一种抑制艾滋病病毒感染活性的多肽及其相关噬菌体的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物医学和抗病毒生物制剂领域，涉及抑制艾滋病病毒（HIV-1）感染活性的多肽及其相关噬菌体，尤其涉及具有体外抑制艾滋病病毒（HIV-1）感染活性的多肽及含有该多肽序列的噬菌体。本发明的多肽及噬菌体具有体外抑制多种类型HIV-1病毒株的活性，并且对细胞具有低毒性，所述的多肽、噬菌体以及衍生物可单独或与其他成分组合使用，用于开发制备抗HIV药物及预防HIV-1性传播的生物制剂，能为阻断艾滋病病毒通过男男直肠性行为的传播提供新思路与新技术。
【专利说明】一种抑制艾滋病病毒感染活性的多肽及其相关噬菌体
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学和抗病毒生物制剂领域，涉及抑制艾滋病病毒(HIV-1)感染活性的多肽及其相关噬菌体，尤其是一种具有体外抑制艾滋病病毒(HIV-1)感染活性的多肽及含有该多肽序列的噬菌体。该多肽及其噬菌体可用于制备抗HIV-1药物及预防HIV-1性传播的制剂。
【背景技术】
[0002]人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)及其引起的艾滋病在全球范围的广泛传播已成为严重的公共卫生问题，目前该疾病的有效预防和彻底治疗依然是个世界性的难题。据卫生部、联合国艾滋病规划署、世界卫生组织联合所作的2011年中国艾滋病疫情评估报告显示，截至2011年年底，估计中国存活艾滋病病毒感染者和艾滋病患者约78万人，其中，经异性性传播占46.5%，经同性性传播占17.4%,因此，性传播已成为我国艾滋病传播的最主要途径。尤其值得注意的是，在新发感染案例中经性传播的感染案例占到总数的80%以上，这意味着随着我国性观念西化及性开放程度的加深，艾滋病离普通大众的距离越来越近，其从高危人群向普通人群扩散的趋势愈发显著。如果防治措施不力，将对我国的人口健康和经济社会发展产生巨大的影响。
[0003]目前，尽管高效联合抗逆转录病毒治疗(HAART)可以降低HIV感染者发生AIDS的发病率和死亡率，但临床上相关的针对HIV逆转录酶和蛋白酶的药物均存在着用药周期持久，毒副作用强，易产生抗药性病毒株等缺点。因此，研发针对保守靶点，并且低毒性的多肽抑制剂成为目前有关艾滋病药物研究的热点之一。本申请的发明人之一姜世勃教授(国际抗HIV-1药物研发领域的著名专家)于1991年在国际上首次发现了第一个作用于HIV包膜蛋白gp41的C多肽(SJ-2176),其专利转让给美国的Trimeris药物公司和罗氏制药公司开发成为被美国FDA批准的第一个·抗艾滋病多肽类进入抑制剂一 T20。该药物的出现，被誉为是“艾滋病研究的里程碑”。姜世勃教授也因此在国际上开创了病毒进入抑制剂研究领域，并在该领域，特别是多肽类进入抑制剂领域，一直保持国际领先地位。
[0004]在艾滋病预防领域，有效的预防性疫苗仍难以在短期内获得成功。最新的数据显示，在我国由男男同性性行为所导致的HIV传播呈现激增态势，其所占比例从2006年的
2.5%上升到2011年的17.4%。在2011年4.8万新发感染中，性传播的比例超过80%，男男同性传播约占30%，已超过输血、吸毒、母婴等传播途径。在生理学上，男性肛门直肠粘膜由柱状上皮细胞组成，其抵抗力较女性阴道脆弱，弹性也低于阴道，因此，男男同性恋在进行肛交的过程中，极易使薄而脆弱的肛门直肠粘膜表面损伤，形成创面，更易导致HIV的感染和传播。因此，研发能作用于直肠并有效阻断HIV男男性传播的生物技术及生物制剂业已成为我国防控艾滋病疫情快速发展的重点之一。对于阻断HIV的性传播，性交前给药进行预防是国际上采取的主要策略之一。该策略是将含有抗HIV成分的制剂，在性交前置入阴道或肛门，其可覆盖在阴道或直肠黏膜表面，通过直接灭活HIV、阻止HIV粘附及侵入阴道或直肠粘膜内的靶细胞、抑止HIV在靶细胞内的复制等作用机理，保护健康人群在性行为时免受HIV感染。当前，能够阻断HIV感染靶细胞的进入抑制剂为该策略所选药物的研究热点。本申请拟提供一种具有体外抑制艾滋病病毒(HIV-1)感染活性的多肽及含有该多肽序列的噬菌体，进一步制备新型的抗HIV药物和预防HIV性传播的HIV进入抑制剂。从而应用于阻断艾滋病的男男性传播。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种抑制艾滋病病毒(HIV-1)感染活性的多肽及其相关噬菌体，尤其是一种具有体外抑制艾滋病病毒(HIV-1)感染活性的多肽及含有该多肽序列的噬菌体。该多肽及其噬菌体可用于制备抗HIV-1药物及预防HIV-1性传播的生物制剂。
[0006]本发明所涉及的具有体外抑制艾滋病病毒(HIV-1)感染活性的多肽及含有该多肽序列的噬菌体，均属于HIV进入抑制剂。其中，含有该多肽序列的具有抗HIV-1活性的噬菌体(M13型)，可在大肠杆菌中溶原性传代，从继续生长和分裂的感染菌体中释放出来，并不裂解该菌体。因此，有潜力发展成为一种可在直肠内的大肠杆菌中繁殖，并且长期存在的抗HIV-1活性物质，从而阻断艾滋病的男男性传播。
[0007]本发明从筛选到的与诱饵蛋白结合的噬菌体中获得T7P多肽序列:N-GMWFSGL_C，及含有该序列的T7M噬菌体。
[0008]本发明所述的多肽(GMWFSGL)由7个氨基酸组成，具体氨基酸序列为(从N端起):N 端-Gly-Met-Trp-Phe-Ser-Gly-Leu-C 端(N-GMWFSGL-C，N-表示多肽 N 端方向，-C 表示多肽C端方向)。(该多肽在本申请中简称为:T7P)。
[0009]本发明所述的噬菌体的主要特征为:含有氨基酸序列(从N端起):N端 _Gly_Met_Trp_Phe_Ser_Gly_Leu_C 端(N_GMWFSGL_C)。(该嗤囷体在本申请中简称为:T7M)。
[0010]本发明还提供了所述的具有体外抑制艾滋病病毒(HIV-1)感染活性的多肽(GMWFSGL)的衍生物，该类衍生物含有所述的多肽的氨基酸序列(GMWFSGL)，所述衍生物包括如，重组蛋白、活性物质等。
[0011]本发明中，进行了 T7P多肽及T7M噬菌体对HIV-1的抑制活性检测，通过MT-2感染系统获取IC50 (50%抑制有效浓度)，IC90 (90%抑制有效浓度)；通过TZM_bl和5.25M7感染系统，用荧光素酶试剂盒检测荧光素酶的表达，或按MT-2的方法检测P24的含量，获取IC50 (50%抑制有效浓度)，IC90 (90%抑制有效浓度);选取淋巴细胞MT-2和人宫颈癌细胞TZM-bl检测T7P多肽及T7M噬菌体的细胞毒性。
[0012]结果显示，所述的I7P多肽对HIV-1 IIIB (X4)毒株及HIV-1 Bal (R5)毒株均有明显的抑制活性，其IC50分别约为11.62ii M和14.56ii M。噬菌体T7M对HIV-1 IIIB(X4)毒株及HIV-1 Bal (R5)毒株均有明显的抑制活性，其IC50分别约为6.19X 109pfu/ml和3.43X 109pfu/ml ;细胞毒性检测结果显示多肽T7P和噬菌体T7M对淋巴细胞MT-2和人宫颈癌细胞TZM-bl在所示浓度下均无明显的毒性。
[0013]本发明的多肽及噬菌体具有体外抑制多种类型HIV-1病毒株的活性，并且对细胞具有低毒性，所述的多肽、噬菌体以及衍生物可单独或与其他成分组合使用，用于开发制备抗HIV药物及预防HIV-1性传播的生物制剂，能为阻断艾滋病病毒通过男男直肠性行为的传播提供新思路与新技术。[0014]为了便于理解，以下将结合具体的附图和实施例对本发明进一步阐释。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1，多肽T7P对HIV-1活病毒的抑制试验结果，其中，con为对照多肽。
[0016]图2，多肽T7P细胞毒性的检测。
[0017]图3，噬菌体T7M对HIV-1活病毒的抑制试验结果，其中，M13噬菌体为对照。
[0018]图4，噬菌体T7M细胞毒性的检测。
【具体实施方式】
[0019]下列实例中未注明具体实验方法的均可按照常规方法进行，如《分子克隆实验指南》或按照制造生产厂商的使用说明。
[0020]实施例1
[0021]1、T7P多肽序列及I7M噬菌体的筛选及鉴定
[0022]利用噬菌体展示技术，以HIV_lgp41上CHR区和MPER区的多肽(T20)为诱饵进行噬菌体筛选；将筛选获得的与诱饵蛋白结合的噬菌体进行扩增并测序鉴定，具体方法如下:
[0023](I)将噬菌体洗脱物加入到40ml ER2738培养物中，37°C剧烈摇动培养4h ；
[0024](2)将培养物转入离心管中，4°C、10000rpm离心lOmin，上清液转入另一离心管中，再离心；
[0025](3)将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG 8000/2.5M NaCl,4°C沉淀过夜；
[0026](4) 4°C > 1000Orpm 离心 15min,倒掉上清液；
[0027](5)将沉淀物重悬于Iml Tris缓冲溶液中(pH=7.4)，简短离心，再将上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG 8000/2.5M NaCl再沉淀，冰上孵育60min ；
[0028](6) 4°C 1000Orpm离心IOmin，弃上清，再将沉淀物重悬于200 u I Tris缓冲溶液中，此即为扩增后的洗脱物；
[0029](7)将洗脱的噬菌体按比例稀释，每个稀释度取IOiU加入宿主大肠杆菌中，快速振荡混匀，室温温育5min;
[0030](8)将感染的细菌加入50°C预温的上层琼脂培养管中，快速混匀，立即倾注于37°C预温的LB/IPTG/Xgal平板上，适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开，倒置平板37°C培养过夜。
[0031](9)选取噬菌斑数少于100的平板，挑取分隔良好的噬菌斑接种于5ml LB/Amp培养基中，37°C、200rpm振荡培养12_16h，收集扩增的噬菌体；
[0032](10)用质粒提取试剂盒抽提噬菌体DNA，测序(引物5’-H0CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’)。根据测序结果，分析多肽序列的组成；从筛选到的与诱饵蛋白结合的噬菌体中获得T7P多肽序列:N-GMWFSGL-C (如前所述)，及含有该序列的I7M噬菌体。
[0033]2、T7P多肽的合成及I7M噬菌体的扩增
[0034]T7P多肽由吉尔生化上海有限公司合成，多肽序列为N-GMWFSGL-C(如前所述)，多肽的N端和C端分别被乙酰化和酰胺化，以提高稳定性；用高效液相色谱(HPLC)和质谱(PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)对其进行纯化和鉴定,显示序列正确，纯度大于98%。
[0035]T7M噬菌体扩增方法具体为:将之前筛选获得的I7M噬菌体加入到40ml ER2738培养物中，37°C剧烈摇动培养4h，4°C、1000Orpm离心lOmin，上清液转入另一离心管中，再离心，将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG 8000/2.5MNaCl，4°C沉淀过夜。4°C、1000Orpm离心15min,倒掉上清液,将沉淀物重悬于ImlTris缓冲溶液中(pH=7.4),简短离心，再将上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG 8000/2.5M NaCl再沉淀，冰上孵育60min，4°C 1000Orpm离心lOmin，弃上清，再将沉淀物重悬于200 u I Tris缓冲溶液中，此即为扩增后的I7M噬菌体。
[0036]T7M噬菌体滴 度测定方法如下:
[0037](I)接种ER2738菌株单菌落于4ml LB培养基中，摇床培养至对数中期。
[0038](2)细菌生长时，微波融化上层琼脂，分成3ml等份于灭菌试管中，每个T7M噬菌体稀释度一管，放置于50°C备用，同时用LB准备10倍系列稀释的I7M噬菌体(IO8-1O11X
[0039](3)将达到对数中期的ER2738培养物分成200ii I等份于微量离心管中，每管加入10 u I不同稀释度的T7M噬菌体，快速震荡混匀，室温温育5min。
[0040](4)将感染的细菌加入50°C预温的上层琼脂培养管中，快速混匀，立即倾注于37°C预温的LB/IPTG/Xgal平板上，适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开，倒置平板37°C培养过夜。
[0041](5)检查平板，计数有大约IO2个噬菌斑的平板上的斑数，然后用次数目乘以稀释因子即得到每10 U1T7M噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。
[0042]3、T7P多肽及I7M噬菌体对HIV-1的抑制活性检测
[0043](1)MT_2 感染系统
[0044]将待检测的T7P多肽、T7M噬菌体以及对照物倍比稀释，并将其加入96孔平底细胞培养板中，50 iil/孔；将100倍TCID50的HIV-1毒株，50 iil/孔，与不同浓度的候选物在37° C共孵育30min ;将I X IO5个/ml，100 U I/孔的MT-2细胞加入上述96孔细胞培养板中，37° C 5% C02培养箱培养过夜；弃去150iil/孔上清，补入新鲜RPM1-1640培养基，补A IL-2维持细胞生长；感染后第4天，弃去100 u I/孔上清，补入新鲜RPM1-1640培养基；感染后第7天，收集100 u I/孔培养上清与等量5%Triton X-100混合，待病毒裂解后，利用p24检测试剂盒测定上清中p24抗原含量(IC50为50%抑制有效浓度，IC90为90%抑制有效浓度)。采用Compusyn 1.0软件(由Sloan-Kettering癌症中心的周廷潮教授提供)进行计算。
[0045](2) TZM-bl 和 5.25M7 感染系统
[0046]将待检测的T7P多肽、T7M噬菌体以及对照物倍比稀释，并将其加入96孔平底细胞培养板中，50iU/孔；将100倍TCID50的HIV-1毒株，50 iil/孔，与不同各浓度的候选物在37。C共孵育30min ;将4X IO5个/ml，100 iil/孔的TZM-bl或5.25M7加入上述96孔细胞培养板中，37° C 5% C02培养箱培养过夜；弃去150 iil/孔上清，补入新鲜DMEM或1640培养基；感染后第3天，用荧光素酶试剂盒检测荧光素酶的表达。或按MT-2的方法检测P24的含量(IC50为50%抑制有效浓度，IC90为90%抑制有效浓度)。采用Compusyn 1.0软件(由Sloan-Kettering癌症中心的周廷潮教授提供)进行计算。
[0047]3、T7P多肽及T7M噬菌体细胞毒性的检测
[0048]选取的细胞系为淋巴细胞MT-2和人宫颈癌细胞TZM-bl，细胞毒性检测用XTT法测定:将靶细胞接种于96孔细胞培养板，每孔100 u 1，细胞数为5X IO5个/ml，待24小时后长成完整单层，用DMEM将待测品稀释成10个不同浓度，每孔加入100 u I化合物，每孔总体积200 u 1，每个稀释度4复孔，同时设正常细胞对照组，置于37°C、5%C02温箱中继续培养。共同培养4天后，每孔加入50 ii L的含有0.02 ii M PMS的XTT溶液(lmg/ml)，继续培养4h后倾去培养液，震荡溶解lOmin，酶标仪于450nm处测定吸光度(A)值。对悬浮细胞MT-2的处理，不需要贴壁的过程，2 X IO5个/mL种板后，直接加入药物混合，其余的操作类同。
[0049]实验结果显示，T7P多肽对HIV-1IIIB (X4)毒株及HIV-lBal (R5)毒株均有明显的抑制活性，其IC50分别约为11.62ii M和14.56ii M。噬菌体T7M对HIV-1 IIIB (X4)毒株及HIV-1Bal (R5)毒株也均有明显的抑制活性，其IC50分别约为6.19X 109pfu/ml和
3.43X 109pfu/ml。细胞毒性检测结果显示多肽T7P和噬菌体T7M对淋巴细胞MT-2和人宫颈癌细胞TZM-bl在所示 浓 度下均无明显的毒性。
【权利要求】
1.一种多肽，其特征在于，该多肽由7个氨基酸组成，其氨基酸序列为:N端-Gly-Met-Trp-Phe-Ser-Gly-Leu-C 端。
2.—种曬菌体，其特征在于，该曬菌体含有权利要求1所述的多肽序列:N端-Gly-Met-Trp-Phe-Ser-Gly-Leu-C 端。
3.一种含有权利要求1的多肽的氨基酸序列的多肽衍生物，其特征在于，所述衍生物包括重组蛋白或活性物质。
4.权利要求1的多肽在制备体外抑制艾滋病病毒感染活性的生物制剂中的用途。
5.权利要求2的噬菌体在制备体外抑制艾滋病病毒感染活性的生物制剂中的用途。
6.权利要求3的多肽衍生物在制备体外抑制艾滋病病毒感染活性的生物制剂中的用途。
7.权利要求1，2或3所述的多肽、噬菌体和/或衍生物单独或与其他成分组合在制备抗艾滋病病毒感染药物 及预防艾滋病病毒-1性传播的生物制剂中的用途。
【文档编号】A61P31/18GK103709232SQ201210379629
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2012年10月8日 优先权日:2012年10月8日
【发明者】姜世勃, 陆路, 李雯, 徐巍 申请人:复旦大学