟾蜍是ー种两栖动物，生存环境是阴湿、细菌病毒滋生的区域，蟾蜍生命力极强，抗性应答产生大量的毒素以抵抗外界细菌、病毒的侵蚀。
发明内容
现有的类毒素生产采用菌种和培养基为主要生产原料，菌种经人工培养后产生毒素，毒素脱菌后形成类毒素，因此菌种及培养基筛选的局限性，培养过程的长周期性都影响类毒素的产量和质量。针对现有类毒素培养方法存在的问题，本发明提供ー种以中药材蟾蜍或蟾蜍干皮为原料的免疫类毒素的制备方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的(1)以蟾蜍的鲜品或干品为原料，破碎或粉碎；
(2)然后加入纯净水搅拌均匀，固液比为lkg:2 30L，加入O.I IOOg胰蛋白酶，在25 50°C酶解4 48h ；
(3)用分离机以3000 15000r/min分离上述酶解物，收集的液体用缓冲液调pH=7. O 9. 0，控制温度为25 45°C，加I IOOg戊ニ醛或甲醛脱毒处理30 60d，成为免疫脱毒液粗品；
(4)将Ikg免疫脱毒液粗品加入氨水调pH=8 10，再加入100 300g硫酸铵及10 500g活性白土，常温条件下生成沉淀并放置I 24h ;
(5)上述物料用膜孔径O.2 10 μ m微孔过滤机过滤并且用膜孔径8 120nm超滤机超滤处理，收集超滤液；(6)收集的超滤液注入到分离柱中，在压カO.2 5Mpa、流速10 500mL/min条件下分离纯化得免疫类毒素；
(7)分离纯化的免疫类毒素用氢氧化招溶液或磷酸 丐溶液吸附，常温条件吸附时间12 24h，成为稳定性免疫类毒素。本发明的免疫类毒素是以中药材蟾蜍或蟾蜍干皮为原料制备的ー种类毒素，采用蟾蜍为基本原料生产类毒素，解决了菌种及培养基筛选的局限性问题而且没有培养过程，由于各种蟾蜍的毒素成分清楚，其エ艺简单实用，成本低，因此本发明脱毒过程易于控制能保证类毒素的生物活性。为中药材蟾蜍的应用提供了更加广泛的途径。
图I为膨胀溶剂体系提取装置的结构示意图。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式按照下述方法制备免疫类毒素1、以中华大蟾蜍或黑眶大蟾蜍或花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍的鲜品或干品为原料经破碎或粉碎；2、用化学缓冲溶液在一定温度、时间、压カ条件下提取；3、分离机固液分离；4、酸沉法或有机溶剂法或变温法去蛋白；5、化学法或物理法灭活；6、微滤过滤及超滤法浓缩；7、凝胶色谱层析分离并用超声驻波液相制备色谱纯化；8、稳定化处理；9、将免疫类毒素作为活性成分并与适宜的赋形剂相结合制备成药品用于调节人体机能免疫功能。具体方法如下
(1)选用中华大蟾蜍或黑眶大蟾蜍或花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍的干品用粉碎机粉碎至过100 150目筛，收集粉末；
(2)将IOOOg粉末放入微波炉中以功率1000 2500W，加热I 20min杀菌处理，然后自然冷却至室温；
(3)上述冷却至室温的粉状物加入2 20L纯净水混合均匀后，加入O.I 50g胰蛋白酶，保持温度25 50°C，酶解4 48h ;
(4)用分离机以3000 15000r/min分离上述酶解物，收集的液体用O.2mol/L磷酸氢ニ钠与O. lmol/L柠檬酸组成的缓冲液调pH=7. O 9. 0，控制温度为35 45°C，加I IOOg戊ニ醛脱毒处理30 60d，成为免疫脱毒液粗品；
(5)将Ikg免疫脱毒液粗品加入氨水调pH=8 10，再加入100 300g硫酸铵及10 200g活性白土，常温条件下生成沉淀并放置I 24h ;
(6)上述物料用膜孔径O.2 10 μ m微孔过滤机过滤并且用膜孔径8 120nm超滤机超滤处理，收集超滤液；
(7)收集的超滤液注入到SephadexG75或SephadexGlOO分离柱中，在压カ2 5Mpa、流速10 500mL/min条件下分离纯化得免疫类毒素；
(8)分离纯化的免疫类毒素用I 15mg/mL氢氧化招溶液或I 10mg/mL磷酸|丐溶液吸附，常温条件吸附时间12 24h，成为稳定性免疫类毒素。(9)将免疫类毒素作为活性成分，并与适宜的赋形剂相结合制备成药品用于调节人体机能免疫功能。
具体实施方式
ニ 本实施方式按照下述方法制备免疫类毒素(1)选用2 4龄中华大蟾蜍或黑框大蟾蜍或花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍，在温度-10 _30°C冷冻，用绞肉机绞碎再用磨浆机磨成浆；
(2)在膨胀溶剂体系提取装置中，Ikg浆体加入2 20kg甲醇或こ醇或こ酸こ酷，充入10 50kg ニ氧化碳,加压至O. 2 IOMpa,常温条件下保持时间30 120min,然后降压至
常压；
(3)用分离机以3000 15000r/min分离上述物料,收集固形物；
(4)lkg固形物加入10 30L纯净水搅拌均匀，加入I IOOg胰蛋白酶，在25 50°C酶解5 48h ;
(5)用分离机以3000 15000r/min分离上述酶解物，收集浆液， 用O.2mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液调整pH=7. O 7. 6，控制温度25 45°C，加10 IOOg甲醛脱毒30 60天,成为免疫类毒素粗品；
(6)将Ikg免疫类毒素粗品加入氨水调整pH=8 9，再加入200 300g硫酸铵及10 500g活性白土，常温条件下沉淀并放6 24h ;
(7)上述物料用膜孔径O.2 10 μ m微滤机过滤并且用膜孔径8 120nm超滤机超滤处理；
(8)将超滤液注入到SephadexG75或SephadexG150分离柱中，在压カO.2 I. OMpa>流速100 500mL/min条件下分离纯化成免疫类毒素；
(9)将纯化免疫类毒素用I 10g/L氢氧化招溶液或I 50g/L磷酸韩溶液吸附,常温条件下吸附12 24h成稳定性免疫类毒素。如图I所示，本实施方式中所述膨胀溶剂体系提取装置由球形膨胀溶剂体系提取器I、原料罐2、固液分离器3、气固分离器4、成品罐5、外源ニ氧化碳瓶6、ニ氧化碳储罐7、ニ氧化碳循环压カ泵8和溶剂罐9组成，球形膨胀溶剂体系提取器I通过管线分别与原料罐2、固液分离器3、ニ氧化碳循环压カ泵8及溶剂罐9相连接，固液分离器3与气固分离器4相连接，气固分离器4通过管线分别与成品罐5及ニ氧化碳储罐7相连接，ニ氧化碳储罐7通过管线分别与外源ニ氧化碳瓶6及ニ氧化碳循环压カ泵8连接。免疫调节作用实验
(I)选用BALB/C近亲系小鼠，6 8周龄，18 22g,雌性小鼠40只，雄性小鼠40只，经ロ服15 30天。其中O组为对照组，不喂免疫类毒素，I组每日服用O. 2g，II组每日服用O. 6g, III组姆日服用I. 2g。(2)细胞免疫功能检测 ①淋巴细胞转化实验
MTT法原理MTT是四氮唑盐的一种可以接受氢原子的染料，当T淋巴细胞受伴刀豆蛋白刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是増殖细胞线粒体中的水解酶在细胞体内可以将MTT分解为蓝紫色的结晶而显色，其光密度值能够反映细胞的増殖情况。死亡细胞则无此功倉^:。用加伴刀豆蛋白孔的光密度值减去不加伴刀豆蛋白孔的光密度值代表淋巴细胞的増殖能力。受试物组的光密度值的测定结果均低于对照组的光密度值。 实验结果表明，三组实验小鼠服用免疫类毒素后T淋巴细胞均有不同的増殖反应(表 1)。表权利要求
1.ー种免疫类毒素的制备方法，其特征在于所述方法如下 (1)以蟾蜍的鲜品或干品为原料，破碎或粉碎； (2)然后加入纯净水搅拌均匀，固液比为Ikg2 30L，加入O. I IOOg胰蛋白酶，在25 50°C酶解4 48h ; (3)用分离机以3000 15000r/min分离上述酶解物，收集的液体用缓冲液调pH=7. O 9. 0，控制温度为25 45°C，加I IOOg戊ニ醛或甲醛脱毒处理30 60d，成为免疫脱毒液粗品； (4)将Ikg免疫脱毒液粗品加入氨水调pH=8 10，再加入100 300g硫酸铵及10 500g活性白土，常温条件下生成沉淀并放置I 24h ; (5)上述物料用膜孔径O.2 10 μ m微孔过滤机过滤并且用膜孔径8 120nm超滤机超滤处理，收集超滤液； (6)收集的超滤液注入到分离柱中，在压カO.2 5Mpa、流速10 500mL/min条件下分离纯化得免疫类毒素； (7)分离纯化的免疫类毒素用氢氧化招溶液或磷酸 丐溶液吸附，常温条件吸附时间12 24h，成为稳定性免疫类毒素。
2.根据权利要求I所述的免疫类毒素的制备方法，其特征在于所述蟾蜍为中华大蟾蜍、黑眶大蟾蜍、花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍。
3.根据权利要求I或2所述的免疫类毒素的制备方法，其特征在于所述蟾蜍为2 4龄。
4.根据权利要求I所述的免疫类毒素的制备方法，其特征在于所述缓冲液由O.2mol/L磷酸氢ニ钠与O. lmol/L柠檬酸组成。
5.根据权利要求I所述的免疫类毒素的制备方法，其特征在于所述缓冲液由O.2mol/LNa2HPO4-NaH2PO4 组成。
6.根据权利要求I所述的免疫类毒素的制备方法，其特征在于所述分离柱为SephadexG75、SephadexGlOO 或 SephadexG150。
7.根据权利要求I所述的免疫类毒素的制备方法，其特征在于所述制备方法具体步骤如下 (1)选用中华大蟾蜍或黑眶大蟾蜍或花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍的干品用粉碎机粉碎至过100 150目筛，收集粉末； (2)将IOOOg粉末放入微波炉中以功率1000 2500W，加热I 20min杀菌处理，然后自然冷却至室温； (3)上述冷却至室温的粉状物加入2 20L纯净水混合均匀后，加入O.I 50g胰蛋白酶，保持温度25 50°C，酶解4 48h ; (4)用分离机以3000 15000r/min分离上述酶解物，收集的液体用O.2mol/L磷酸氢ニ钠与O. lmol/L柠檬酸组成的缓冲液调pH=7. O 9. 0，控制温度为35 45°C，加I IOOg戊ニ醛脱毒处理30 60d，成为免疫脱毒液粗品； (5)将Ikg免疫脱毒液粗品加入氨水调pH=8 10，再加入100 300g硫酸铵及10 200g活性白土，常温条件下生成沉淀并放置I 24h ; (6)上述物料用膜孔径O.2 10 μ m微孔过滤机过滤并且用膜孔径8 120nm超滤机超滤处理，收集超滤液； (7)收集的超滤液注入到SephadexG75或SephadexGlOO分离柱中，在压カ2 5Mpa、流速10 500mL/min条件下分离纯化得免疫类毒素； (8)分离纯化的免疫类毒素用I 15mg/mL氢氧化招溶液或I 10mg/mL磷酸|丐溶液吸附，常温条件吸附时间12 24h，成为稳定性免疫类毒素。
8.根据权利要求I所述的免疫类毒素的制备方法，其特征在于所述方法具体步骤如下 Cl)选用2 4龄中华大蟾蜍或黑框大蟾蜍或花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍，在温度-10 _30°C冷冻，用绞肉机绞碎再用磨浆机磨成浆； (2)在膨胀溶剂体系提取装置中，Ikg浆体加入2 20kg甲醇或こ醇或こ酸こ酷，充入10 50kg ニ氧化碳,加压至O. 2 IOMpa,常温条件下保持时间30 .120min,然后降压至常压； (3)用分离机以3000 15000r/min分离上述物料,收集固形物； (4)lkg固形物加入10 30L纯净水搅拌均匀，加入I IOOg胰蛋白酶，在25 50°C酶解5 48h ; (5)用分离机以3000 15000r/min分离上述酶解物，收集浆液，用O.2mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液调整pH=7. O 7. 6，控制温度25 45°C，加10 IOOg甲醛脱毒30 60天,成为免疫类毒素粗品； (6)将Ikg免疫类毒素粗品加入氨水调整pH=8 9，再加入200 300g硫酸铵及10 500g活性白土，常温条件下沉淀并放6 24h ; (7)上述物料用膜孔径O.2 10 μ m微滤机过滤并且用膜孔径8 120nm超滤机超滤处理； (8)将超滤液注入到SephadexG75或SephadexG150分离柱中，在压カO.2 I. OMpa>流速100 500mL/min条件下分离纯化成免疫类毒素； (9)将纯化免疫类毒素用I 10g/L氢氧化招溶液或I 50g/L磷酸韩溶液吸附,常温条件下吸附12 24h成稳定性免疫类毒素。
全文摘要
一种免疫类毒素的制备方法，涉及一种药品原料的制备方法。本发明按照下述方法制备(1)以蟾蜍的鲜品或干品为原料，破碎或粉碎；(2)酶解；(3)脱毒；(4)加入硫酸铵及活性白土，沉淀；(5)微滤和超滤；(6)纯化；(7)稳定性化处理。本发明的免疫类毒素是以中药材蟾蜍或蟾蜍干皮为原料制备的一种类毒素，其工艺简单实用，成本低，为中药材蟾蜍的应用提供了更加广泛的途径。
文档编号A61K35/56GK102657683SQ20121017901
公开日2012年9月12日 申请日期2012年6月2日 优先权日2012年6月2日
发明者徐华民, 徐萌, 赵艳琨, 赵荣华 申请人:哈尔滨工业大学