专利名称：人源干细胞与灵芝孢子生物活性物质组合物及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及1，从健康人的脐带或胎盘组织中提取干细胞，经体外培养、扩增，然后利用此类干细胞制备生物活性物质；2，筛选饱满成熟灵芝孢子，通过现代萌动激活技术，使其三萜类化合物、生物碱、灵芝留醇和活性酶等多种活性物质的生物转化并提升至高峰值，再利用超低温纳米技术提取其生物活性物质；3，将人源干细胞生物活性提取物与灵芝孢子生物活性提取物按一定比例配伍形成组合物并应用。
背景技术：
干细胞(stem cell)是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体， 是形成人体各种组织、器官的“祖宗细胞”、“万能细胞”。根据其发育阶段可分为胚胎干细胞和成体干细胞，根据分化潜能大小又可以分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞可以产生和分泌大量生物活性因子，这些干细胞生物活性因子可有设调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。例如干细胞可以产生干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、基质细胞源性生长因子(SDF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素6与7(IL-6与IL-7)、巨核细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等因子，其中大部分细胞因子都具有促进细胞增殖、分化作用，抑制炎症因子与抗凋亡效应密切相关等；干细胞还可以产生天然免疫蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等，从而抵御或修复自身和外界因素对机体细胞的损伤。研究表明人体骨髓、血管、脂肪组织、骨骼肌、心脏和大脑，也包括在肺、肝、胰腺、消化道、皮肤、视网膜、乳房、卵巢、前列腺和睾丸的上皮内均可分离到相应的干细胞。理论上，干细胞可以修复身体任何部位的组织缺损，可以利用干细胞去治疗遗传疾病、恶性疾病和退变性疾病等。2007年10月10日，国际干细胞权威杂志《Cell》系列刊物《CelI-Stem Cell))的一篇研究论文揭示干细胞功能下降可导致人类衰老，并证明干细胞衰老过程是受到外在和内在因素共同调控的。因此，利用干细胞分泌产生的生物活性因子或干细胞内的生物活性物质激活机体干细胞，进而通过自身干细胞生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞，在疾病防治与保健美容领域具有广阔的应用前景。灵芝是一种药用真菌，是传统中药宝库中的一味珍贵药材。灵芝被广泛用于防止多种疾病，具有抑制肿瘤和增强免疫力的功效，且无毒副作用，同时灵芝能有效防止氧化损伤以及由此引起的疾病。灵芝孢子如同灵芝子实体一样，也含有大量的生物活性物质，且灵芝孢子的生物活性物质比灵芝子实体更高。鉴于上，我们研究开发从人源干细胞和灵芝孢子中提取生物活性物质，利用这两类生物活性物质组合物发挥综合效应，活化人体自身干细胞来生理性修复或替代机体损伤、病变和衰老的组织细胞，增强机体免疫力。
发明内容
本发明的目的是1、提供干细胞与灵芝孢子生物活性物质的制备方法；2、提供一种干细胞生物活性物质与灵芝孢子生物活性物质组合物的制备方法及其应用。本发明的技术方案如下 从健康人的脐带或胎盘中提取干细胞，使之在体外培养、扩增，并维持干细胞的高增殖能力和稳定性状。脐带或胎盘干细胞体外最多传代至第5代，此时的干细胞不但产量大，而且性状稳定，收集此时细胞。调整细胞至合适浓度密封于冻存管中，经液氮反复冻融至细胞破碎，再通过低温分离、纯化等现代生物技术手段，即可获得高纯度的干细胞生物活性物质群。整个过程要求无细菌、真菌和支原体等污染。利用种子筛选机筛选新鲜、成熟、饱满、均一的灵芝孢子，放置于专用灵芝孢子萌动培养箱中，在控光条件下，经恒定温水喷洒，采用数字式红外水份仪不断测定灵芝孢子的含水量，控制其含水量在一定范围内，同时利用氧含量测定仪，通过连接含氧气的钢瓶控制灵芝孢子萌动激活时的周围氧气含量。经过一定阶段的萌动培养，激发孢子中的灵芝三萜类化合物、生物碱、灵芝留醇和活性酶等多种活性物质的生物转化并提升至高峰值，生物活性显著提升并达到顶峰。筛选萌动激活后的灵芝孢子立即转移至超低温环境中一定时间，使其硬化变脆。超低温微米级研磨，去壳。去壳后的灵芝孢子粉置于纳米研磨机中，进行超低温细磨，获得大小均一的纳米级颗粒，且低温保证了活性物质的最低损耗。最后，经冷凝干燥，去除一定水分，即可获得高品质灵芝孢子粉。最后，将从人源干细胞和灵芝孢子中提取的生物活性物质按照一定比例配伍形成组合物，该组合物富含干细胞因子群、多肽、天然免疫蛋白、核酸、三萜类化合物、生物碱、灵芝甾醇和活性酶等多种活性物质，可促进机体干细胞增殖、分化，提高身体免疫力和抗衰老作用。该活性物质组合物可制成片剂、粉剂或胶囊，在医学和保健领域有极佳的应用前景。本发明首次将人源与植物源干细胞性质生物活性提取物进行配伍，在发挥各自优势的基础上协同作用，使之发挥更大的综合效应，从而更好地提高身体免疫力和抗衰老等，其效果优于单独使用干细胞活性物或灵芝孢子粉。
具体实施例方式实施例I、脐带或胎盘干细胞生物活性物质的制备从健康人的脐带或胎盘组织提取干细胞，此干细胞主要为间充质干细胞，获得的干细胞进行体外培养、扩增。原代细胞收集后按I : 2比率进行传代培养，当细胞约80%汇合时，利用胰酶进行消化、收集，按相同的比率进行传代，最多传代培养至第5代，收集5代以内(包括第5代)的细胞，此时收集的干细胞生物学性状稳定，增值能力强，同时收集培养、扩增过程中更换的废培养液于_80°C冰箱中保存。具体过程如下I、采集健康人的脐带；2、去掉脐带内血管和外层薄膜；3、将脐带组织剪切成I 2mm3大小的小块；4、将剪切后小块种植于加有无血清间充质干细胞培养液的培养皿(直径为IOOmm)中，置于37°C、饱和湿度、5% GO2培养箱中培养；5、每3 4天半量换液，培养14 16天细胞生长约80%汇合，并收集更换的废培养液于-80°C冰箱中保存；6、当细胞约80%汇合时，利用O. 25%胰酶对细胞进行消化，以I 3X IO5Cells/ml接种于培养皿中传代培养，并收集更换的废培养液于_80°C冰箱中保存；7、当细胞约80%汇合时，利用O. 25%胰酶对细胞进行消化，收集第I代细胞，按I 2比率进行传代，置于37°C、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养，并收集更换的废培养液于-80°C冰箱中保存；8、若需多次传代，重复步骤⑦即可；9、分离、纯化获得高纯度间充质干细胞，利用FACS Calibur流式细胞仪分析其间 充质干细胞纯度。10、将体外培养获得的脐带或胎盘组织干细胞浓度调整为5 X IO6 I X IO7个/毫升密封于冻存管中，经超低温液氮反复冻融4 5次至细胞破碎，再通过低温分离、纯化等现代生物技术手段，便可获得高纯度的干细胞内生物活性物质群。实施例2、灵芝孢子生物活性物质的制备I、利用种子筛选机筛选新鲜、成熟、饱满、均一的灵芝孢子，放置于专用灵芝孢子萌动培养箱中2、在控光条件下，经恒定温水(20°C 24°C )喷洒培养箱中的灵芝孢子，采用数字式红外水份仪不断测定灵芝孢子的含水量，控制其含水量在50% 60%范围内；3、利用氧含量测定仪，测定灵芝孢子培养环境的氧含量，通过连接含氧气的钢瓶控制灵芝孢子萌动激活时的周围氧气含量在21% 23%范围内；4、经过8 10小时的萌动培养，根据灵芝孢子耗氧量，确定激发孢子中的灵芝三萜类化合物、生物碱、灵芝留醇和活性酶等多种活性物质的生物转化并提升至高峰值，生物活性显著提升并达到顶峰。5、筛选萌动激活后的灵芝孢子，立即转移至超低温环境(_75°C _85°C )中10小时以上，使其硬化变脆；6、超低温微米级研磨，去壳；7、去壳后的灵芝孢子粉置于纳米研磨机中，进行超低温细磨，获得大小均一的纳米级颗粒；8、纳米级灵芝孢子粉经冷凝干燥，去除一定水分，即可获得高品质灵芝孢子粉；实施例3、干细胞与灵芝孢子生物活性组合物的制备及其应用将从干细胞和灵芝孢子中提取的生物活性物质按照I : (15 20)的质量比例进行均匀混合，即可获得所需组合物，该组合物可以制成片剂、粉剂或胶囊应用于抗衰老、提高免疫力等医学保健领域。
权利要求
1.人源干细胞与灵芝孢子生物活性物质组合物及其制备方法，其特征是干细胞生物活性物质来源于人脐带或胎盘组织的干细胞，其内富含干细胞因子群、活性多肽、免疫蛋白和核酸等物质；灵芝孢子生物活性物质来源于萌动激活后的灵芝孢子，其内富含三萜类化合物、生物碱、灵芝留醇和活性酶等多种活性物质，其制备方法为提取人源干细胞一体外培养、扩增一超低温液氮反复冻融至细胞破碎一低温分离、纯化干细胞生物活性物质；萌动激活灵芝孢子一超低温冷冻脆化一超微研磨去壳一纳米级研磨制粉，最后将两者按一定比例配伍形成组合物，该组合物可应用于医学保健领域。
2.根据权利要求I所述的干细胞，其特征是来源于健康人的脐带或胎盘，经体外培养、扩增获得。
3.根据权利要求2所述的干细胞，其特征是包含但不限于间充质干细胞。
4.根据权利要求I所述的干细胞生物活性物质，其特征是包括细胞内容物和分泌因子。
5.根据权利要求I所述的灵芝孢子，其特征是经过萌动激活。
6.根据权利要求I所述的灵芝孢子生物活性物质，其特征是从萌动激活后的灵芝孢子中提取，富含高活性生物因子。
7.根据权利要求I所述的组合物，其特征是人源干细胞与灵芝孢子生物活性物质按I (15 20)的质量比例进行均匀混合，但不限于此比例。
8.根据权利要求I所述的医学保健用途，其特征主要是提高机体免疫力和抗衰老等。
全文摘要
本发明公开了一种人源干细胞与灵芝孢子生物活性物质组合物及其制备方法。首先提取、扩增健康人源干细胞和萌动激活灵芝孢子，再利用超低温、纳米等现代生物技术制备生物活性物质。最后按照一定比例配伍两类生物活性物质形成组合物，利用该组合物可开发成具有细胞生物学活性功能的产品，作用于人体后可活化机体干细胞，修复或替代受损、病变和衰老的细胞，调节机体细胞代谢功能，增强机体免疫力，抗衰老等功效。
文档编号A61P37/04GK102949418SQ201210194819
公开日2013年3月6日 申请日期2012年6月2日 优先权日2012年6月2日
发明者郑家德 申请人:郑家德, 张正前