专利名称：一种灵活产生形态各异性细胞模块的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微流控技术、材料化学、组织工程、再生医学等领域，具体涉及一种灵活产生形态各异性细胞模块的方法及应用。
背景技术：
组织工程及再生医学是现在医学、生物领域最为关注的热点之一，而在体外模拟再生人体的功能组织在解决病人组织损伤、器官移植等问题中具有较大的潜力。近年来，在体外模拟再生人体的功能组织主要有两种思路1、通过定向诱导克隆的方法使干细胞直接分化为特定组织器官；2、按照原始组织器官内细胞的空间分布，直接将细胞排列成相应组织的形状。而细胞模块(cell block)概念的出现，为第二种思路通过了一个有效可行的技术平台。细胞模块是指具有特定形状三维支架并且在其内部或表面附着有细胞，将这些细胞模块拼装在一起，便可以体外模拟组织器官。现在产生细胞模块的方法主要有两种水凝胶定点曝光法及模具法。水凝胶定点曝光法是指将水凝胶类聚合物通过定点曝光的方法使其固化，形成特定形状的模块，再用于细胞培养(Yanan Du、Edward Lo elt. PNAS2008vol. 105no. 289522-9527)。但该方法的缺陷在于支架使用的材料有限，并且水凝胶类聚合物的生物相容性及可降解性与蛋白类材料相比较差。模具法即是指利用特定形状的模具通过铸模的方法得到相应形状的模块，但此方法的缺陷在于细胞模块中常使用的材料机械强度较软，其在模具中固化成型后难以完整的释放出来。所以实际应用中，模具法产生的模块形状都比较简单，如果要产生复杂模块，则常常要选择机械强度高但生物相容性略差的聚合物材料(Wonjae Lee and Jon ParkAdv. Mater. 2012vol. 24No. 395339-5344)。本发明涉及以一种可以主动释放模具中细胞模块的方法，用于广泛材料的、形态复杂的细胞模块的产生。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵活产生形态各异性细胞模块的方法及应用，该方法解决了现有模具法细胞模块生成过程中材料可选择范围小、模块完整性保持及释放困难等问题；并且在体外组织重建及临床组织修复中具有应用潜力。本发明提供了一种灵活产生形态各异性细胞模块的方法，该方法的具体步骤如下——利用常规软光刻的方法，产生具有特定通道结构的PDMS块并且在通道结构的中间打孔，同时，将一块弹性薄膜(10-100微米厚)与上述带有结构的PDMS块不可逆封接，作为模具的下层；—将一块无结构的PDMS块两端打孔为加样液池，作为模具上层，并通过PDMS聚合物间静电力与下层模具可逆封接，形成完整模具；——在模具上层的加样液池中加入胶体溶液；——在模具下层的气孔中施加0. 02-0. 04MPa负压，使夹在中间的PDMS薄膜产生形变，从而在模具上下两层之间形成了而形成了空腔并产生负压，负压将两端液池中的胶体溶液吸到通道中并注满整个模具；
—模具空腔内的胶体溶液通过紫外曝光(用于水凝胶)、37度加热(用于胶原)、 真空干燥(用于明胶)等方式固化，形成特定形状的胶体模块；
—将上层PDMS模具揭开，并且将下层模具气路内的负压变为O.03MPa正压，使 PDMS薄膜向上凸起，将已固化的胶体模块从通道中释放出来；
——将胶体模块作为细胞支架进行细胞培养，生成细胞模块。
本发明提供的灵活产生形态各异性细胞模块的方法，所述模具材料为PDMS，模具中的气控薄膜材料为PDMS膜，保鲜膜、醋酸纤维素膜等弹性薄膜。其中，PDMS膜可以通过甩胶操作(1000-5000转/分钟，30秒)获得；保鲜膜、醋酸纤维素膜可以从公司购买。PDMS 模具上的微结构由常规软光刻方法制成；模具上微结构的样子与尺寸决定了细胞模块的形状及尺寸。
本发明提供的灵活产生形态各异性细胞模块的方法，所述的胶体溶液可以为明胶、胶原、聚乙二醇等生物相容性好并且可以在光照、加热等特定条件下由液态转变为固态的胶类聚合物。
本发明提供的灵活产生形态各异性细胞模块的方法，所述制作过程可以实现胶体溶液的自动灌注与固化后胶体模块的主动释放。上述操作是通过控制模具间的一层PDMS 膜形变实现的。模具制作完成后，及结构分为上中下三层上层为带有液池的PDMS盖片； 中间层为PDMS薄膜；下层为带有灌注通道及气孔的PDMS底座。其中，中间的PDMS薄膜与上层PDMS盖片间为可逆封接，且没有缝隙；而PDMS薄膜与下层PDMS底座为不可逆封接， 且该薄膜在灌注通道处悬空，即留有空间。铸模操作过程如下1、将胶体溶液加在上层盖片的液池中，此时上层盖片与中间的PDMS膜密封，液体不流动；2、在下层底座的气孔中施加O. 02-0. 04MPa的负压，是中间PDMS膜发生形变并贴附在下层灌注通道上，此时，在中间 PDMS膜与上层盖片间出现了一个新的灌注通道且通道中为负压；3、胶体溶液在负压作用下流入灌注通道；4、在特定条件下使聚合物溶液固化；5、揭掉上层盖片；6、将底座气孔中的负压改为O. 02-0. 04MPa的正压，使PDMS膜向上凸起 ，释放出模块。从而完成了胶体溶液的自动灌注与固化后胶体模块的主动释放。
本发明提供的灵活产生形态各异性细胞模块的方法，所述模块可以在组织修复， 体外组织模拟中得到应用。在胶体模块中，可以有两种施加细胞的方法I、模块生成后再接种细胞，形成细胞生长在外部的细胞模块；2、在灌注模块时直接灌注细胞胶体悬液，形成细胞生长在内部的细胞模块。得到特定形状的细胞模块后，通过拼装、组和、共培养等方法可以进行组织修复，体外组织模拟等研究。
本发明提供的灵活产生形态各异性细胞模块的方法，其优点在于1、操作简单快速；2、无需昂贵的仪器设备；3、模具可以重复使用，降低成本；4、产生模块的形状灵活可控；5、模块主动释放有利于保持其完整性；6、模块可使用的材料广泛；7、产生的模块可以灵活的拼装。
图I.制作胶体模块流程示意图，其中，I灌注模具；2胶体固化；3、主动释放；
图2.聚乙二醇为材料制成模块的实物图，其中，a、齿轮结构；b、六角星结构；C、两个齿轮结构进行拼装；
图3.明胶为材料制成模块的实物图，其中，a、荧光标记模块实物表征图；b、电镜表征图4.明胶模块为支架外部进行细胞培养，其中，a、培养时间一天；b_c、培养时间5 天;
图5.胶原材料内部生长细胞的细胞模块，其中，a、40倍放大视野；b、100倍放大视
图6.以明胶为材料的细胞模块模拟拼装人体内脏结构，其中，a、明场照片；b、荧光照片；c_d、脑、胃局部放大照片。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例I :
灵活产生形态各异性细胞模块的方法，如图I所示，其具体步骤如下
——利用常规软光刻的方法，产生具有特定通道结构的PDMS块并且在通道结构的中间打孔，同时，将一块弹性薄膜(10-100微米厚)与上述带有结构的PDMS块不可逆封接， 作为模具的下层；
—将一块无结构的PDMS块两端打孔为加样液池，作为模具上层，并通过PDMS聚合物间静电力与下层模具可逆封接，形成完整模具；
——在模具上层的加样液池中加入胶体溶液；
——在模具下层的气孔中施加O. 02-0. 04MPa负压，使夹在中间的PDMS薄膜产生形变，从而在模具上下两层之间形成了而形成了空腔并产生负压，负压将两端液池中的胶体溶液吸到通道中并注满整个模具；
——模具空腔内的胶体溶液通过紫外曝光(用于水凝胶)、37度加热(用于胶原)、 真空干燥(用于明胶)等方式固化，形成特定形状的胶体模块；
—将上层PDMS模具揭开，并且将下层模具气路内的负压变为O.03MPa正压，使 PDMS薄膜向上凸起，将已固化的胶体模块从通道中释放出来；
——将胶体模块作为细胞支架进行细胞培养，生成细胞模块。
实施例2
利用本发明方法进行聚乙二醇模块的制作。按照实施例I中操作流程，通过紫外曝光的方法使10%的聚乙二醇溶液固化(10-100%都可以实现)，并释放出来形成聚乙二醇模块。如图2所示，本方法产生的聚乙二醇模块结构完整、边缘整齐、并且可以用于制作较为复杂的微齿轮结构(600-1000微米)。另外制成的齿轮结构可以在显微镜下(20倍视野) 进行拼装(图2，C)。
实施例3
利用本发明方法进行明胶模块的制作。按照实施例I中操作流程，通过真空干燥溶剂挥发的方法使30%的明胶溶液固化(20-100%都可以实现)，并释放出来形成明胶模块。 如图3所示，本方法产生的明胶模块结构完整、边缘整齐、并且可以灵活制作各种形状的明胶模块(模块直径800微米，环形边宽100微米)。进一步显示出了本发明的优势及可行性。实施例4 支架外部生长细胞的细胞模块。如图4所示，本发明制成的明胶模块后可以用于细胞培养形成细胞模块。在接种第I天时，细胞粘附在模块表面并开始生长(图4、a) ；5天后细胞大量增殖，在模块外围形成了一圈上百微米厚的细胞实体膜(图4、b)，显示出了明胶模块优秀的生物相容性。另外，从图4、c中可以发现，5天后，细胞向模块空心圆环处生长，并且有将其填满的趋势，显示出了该模块在组织损伤修复研究中的潜力。实施例5 支架内部生长细胞的细胞模块。本发明在制作胶原模块时，在无菌条件下，直接将细胞的胶原悬液加入到模具内，37度半小时胶原固化后形成了内部生长有细胞的细胞模块。如图5所示，胶原模块内部的细胞生长状态良好，并且表现出了典型的三维培养形态。 实施例6 体外细胞模块组装。如图6所示，以明胶为材料的细胞模块模拟拼装出人体内脏结构。利用本发明方法得到各种内脏形状的明胶模块，并用于细胞培养形成细胞模块。在显微镜下(20倍视野)将其组装成人体内脏的结构，显示出了本方法在组织体外组装重建中的潜力。
权利要求
1.一种灵活产生形态各异性细胞模块的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下 ——利用常规软光刻的方法，产生具有特定通道结构的PDMS块并且在通道结构的中间打孔，同时，将一块弹性薄膜与上述带有结构的PDMS块不可逆封接，作为模具的下层； ——将一块无结构的PDMS块两端打孔为加样液池，作为模具上层，并通过PDMS聚合物间静电力与下层模具可逆封接，形成完整模具； ——在模具上层的加样液池中加入胶体溶液； ——在模具下层的气孔中施加O. 02-0. 04MPa负压，使夹在中间的PDMS薄膜产生形变，从而在模具上下两层之间形成了而形成了空腔并产生负压，负压将两端液池中的胶体溶液吸到通道中并注满整个模具； ——模具空腔内的胶体溶液通过固化，形成特定形状的胶体模块； ——将上层PDMS模具揭开，并且将下层模具气路内的负压变为O. 03MPa正压，使PDMS薄膜向上凸起，将已固化的胶体模块从通道中释放出来； ——将胶体模块作为细胞支架进行细胞培养，生成细胞模块。
2.按照权利要求I所述灵活产生形态各异性细胞模块的方法，其特征在于所述特定通道结构的PDMS块中通道的形状根据不同实验的需要自行设计加工。
3.按照权利要求I所述灵活产生形态各异性细胞模块的方法，其特征在于所述弹性薄膜为PDMS膜、保鲜膜、醋酸纤维素膜中的至少一种。
4.按照权利要求I或2所述灵活产生形态各异性细胞模块的方法，其特征在于所述弹性薄膜的厚度为10-100微米。
5.按照权利要求I所述灵活产生形态各异性细胞模块的方法，其特征在于所述弹性薄膜与带有结构的PDMS块不可逆封接的方法有等离子体处理或PDMS胶水粘贴方式。
6.按照权利要求I所述灵活产生形态各异性细胞模块的方法，其特征在于所述的胶体为明胶、胶原或聚乙二醇水凝胶一些生物相容性好并且在特定条件由液态转变为固态的胶类聚合物。
7.按照权利要求I所述灵活产生形态各异性细胞模块的方法，其特征在于所述胶体溶液固化的方式有紫外曝光、加热或真空干燥。
8.权利要求I所述方法产生的细胞模块的应用，其特征在于每个细胞模块都能生长不同种类的细胞并且进行组装，在组织工程及再生医学领域得到应用。
全文摘要
一种灵活产生形态各异性细胞模块的方法及应用，本发明以聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片上的微通道为模具，通过灌注、固化的方法产生明胶、胶原、聚乙二醇等具有生物相容性胶类聚合物的模块，并且将该模块作为细胞生长的支架应用于组织的体外组装及修复；同时，本发明在微模具内引入了气压可控的PDMS薄膜结构，可以将其内部产生的模块进行主动释放。本发明可以简单、快速、灵活的产生各种形态的可固化胶类聚合物模块，并且使其从模具中主动释放，有利于保持这些模块结构的完整性；期望提供一种灵活可控的细胞支架生成方法，并且在组织工程及再生医学中得到应用。
文档编号A61L27/38GK102978151SQ201210439689
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者秦建华, 张旭, 孟昭旭, 马静云 申请人:中国科学院大连化学物理研究所