专利名称：一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗。
背景技术：
猪流行性腹湾(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹湾病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)弓丨起的以腹 写、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。PEDV与猪传染性胃肠炎病毒 (transmissible gastroenteritis virus, TGEV)同属于尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus),两种病毒感染后所引起的临床症状极其相似，给养猪业带来严重危害。PEDV经口鼻感染后直接进入小肠，在小肠上皮细胞增殖，引起小肠绒毛吸收上皮细胞变性、损伤、脱落和小肠绒毛萎缩，导致肠内酶活性降低，吸收功能障碍，肠道内渗透压增高，引起渗透性腹泻。造成掉膘、降低饲料利用率，浪费药物和人力等所造成的经济损失是非常严重的。该病是世界性的疾病之一，亚洲、欧洲以及美洲等国家的许多猪阳性率都有很闻。M蛋白是由226个氨基酸组成、分子质量为27KD 32KD的膜糖蛋白，在病毒粒子的组装和出芽过程中具有重要作用。M蛋白在感染细胞中位于高尔基体内，不能被转运到细胞膜，由3个结构域组成，即暴露于病毒囊膜外短的糖基化N末端区、病毒囊膜中大的C末端区和中间为α螺旋区。在补体存在的条件下，抗M蛋白囊膜外抗原表位的单克隆抗体能中和病毒的感染性。另外，M蛋白能介导机体产生α干扰素，所以M蛋白可以作为PEDV基因工程疫苗的候选抗原。乳酸乳球菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌，因其在食品工业各个领域中的长期应用已证明不具有致病性，被公认为安全级微生物。利用一些乳酸乳球菌在胃肠道、泌尿、 生殖系统中或黏膜部位粘附存活且无病原性等特点，广泛开展了活菌口服后在体内定植及疫苗的研究。 然而，现有的疫苗一般需要注射，常规注射疫苗会产生应激及疫苗吸收的问题，而通过口服免疫时，免疫原在到达小肠粘膜之前会存在被降解或灭活的可能，虽然以细菌病毒为活载体可达到这一目的，但细菌病毒对人体会有一定的伤害性，且不能在肠道粘膜定居。发明内容
本发明的主要目的在于提供一种安全无毒，能在肠道粘膜定居的猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗。本发明采用如下技术方案它是保藏在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-M CCTCC M 2012354 ;保藏名称一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗乳酸乳球菌 MG1363/pMG36e-M lactococcus lactis MG1363/pMG36e_M ;保藏日期2012. 9. 16 ;保藏单位地址中国武汉武汉大学。本发明猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法的有益效果是可以口服，口服免疫的优点是可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，这尤其适应于肠道粘膜传染病，避免了常规注射疫苗所引起的应激及疫苗吸收问题，但口服免疫需要克服免疫原在到达小肠粘膜之前被降解或灭活的可能，满足这一要求的必须是活的载体系统来传递完整无损的抗原成分。以细菌病毒为活载体均可达到这一目的，但作为安全无毒，能在肠道粘膜定居的活载体系统，乳酸乳球菌是最合适的载体系统。口服疫苗通过胃肠黏膜进行抗原递呈，可经不同的免疫通路产生与常规注射类似的免疫反应。
图1为酶切鉴定结果图；图2为Western blot分析结果图；图3为冻干曲线图。
具体实施方式
请参阅图1、图2和图3所示，本发明的一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，包括以下步骤1).合成M基因将合成M基因连接到PES载体上，按照合成序列说明书进行酶切，分别克隆至PMD18-T 质粒载体上，转化感受态JM109细胞，挑取阳性菌落，OMEGA试剂盒小量提取质粒，酶切鉴定的阳性质粒(见图1);2).表达载体的构建 将含有正确方向和序列的M基因片段用限制性内切酶EcoR I和Sal I切下，经胶回收纯化与载体质粒pMG36e回收纯化后进行16°C过夜连接；将连接产物与感受态细胞MG1363 (实验室保存)轻柔混匀后，冰上放置5min，将其转入2mm的预冷电转化杯中，迅速电击，电击参数为电压2. 5kV，电击时间为5ms，电击后加入900 μ I冰预冷的SGM17恢复培养基，混匀，将菌液转移至1. 5ml离心管中，冰上放置10min，28°C厌氧培养2h，取适量菌液涂布于含有5 μ g/ml红霉素的GM17 (M17+0. 5%葡萄糖)琼脂培养基上，28°C厌氧培养2_3d ;于平板上挑取单个菌落，分别接种于含有5 μ g/ml红霉素的GM17液体培养基中，28°C厌氧培养过夜后，从MG1363中提取质粒；对重组质粒进行酶切鉴定及序列测定分析；3).蛋白的诱导表达从表达重组蛋白菌株的琼脂板上挑取单个菌落接入含红霉素的GM17培养基中，同时以携带空质粒菌株作为阴性对照，28°C非震荡培养至达0D600=1. 0，加入nisin至终浓度为 10ng/ml，继续培养IOh后离心收集菌体，用灭菌PBS洗涤细胞I次，离心收集菌体，最后用灭菌的PBS悬浮细胞，进行SDS-PAGE蛋白检测实验；结果表明所表达的重组蛋白大小约为 26KDa ；SDS-PAGE电泳结束后，将未染色的聚丙酰胺凝胶上的蛋白转移到醋酸纤维素膜上， 用1%的BSA封闭，以兔抗PEDV血清为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG的二抗与之反应，最后用DAB显色；Western鉴定(见图2)重组蛋白具有与PED全病毒制备的抗血清发生反应的能力，证明重组蛋白具有了良好的反应原性；4).重组菌保存实验从表达重组蛋白菌株的培养液中取200μ1，接种于含红霉素的100ml GMl7培养基中； 28°C非震荡培养至0D600=1. O,与IOOml含3%蔗糖和10%脱脂牛奶混合液混合均匀，分装为 2ml/管，冻干；重组菌冻干曲线(见图3)，冻干后分别经过7天、14天、21天、I个月，2个月及3个月进行菌体复苏并计数，结果显示活菌数均在108CFU/ml (见表I)；
权利要求
1.一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗，其特征在于，它是保藏在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-M CCTCC M 2012354。
全文摘要
本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗，它是保藏在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为乳酸乳球菌 MG1363/pMG36e-M CCTCC M 2012354。口服免疫的优点是可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，这尤其适应于肠道粘膜传染病，避免了常规注射疫苗所引起的应激及疫苗吸收问题，作为安全无毒，能在肠道粘膜定居的活载体系统，乳酸乳球菌是最合适的载体系统。口服疫苗通过胃肠黏膜进行抗原递呈，经不同的免疫通路产生与常规注射类似的免疫反应。
文档编号A61K39/215GK102989010SQ201210509229
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月4日 优先权日2012年12月4日
发明者李朝阳, 李明义, 石乔 申请人:山东信得科技股份有限公司