锯叶棕果实提取物在制备治疗勃起功能障碍药物中的用途
【专利摘要】本发明属中药领域，涉及锯叶棕果实提取物在制备治疗勃起功能障碍药物中的用途。本发明的锯叶棕果实提取物制成软胶囊，通过连续一周对雄性大鼠和家兔灌胃给予锯叶棕果实提取物软胶囊制剂后，通过生物信号处理系统测定给予实验动物电刺激之后的阴茎海绵体平滑肌放电幅度；实验结果表明，所述锯叶棕果实提取物软胶囊通过抑制阴茎海绵体中PDE5活性，从而抑制cGMP的水解，提高cGMP浓度，从而使实验动物电刺激后阴茎海绵体放电幅度呈剂量依赖性增强，上述作用及机制与西地那非药物类似，本发明的锯叶棕果实提取物软胶囊制剂可作为治疗勃起功能障碍的药物，且有显著的效果。
【专利说明】锯叶棕果实提取物在制备治疗勃起功能障碍药物中的用途
【技术领域】
[0001]本发明属中药领域，涉及中药锯叶棕果实提取物的药用用途，具体涉及锯叶棕果实提取物在制备治疗勃起功能障碍药物中的用途。
[0002]【背景技术】:[0003]阴莖勃起功能障碍(Erectile Dysfunction, ED)又称阳痿(Impotence),是指成年男性不具有足够的勃起以完成全部性交过程；由于长期受封建意识的束缚，该病一直未引起人们足够的重视。所述ED为发病率较高的疾病，不仅严重危害着成年男性的身心健康，也给社会发展产生重大影响。在国外，目前比较公认的数据是马萨诸塞男性老龄化研究调查显示:40~70岁男性的ED患病率是52.0±1.3%，其中轻、中、重度ED的患病率分别是17.2%,25.2%和9.6%，在有代谢障碍如心血管病患者和糖尿病患者间好发；在中国上海，通过调查1582名40岁以上的城市男子，发现ED患病率约为73%。有预测显示，到2025年，全球ED患者将到达3亿人口。
[0004]目前，普遍认为ED的发生与阴莖海绵体上的环磷酸鸟苷(cyclic guanosinemonophosphate, cGMP)的第二信使传导系统所主导的阴茎海绵体平滑肌的收缩舒张障碍有关。所述特异性磷酸二酯酶5 (phosphodiesterase type5, PDE5)抑制剂西地那非(伟哥)、他达拉非是目前临床上治疗各型、各种病因ED的一线口服药物；其通过选择性抑制TOE5的活性而抑制cGMP的水解，从而促进并延长cGMP的激活时程，延长勃起的持续时间。然而，调查显示约有309ffiD患者因对TOE5抑制剂无反应而停药。
[0005]锯叶棕果实提取物(saw palmatto extract, SPE)采用来源于美国矮锯叶棕果实提取而成，其中含有多种复合物成分，通常被制成软胶囊。所述锯叶棕浆果是美国印第安人传统的用与治疗泌尿生殖系统疾病的药物，用于缓解黏膜刺激症状、增加睾丸功能、或增加乳腺大小；早在19世纪就有医学文献报道其用于治疗良性前列腺增生(benign prostatichyperplasia, BPH)及其导致的严重影响中老年男性生活质量的下尿道症状包括尿频、尿急、夜尿、尿不尽、尿流细等。目前，被普遍接受的两种治疗BPH的方法是5 a还原酶抑制剂和a肾上腺素受体阻断剂，可单用或者合用；然而，上述治疗方法往往会引起性功能障碍。有研究公开的有对照的对BPH病人的临床试验数据表明，SPE在改善最大尿流、较少夜尿方面与典型的治疗BPH药物非那雄胺相当；在许多欧洲国家，SPE是最常用的治疗BPH相关的泌尿系统疾病处方草药之一。同时研究还发现，SPE不良反应相对发生较少，且轻微，ED的发生率远远低于应用非那雄胺的BPH患者。Hotta等采用问卷形式对Permixon (锯叶棕脂肪酸固醇提取物)，坦索罗辛(a -肾上腺素受体阻断剂)及非那雄胺(5 a -还原酶抑制剂)治疗BPH患者的性功能进行了评价，研究结果表明，相对于坦索罗辛和非那雄胺对性功能产生负面影响，Permixon对男性性行为的兴趣、勃起的质量、达到性高潮和射精等方面男性性功能无不良影响。
[0006]有关锯叶棕果实提取物的作用机制尚不明确，研究推测其可能与抑制5 a还原酶活性、抗雄激素作用、调节雄、雌激素平衡、a受体阻断效应、抑制前列腺组织生长因子活性、抗增殖效应以及抗炎作用等有关。迄今，尚未见有关锯叶棕果实提取能治疗ED的文献报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供中药锯叶棕果实提取物新的药用用途，具体涉及锯叶棕果实提取物在制备治疗勃起功能障碍药物中的用途。软胶囊的软胶囊
[0008]本发明中，所述的中药锯叶棕果实提取物制成软胶囊，可通过市购突进获得。
[0009]本发明通过整体动物模型试验证实所述的中药锯叶棕果实提取物(saw palmattoextract, SPE)软胶囊具有很显著的治疗勃起功能障碍的作用；
[0010]本发明还采用连续循环定磷比色法测定动物阴茎海绵体组织中TOE5活性进一步分析所述中药锯叶棕果实提取物的软胶囊治疗勃起功能障碍的分子机制。
[0011]具体而言，本发明通过下述实验进行验证所述的锯叶棕果实提取物(软胶囊)具有很显著的治疗勃起功能障碍的作用:
[0012](I)锯叶棕果实提取物软胶囊连续灌胃一周后对大鼠阴茎海绵体电刺激后放电幅度的影响
[0013]SPE软胶囊(购自德国泰德制药厂)，实验动物采用SD雄性大鼠40只，体重280-300g,(购自复旦大学医学实验动物中心)；
[0014]大鼠分为4组，分别是对照组、SPE低剂量组、SPE中剂量组和SPE高剂量组，SPE采用生理盐水配制，每天灌胃给药一次，给药容量为lmL/100g体重，连续给药7天；末次灌胃给药24h后，大鼠阴茎背部两侧连入SMUP-E生物信号处理器(复旦大学上海医学院生理与病理生理学系监制)，给予方波脉冲电刺激，记录给予电刺激后海绵体平滑肌的放电情况，
[0015]结果显示，当电刺激时SD雄`性大鼠阴茎海绵体放电幅度相对于生理盐水组的大鼠明显增加，且呈剂量依赖性；表明SPE有效增加电刺激后大鼠阴茎海绵体压力，对ED有良好的治疗作用；
[0016](2)锯叶棕果实提取物软胶囊连续灌胃一周后对家兔阴茎海绵体电刺激后放电幅度的影响
[0017]SPE软胶囊(购自德国泰德制药厂)，
[0018]雄性新西兰家兔30只，平均体重2.0 - 2.5kg，购自复旦大学医学实验动物中心；
[0019]家兔适应性饲养10天后开始实验；将30只家兔随机分为生理盐水对照组，SPE软胶囊低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组6-7只；SPE采用生理盐水配制，每天灌胃给药一次，给药容量为lmL/kg体重，连续给药7天；末次灌胃给药24h后测定电刺激后家兔海绵体放电幅度；
[0020]结果显示，雄性家兔在连续7天给予SPE之后出现与上述大鼠实验相似的结果，相对于生理盐水组，给予不同剂量SPE的家兔阴茎海绵体放电幅度有明显增加，呈剂量依赖关系，表明SPE可有效增加电刺激后家兔阴茎海绵体压力，对ED有良好的治疗作用；
[0021](3)锯叶棕果实提取物软胶囊连续灌胃一周后对大鼠和家兔阴茎海绵体磷酸二酯酶5活性的影响
[0022]在上述试验I以及2中的大鼠及家兔阴茎海绵体放电测定结束后，常规分离出实验动物阴茎海绵体组织样本，以PBS溶液洗净并称重置于_70°C冰箱保存备用；
[0023]实验时，将实验动物阴茎海绵体组织样本置预冷的锥形离心管中，清洗后移入液氮冻存管，液氮罐过夜；第3日取出，碾碎组织成粉末状，放入锥形离心管；粉末样品中加入裂解液强力漩涡震荡30s，之后放进冰槽孵育30min，反复强力涡旋震荡后离心，移取上清液到新的无菌离心管，移取20iU用BCA方法进行蛋白定量，其余样品置于-70°C保存；
[0024]采用GENMEDTOE5酶活性连续循环定磷比色法定量检测试剂盒(GENMEDSCIENTIFICSINC.U.S.A，上海杰美基因医药科技有限公司代理)进行酶活性的测定；底物环核苷酸(cAMP或cGMP)，在TOE5敏感性抑制剂(MY-5445)存在的情况下，通过TOE5的催化作用，进行水解反应，产生1-磷酸鸟苷产物后，经由5-核苷酸酶(5-nucleotidase，5_NT)作用，释放出游离磷酸根，进而与孔雀绿染料发生显色反应后，通过分光光度仪(660nm波长)测定其峰值的变化；吸光度值的大小和TOE5酶活性成正比；
[0025]首先测定标准曲线，然后进行样品背景(不加酶促液和底物液)测定，获得样品非特异活性；
[0026]所述样品总活性和非特异活性计算按下述公式:
[0027]{[根据标准曲线获得样品活性对应5-GMP浓度(y mol/L) 一根据标准曲线获得样品背景对应5-GMP浓度(ii mol/L) ]X样品稀释倍数} +30 (反应时间；min) =nmol5-GMP\ml\min+ 样品蛋白浓度(mg\ml) =nmol5_GMP\mg\min ；
[0028]样品特异活性计算按下述公式:
[0029]样品特异活性=样品总活性一样品非特异活性；
[0030]结果显示，经灌胃给予不同剂量SPE的大鼠阴茎海绵体组织中TOE5活性相对生理盐水组有显著性的下降；经灌胃给予不同剂量的SPE的家兔阴茎海绵体组织中TOE5活性也出现了相似的结果；实验结果表明SPE能有效地抑制阴茎海绵体中TOE5的活性，从而抑制cGMP的水解，延长阴茎勃起的时程，对ED起到良好的治疗作用。
[0031]上述实验结果显示，本发`明所述SPE软胶囊通过抑制阴茎海绵体中TOE5活性，从而抑制cGMP的水解，提高cGMP浓度，从而使实验动物电刺激后阴茎海绵体放电幅度呈剂量依赖性增强，上述作用及机制与西地那非类似，所述SPE软胶囊对勃起功能障碍有显著的治疗效果。
[0032]为了便于理解，以下将通过【具体实施方式】对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1显示了锯叶棕果实提取物软胶囊连续灌胃一周后对大鼠和家兔阴茎海绵体电刺激后放电幅度的影响(均数土标准误，n=6-10)，
[0034]其中，
[0035]A:锯叶棕果实提取物软胶囊连续灌胃一周后对大鼠阴茎海绵体电刺激后放电幅度的影响；
[0036]B:锯叶棕果实提取物软胶囊连续灌胃一周后对家兔阴茎海绵体电刺激后放电幅度的影响；
[0037]与saline 组比较，*P〈0.05，**P〈0.01 ；
[0038]与SPE小剂量组比较，A AP<0.01 ；[0039]与SPE中剂量组比较，##P<0.01。
[0040]图2显示了锯叶棕果实提取物软胶囊连续灌胃一周后对大鼠和家兔阴茎海绵体磷酸二酯酶5活性的影响(均数土标准误，n=4-7)，
[0041]其中，
[0042]A:锯叶棕果实提取物软胶囊连续灌胃一周后对大鼠阴茎海绵体磷酸二酯酶5活性的影响；
[0043]B:锯叶棕果实提取物软胶囊连续灌胃一周后对家兔阴茎海绵体磷酸二酯酶5活性的影响；
[0044]与saline 组比较，*P〈0.05，**P〈0.01 ； [0045]与SPE小剂量组比较，A AP<0.01 ；
[0046]与SPE中剂量组比较，##P<0.01。
【具体实施方式】
[0047]实施例1
[0048]SPE软胶囊(购自德国泰德制药厂)，
[0049]实验动物采用SD雄性大鼠40只，体重280_300g，购自复旦大学医学实验动物中心；
[0050]大鼠饲养在12h明暗环境，室温控制在22°C，自由进食饮水；适应性饲养10天后开始实验；将40只SD雄性大鼠分为4组，每组10只，分别是对照组(生理盐水)、SPE低剂量组(14.29mg/kg)、SPE 中剂量组(28.58mg/kg)和 SPE 高剂量组(57.16mg/kg)，SPE 采用生理盐水配制，每天灌胃给药一次，给药容量为lmL/100g体重，连续给药7天；末次灌胃给药24h后，采用50mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧位固定，取两根针状电极插入大鼠阴茎背部两侧，连入SMUP-E生物信号处理器(复旦大学上海医学院生理与病理生理学系监制)，给予1.2V，频率为30Hz，波宽为0.1ms的方波脉冲电刺激，每次持续30s ;向大鼠阴茎背部海绵体根部插入引导电极记录给予海绵体神经电刺激后海绵体平滑肌的放电情况；另取一根接地电极夹住皮肤。
[0051]结果如图1A所示，SPE连续灌胃7天之后，当电刺激时SD雄性大鼠阴茎海绵体放电幅度相对于生理盐水组的大鼠明显增加，且呈剂量依赖性；表明SPE可有效增加电刺激后大鼠阴茎海绵体压力，对ED有良好的治疗作用。
[0052]实施例2
[0053]SPE软胶囊(SPE)由德国泰德制药厂提供。雄性新西兰家兔30只，平均体重2.0 -
2.5kg，购自复旦大学医学实验动物中心；家兔饲养在12h明暗环境，室温控制在22°C，自由进食饮水；适应性饲养10天后开始实验；将30只家兔随机分为生理盐水对照组，SPE软胶囊低剂量组(7.5mg/kg)、中剂量组(15mg/kg)、高剂量组(30mg/kg),每组6-7只；SPE采用生理盐水配制，每天灌胃给药一次，给药容量为lmL/kg体重，连续给药7天；末次灌胃给药24h后测定电刺激后豕兔海绵体放电幅度。
[0054]结果如图1B所示，雄性家兔在连续7天给予SPE之后也出现了与大鼠实验相似的结果，相对于生理盐水组，给予不同剂量SPE的家兔阴茎海绵体放电幅度有明显增加，也呈剂量依赖关系，其中小剂量SPE已经表现出使阴茎海绵体放电幅度增强的作用；表明SPE可有效增加电刺激后家兔阴茎海绵体压力，对ED有良好的治疗作用。
[0055]实施例3
[0056]在上述实施例1以及实施例2中，大鼠及家兔阴茎海绵体放电测定实验结束后，迅速解剖、分离出阴茎海绵体组织，包括祛除皮肤、阴茎头、尿道海绵体、筋膜等，以0.01mol/LPBS溶液冲洗净血液并称重后迅速置于_70°C冰箱保存备用；
[0057]实验时，将大鼠和家兔阴茎海绵体组织放进预冷的锥形离心管中，加入清理液清洗后移入到液氮冻存管中，即刻放进液氮罐过夜；第3日从液氮罐中取出，立即用研磨棒碾碎组织成粉末状，放进一个15mL锥形离心管；样品粉末中加入裂解液后强力漩涡震荡30s，之后放进冰槽孵育30min，期间每IOmin强力涡旋震荡30s，后于4°C台式离心机离心IOmin,速度为lOOOOg，移取上清液到新的无菌离心管，移取20 采用BCA方法进行蛋白定量，其余样品置于_70°C保存；
[0058]采用GENMED PDE 5酶活性连续循环定磷比色法定量检测试剂盒(GENMEDSCIENTIFICS INC.U.S.A，上海杰美基因医药科技有限公司代理)进行酶活性的测定；底物环核苷酸(cAMP或cGMP)，在TOE5敏感性抑制剂(MY-5445)存在的情况下，通过TOE5的催化作用，进行水解反应，产生1-磷酸鸟苷产物后，经由5-核苷酸酶(5-nucleotidase，5_NT)作用，释放出游离磷酸根，进而与孔雀绿染料发生显色反应后，通过分光光度仪(660nm波长)测定其峰值的变化；吸光度值的大小和TOE5酶活性成正比；
[0059]首先测定标准曲线，然后进行样品背景(不加酶促液和底物液)测定，即比色皿中加入缓冲液以及5iU待测样品，依次加入阴性液、终止液以及显色液，静止15min之后，放进分光光度计测量样品背景；另取新的比色皿，加入酶促液和底物液，30°C孵育30min后加入待测样品5 yl，再次30°C孵育30min。依次加入阴性液、终止液和显色液静置15min后，放入分光光度计检测，获得样品总活性；另取新的比色皿，一次加入缓冲液、酶促液、底物液和专性液，30 0C中孵育30min之后加入待测样品5 yl，再次30°C孵育30min后加入阴性液、终止液和显色液静置15min，放入分光光度计`检测，获得样品非特异活性。
`[0060]样品总活性和非特异活性计算:
[0061]{[根据标准曲线获得样品活性对应5-GMP浓度(y mol/L) 一根据标准曲线获得样品背景对应5-GMP浓度(ii mol/L) ]X样品稀释倍数} +30 (反应时间；min) =nmol5-GMP\ml\min+ 样品蛋白浓度(mg\ml) =nmol5_GMP\mg\min ；
[0062]样品特异活性计算:样品特异活性=样品总活性一样品非特异活性；
[0063]结果如图2所示，经过灌胃给予不同剂量SPE的大鼠阴茎海绵体组织中TOE5活性相对生理盐水组有显著性的下降，经过灌胃给予不同剂量的SPE的家兔阴茎海绵体组织中PDE5活性也出现了相似的结果；表明SPE可有效地抑制阴茎海绵体中TOE5的活性，从而抑制cGMP的水解，延长阴茎勃起的时程，对ED起到良好的治疗作用。
【权利要求】
1.锯叶棕果实提取物在制备治疗勃起功能障碍药物中的用途。
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述锯叶棕果实提取物制成软胶囊。
3.按权利要求2所述的用途，所述的锯叶棕果实提取物软胶囊用于抑制阴茎海绵体中PDE5活性，抑制cGMP的水解，提高cGMP浓度。
4.按权利要求2所述的用途，其特征在于，锯叶棕果实提取物软胶囊的给药剂量为， SD雄性大鼠:低剂量组14.29mg/kg、中剂量组28.58mg/kg、高剂量组57.16mg/kg ； 雄性新西兰家兔:低剂 量组7.5mg/kg、中剂量组15mg/kg、高剂量组30mg/kg。
【文档编号】A61P15/10GK103623167SQ201210309278
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年8月27日 优先权日:2012年8月27日
【发明者】杨素荣, 李一瀛, 张云刚, 涂庭婷, 吴淦桐, 王浩, 姚明辉 申请人:复旦大学, 江苏弘惠医药有限公司