专利名称：可溶性白细胞介素6受体在制备抗病毒药物上的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及可溶性白细胞介素6受体在制备抗病毒药物上的用途，属于生物医药技术领域。
背景技术：
白细胞介素-6受体(IL6R)最早是作为IL-6结合受体蛋白被发现的。IL6R和称为信号转导蛋白的gpl30在细胞膜上共同 作用完成IL-6信号通路转导。IL6R以膜受体的形式仅在肝细胞、中性粒细胞、单核-巨噬细胞和部分淋巴细胞上有表达，其可溶形式sIL6R则可在多种体液中被发现。sIL6R的产生途径有两种一是编码IL-6R的基因经mRNA翻译合成后直接释放进入细胞外液；二是膜受体的限制性蛋白降解，即在酶的作用下从膜上被分解。IL6的跨膜信号传递形式又分为两种经典信号通路和反式信号通路。经典途径中，IL6与膜IL6R结合后经受体相关联的gpl30向胞内传递次级信号，反式信号通路中，由IL6与游离在细胞外液中的亚单位IL6Ra结合成ILR/IL6Ra复合体，其后再结合至膜表面的gpl30亚单位上，然后完成信号传递，激活的JAK、STAT3通路促进恶性细胞增生和生存的能力，而STATl则起到抑制肿瘤生长的作用，这也从一定程度上说明，SIL6R的生物学功能与肿瘤以及炎症相关。后续也有研究报道指出IL6/SIL6R复合物能特异性的激活在正常情况下对通过gpl30介导的IL6通路不敏感的细胞，这一研究结果说明，sIL6R在体内的功能不同于gpl30，且可能具有某些独立的生物学功能。2001年开始有研究报道IL6以及sIL6R在HBV感染人类中的免疫作用。文献中指出，对IFN a治疗有效的乙肝病人，血清sIL6R浓度增加；对IFNa治疗没有效果的病人，血清sIL6R浓度不增加，这说明在HBV感染后的免疫应答反应中，IFN与sIL6R有着必然的联系，这与本发明中的I型干扰素与sIL6R相关性的筛选结果也是一致的。2012年《lancet》上相继发表了 2篇有关sIL6R的报道。其中一篇是用孟德尔遗传分析的方法筛选出sIL6R可以作为靶标来预防冠心病；另一篇则是研究了 SIL6R相关信号通路与冠心病之间的联系。这些都能说明，SIL6R正作为一种新发现的具有独立生物学功能意义的蛋白被广泛的开发和研究。SIL6R目前已经商品化，可以直接购得成品SIL6R蛋白。构建了 sIL6R的真核表达质粒pCMV-sIL6R，可以在瞬转细胞后培养24h检测到上清中有sIL6R的分泌。I型干扰素的生物学功能主要包括两方面。第一，抗病毒作用。I型干扰素具有广谱抗病毒活性，对多种病毒，如DNA病毒和RNA病毒，均有抑制作用；但这种效应并非直接产生，而是通过对宿主细胞的作用引起。①对干扰素敏感的细胞表面存在干扰素受体，核内有“抗病毒蛋白”基因，受干扰素作用后该基因活化，产生的抗病毒蛋白可阻止病毒mRNA翻译，并促进病毒mRNA降解。②干扰素能提高细胞表面MHCI类分子的表达水平，受病毒感染的细胞表面的MHCI类分子的增加有助于向Tc细胞递呈抗原，引起靶细胞的溶解。③干扰素可增强NK细胞对病毒感染的杀伤能力。在临床应用时常见的不良反应有发热和白细胞减少等，少数病人快速静注时出现血压下降。约5%的病人用后可产生IGN抗体。第二，抗肿瘤作用。I型干扰素能抑制细胞的DNA合成，减慢细胞的有丝分裂速度；这种抑制作用有明显的选择性，对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强500 1000倍。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供可溶性白细胞介素6受体在制备抗病毒药物上的用途。本发明用体外实验证明SIL6R具有抗病毒作用。本发明发现流感病毒感染免疫细胞后诱导SIL6R表达，并促进I型干扰素表达的抗病毒作用机制，从而证明SIL6R能刺激免疫细胞产生I型干扰素而具有广谱抗病毒功效。本发明发现SIL6R在细胞和分子水平上对流感病毒复制有抑制作用，预示SIL6R可以做为临床抗流感病毒药物而进一步研究开发。通过流感病毒感染上调SIL6R在A549 细胞和PBMC中的表达实验证实了流感病毒感染能上调sIL6R的表达，并以A549细胞作为细胞模型研究流感病毒诱导sIL6R表达的分子机制；通过sIL6R在流感病人血清和咽拭子中表达水平和相关性实验验证了细胞水平上sIL6R表达和流感病毒的关系，说明了流感病毒感染和SIL6R上调的相关性。通过SIL6R可以抑制流感病毒的复制并且能够激活I型干扰素，我们得出流感病毒感染细胞后通过上调sIL6R的表达来激活干扰素通路，这是机体应对病毒的入侵，自我防卫的免疫机制，SIL6R能激活I型干扰素，并促进干扰素下游产物OAS, PKR, Mx的表达，最终抑制流感病毒的复制。总体实验揭示了尚未被发现的sIL6R能促进免疫细胞产生干扰素且激活下游通路而达到广谱抗病毒效果的机制。本实验揭示了尚未被发现的SIL6R的新生物学功能促进免疫细胞产生干扰素且激活下游通路而达到广谱抗病毒效果的机制。这一新发现为研制抗病毒药物提供理论基础。本发明采用体内天然存在的蛋白SIL6R，促进人体免疫细胞产生IFNa，不仅保证了其完整的生物学功能，而且避免了因引入异源性的成分而导致产生毒副作用。
图IA型流感病毒可以上调sIL6R在A549细胞和PBMC中的表达。A. A型流感病人和正常人血清水平SIL6R的检测；B.临床水平上，A型流感病人和正常人咽拭子中sIL6R与NP mRNA相关性分析；C. A/Hong Kong/H3N2 感染 A549 细胞后，激活 sIL6R 启动子；D.A/Hong Kong/H3N2感染A549细胞后，上清中sIL6R蛋白表达水平升高。图2sIL6R在A549细胞和PBMC中能激活干扰素通路。A.重组人源sIL6R蛋白加入到A549细胞中，I、III型干扰素mRNA水平表达上升；B.重组人源sIL6R蛋白加入到PBMC细胞中，I型干扰素mRNA水平表达上升；C.重组人源sIL6R蛋白加入到A549细胞中，I型干扰素下游产物0AS、PKR、Mx以及受体IFN a R2的mRNA水平表达上升；D.重组人源SIL6R蛋白加入到A549细胞中，I型干扰素下游产物0AS、PKR、Mx以及受体IFNa R2的蛋白水平表达上升；
E.重组人源sIL6R蛋白加入到PBMC细胞中，I型干扰素下游产物0AS、PKR、Mx的mRNA水平表达上升。图3sIL6R蛋白具有广谱抗病毒功能。A. MDCK细胞感染A/Hong Kong/H3N2病毒并加入重组人源sIL6R蛋白后，病毒三种RNA复制水平均被抑制；B. RD细胞感染EV71病毒并加入重组人源sIL6R蛋白后，病毒复制水平被抑制；C. Hep3B细胞瞬时转染pHBVl. 3并加入重组人源sIL6R蛋白或IFNa后，s抗原和e抗原表达水平均被抑制；
D. VSV-eGFP病毒A549细胞后，瞬时转染pCMV_sIL6R质粒，细胞出现抗病毒反应，再加IL6R中和抗体后，细胞抗病毒效果消失。
具体实施例方式实施例一、流感病毒感染上调SIL6R在A549细胞和PBMC中的表达(一)实验材料I、临床样本健康人全血和咽拭子来自献血志愿者，流感病人血清、咽拭子来自医院。2、细胞、病毒毒株及质粒人肺癌细胞系A549和A型流感病毒毒株A/HongKong/498/97H3N2由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供，由本实验室保存。psIL6R-luc由本实验室构建且保存。3、生化试剂及试剂盒人sIL6R ELIS 检测试剂盒(R&D Systems, Minneapolis, MN55413, USA)购自武汉优宁维生物公司。F12K 培养基，RPMI 1640 培养基和胎牛血清(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)购自武汉生命生物技术公司4、逆转录酶等M-MLV逆转录酶和RNA抑制剂(RNasin)购自Promega公司，Trizol、dNTP 和 Oligo dT (18T)购自 Invitrogen 公司。SYBR Green PCR Master Mix，购自 ABI 公司。5、耗材及仪器细胞培养板、细胞培养皿和细胞培养瓶购自Corning公司。4°C高速离心机、小型高速离心机、二氧化碳细胞培养箱和细胞操作台购自Herus。超纯水系统购自millipore。突光定量PCR 系统 LightCycler480II 购自 Roche。RNA提取所使用的RNase free的各种型号枪头和EP管购自Eppendorf。ELx800 酶标仪购自 BioTek Instruments, Inc。常规PCR仪购自东胜创新。(二)实验方法I、哺乳动物细胞(贴壁)的复苏
I)预先准备好37°C _38°C温水，从液氮罐中取出需要复苏的细胞，用眼科手术镊子固定，迅速置于水中，保证冻存管完全浸没与水中，使其均匀受热，直到冻存管内的细胞完全融化。2)用酒精消毒冻存管。3)用吸管预先吸取5ml细胞培养基于T25细胞培养瓶中，再用新的吸管将融化的细胞转移到细胞瓶中并轻轻吹打一遍。4)盖好细胞瓶盖，将细胞瓶放置于细胞培养箱中，37°C，5%C02静置培养。5)约6-8小时后(取决于不同的细胞)，更换信息培养基以消除细胞冻存液中存留的DMSO对细胞生长的影响。2、细胞的传代和冻存·I)当细胞长满T25细胞瓶后，用吸管吸取培养基并弃去。2)加入IOml的PBS，轻柔洗涤细胞后用吸管吸取并弃去。3)用吸管吸取1-1. 5ml胰酶，使其覆盖住细胞瓶底部，将细胞瓶放入37°C，5%C02细胞培养箱静止3-5min(消化时间的长短取决于细胞种类)。4)显微镜观察，贴壁细胞变圆并且全部从细胞瓶壁脱离。5)在细胞操作台内，用吸管吸取约4ml培养基，加入细胞瓶内，轻柔的吹打，以吹散细胞和中和胰酶的消化效果。6)用吸管吸取吹匀的细胞悬液(体积约1/3-2/3)到另一新的细胞瓶，再补加5ml的培养基，放置于细胞培养箱中，370C，5%C02的环境下继续静置培养。3、H3N2 感染 A549 细胞H3N2感染A549前，将含有胎牛血清的完全培养基换成无血清培养基，H3N2感染的剂量为1M0I，感染或处理24h后，收集培养上清进行下一步实验。4、ELISA试剂盒检测sIL6R表达水平I)使用前lh，将试剂盒所有试剂放到室温平衡。2)配置浓度为2000pg/ml的标准曲线母液。在6个EP管中依次倍比稀释母液，得到浓度为 1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62. 5pg/ml 和 31. 25pg/ml 的标准品，另外以稀释液作为Opg/ml。3)每孔中加入 100 U IAssay Diluent RD-1-1 溶液。4)每孔加入IOOiU标准品，对照，和待测样品，标准品和待测样品均做3个复孔作为重复，用密封膜封好，室温孵育2h。5)弃去ELISA板中的溶液，每孔加入400 yl IX漂洗缓冲液振荡洗涤，并在吸水纸上拍干，重复3次。6)每孔加入200 ill sIL6R酶结合物,用密封膜封好,用密封膜封好,室温孵育2h。7)弃去ELISA板中的溶液，每孔加入400iUlX漂洗缓冲液振荡洗涤，并在吸水纸上拍干，重复3次8)每孔加入200 ill底物溶液，避光，室温孵育20分钟。IL_6sR含量高的孔，此时溶液颜色会变蓝。9)每孔加入50 U I终止液，此时溶液颜色从蓝色变成黄色。10) 30min内，酶标仪450nm参考波长,570nm校正波长读板,450nm波长下的读数减去570nm波长下的读数即为最后的读数。5、哺乳动物细胞的转染(以Lipofectamine2000转染6孔细胞培养板为例)I)细胞转染前，调整细胞密度，达到85%_90%，并将含胎牛血清的全培养基更换为
无血清培养基。2)按转染6孔板所需的质粒DNA的量和转染试剂的量分别稀释质粒DNA和转染试剂；6空板每空需g质粒DNA，用250 ill opti_MEM稀释，转染试剂需要8 yl，用250 ylopti-MEM 稀释。3)将稀释好的转染试剂溶液逐滴滴加到稀释好的质粒DNA溶液中，一边滴加一边轻弹EP管，注意，滴加的顺序一定不能反。4)滴加混合好质粒DNA/转染试剂混合物后，放置室温孵育15_20min。5)孵育完成后，将质粒DNA/转染试剂混合物滴加到细胞培养基中，轻柔混匀，放置37°C，5%C02细胞培养箱静置培养4-6h。6)如果细胞株很敏感，培养培养4_6h后应更换培养液，除去转染复合物并加入新鲜含胎牛血清的完全培养基。7)培养24_48h后，根据实验设计进行下一步实验。6、荧光素酶活性的测定(以Promega荧光素酶试剂盒为例)I)取出荧光素酶试剂盒所以试剂，室温平衡Ih。2)荧光测定仪开机自检，并设定相因的参数。3)待测细胞样品，弃去细胞培养基，并用预冷的PBS洗涤一次，加入荧光素酶细胞裂解液，轻柔混匀，37°C裂解15min。4)用移液枪吹打裂解物，并转移到新的EP管中。5) 4°C, 12000rpm离心lmin,转移上清至新的EP管中，弃去沉淀。6)取样品100 iil，加入荧光素酶底物100 iil，移液枪吹打混匀后，上机测定。7)每次测定设3个平行复孔，最后的数据以荧光素酶的读值和海肾荧光素酶读值的比值来表示。7、逆转录荧光定量PCR检测目的基因mRNA的表达水平I)逆转录反应体系如下
权利要求
1.sIL6R蛋白在制备抗病毒药物中的应用。
2.一种抗病毒药物，其中含有sIL6R蛋白。
全文摘要
本发明公开了重组人源可溶性白细胞介素6受体(sIL6R)蛋白的抗病毒作用。本发明证实流感病毒感染上调sIL6R在A549细胞和PBMC中的表达，而且用合适浓度的重组人源sIL6R蛋白作为诱导剂加入到人外周血单个核细胞中或用过表达质粒pCMV-sIL6R瞬时转染A549，均能诱导表达出I型干扰素，同时可以激活其下游抗病毒基因OAS、PKR、Mx的表达。因此sIL6R能刺激产生I型干扰素而具有广谱抗病毒活性。这一新的生物学功能的发现不同于以往将sIL6R只定义为IL6信号通路转导蛋白受体。
文档编号A61P31/12GK102727869SQ20121023904
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月11日 优先权日2012年7月11日
发明者刘礼, 朱应, 王青 申请人:武汉大学