专利名称：一种生物活性多肽lplp及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种生物活性多肽LPLP及其制备和应用。
背景技术：
在牛乳经乳酸菌发酵的过程中，牛乳中的一部分蛋白质被乳酸菌代谢利用，并发生了一系列生理生化反应，使蛋白质变为多肽或者游离的氨基酸，被人体消化吸收或通过小肠上皮细胞的吸收转运直接进入人体的血液循环。在这些多肽中，有一部分具有特殊的生理功能，被称为“生物活性多肽”。氧化反应和氧化代谢对于食物和人体来说都是至关重要的，自由基和活性氧引起了一系列的氧化反应。当过量的自由基形成，它们会超过保护性酶如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的保护作用，从而导致脂质氧化、细胞凋亡等一系列的副作用产生。这一类的氧化反应，不仅影响含脂食物的保质期，也对人体的健康造成了一定的危害，如风湿性关节炎、糖尿病、动脉硬化等。此外，Collins等人2005年研究发现癌症的发生也与DNA的氧化损伤有关。早期一些人工合成的抗氧化剂如丁基羟基茴香醚(BHA)、2，6- 二叔丁基_4_甲基苯酚(BHT)被运用到食品中，作为脂质的抗氧化剂，但这些人工合成的添加剂对于人体都有潜在的风险。因此，在天然食物来源中寻找安全的抗氧化剂尤为重要。近些年来，人们发现一些食物来源的多肽类物质具有良好的抗氧化作用，如玉米短肽、大豆肽、牛乳多肽等。这些多肽可以通过微生物发酵、消化酶解等多种途径得到，并且大多具有抗氧化活性的多肽是由2 20个氨基酸残基组成，分子量小于6000Da，含有一定量的疏水氨基酸、芳香族氨基酸。免疫活性肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性多肽。1981年Jolles等 人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一个氨基酸序列为Val-Glu-Pro-1Ie-Pro-Tyr的六肽，体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨曬细胞对绵羊血红细胞的吞曬作用。Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗。李素萍等人用合成的乳源免疫调节肽(PGPIPN)饲喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用和红细胞相关的免疫调节功能有显著的增强。研究表明，免疫活性肽不仅能够增强机体免疫力，刺激机体淋巴细胞的增殖，增强巨噬细胞的吞噬功能，还能促进细胞因子的释放、提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且不会引起机体的免疫排斥反应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物活性多肽，其氨基酸序列为Leu-Pro-Leu-Pro(LPLP, SEQ ID NO:1)。较优的，所述生物活性多肽的来源为乳源性。
本发明的生物活性多肽LPLP为乳源性，具体来源于￠-酪蛋白，并且为￠-酪蛋白(SEQ ID NO:3)第150 153位的氨基酸残基。较优的，所述生物活性多肽具有体外抗氧化活性和增强机体免疫力的功能。本发明的生物活性多肽可以通过基因工程的方法和化学方法人工合成，也可以从乳制品中通过分离纯化的方法直接获得。本发明还公开了编码前述生物活性多肽的核苷酸片段。￠-酪蛋白的氨基酸序列以及核苷酸序列为既有技术，编码￠-酪蛋白第150 153位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性多肽LPLP。进一步的，编码前述生物活性多肽的核苷酸片段，其序列为:5’ -cttcctctgcct-3’(SEQ ID N0:2)本发明第二方面公开了前述生物活性多肽的制备方法，步骤如下:I)发酵:将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)添加到脱脂乳中进行厌氧发酵，获得瑞士乳杆菌发酵乳；2)多肽的粗提:对步骤I)的瑞士乳杆菌发酵乳进行低温离心分离，取上清液；3)多肽的纯化:a.对步骤2)的上清液进行超滤处理，收集滤液；b.收集的滤液采用反向层析柱SOURSE 5RPC ST (4.6 X 150mm)进行反相高效液相色谱分离，收集生物活性多肽 LPLP。本发明所述脱脂乳为经过脱脂处理的乳制品，通常脱脂乳中脂肪含量小于0.1%。较优的，步骤I)所述厌氧发酵的条件为:发酵温度36 38°C，发酵培养15 20h ；优选发酵培养19h。较优的，步骤2)所述低温离心的条件为:4°C,8000 IOOOOrpm,离心15 30min。较优的，步骤3) a所述超滤法所采用的滤膜的截留分子量分别为IOkDa和3kDa。本发明采用截留分子量分别为10kDa、3kDa的滤膜，使样品依次通过两张滤膜进行超滤。更优的，步骤3) a所述超滤过程中，压力范围为0.f 0.3MPa，滤液流速为0.8
1.2mL/min。较优的，步骤3 ) b反相高效液相色谱分离法中，流动相A为含有2%乙腈和0.05%TFA的ddH20 ;流动相B为100%乙腈。较优的，步骤3) b反相高效液相色谱分离法中，收集分子量为439.29Da的多肽的洗脱峰，即为生物活性多肽LPLP。在本发明反相高效液相色谱法分离过程中，已知LPLP的分子量，收集分子大小为439.29Da的洗脱峰，即为本发明的生物活性多肽LPLP。具体的，本发明分子大小为439.29Da的洗脱峰其保留时间为21min。本发明第三方面公开了前述生物活性多肽在制备抗氧化和/或增强机体免疫力的食品、保健品及药物中的应用。本发明的生物活性多肽LPLP可以用于酸奶等乳制品、减少自由基对皮肤伤害的化妆品；并且由于本发明的生物活性多肽LPLP能够通过胃肠道直接吸收不被降解，因此可以用于制备提高免疫力的保健品，或者用于制备具有抗氧化和/或增强机体免疫力的药物。
本发明第四方面公开了一种抗氧化药物，包含前述生物活性多肽LPLP或前述生物活性多肽LPLP的衍生物。本发明第五方面公开了一种增强机体免疫力药物，包含前述生物活性多肽LPLP或前述生物活性多肽LPLP的衍生物。所述多肽的衍生物，是指在多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。本发明生物活性多肽LPLP的有益效果为:本发明的乳源性生物活性多肽LPLP具有很好的抗氧化活性和促进机体免疫力活性；一方面能够清除机体内的自由基，减少自由基对人体的伤害；另一方面，本发明的生物活性多肽LPLP还能够增强机体免疫力，增强巨噬细胞的吞噬功能，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且能够通过胃肠道直接吸收不被降解，进入体内不会引起机体的免疫排斥反应。对开发具有抗氧化功能及增强免疫功能的乳制品、保健品和药品具有十分重要的意义。
图1:瑞士乳杆菌发酵乳与未经发酵处理的脱脂乳超滤后粗提物的质谱对比图(A:3000Da未经发酵的脱脂乳粗提物质谱图，B:3000Da瑞士乳杆菌发酵乳粗提物质谱图)图2:3000Da未经发酵脱脂乳粗提物与3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳粗提物分子
量差异及丰度比较图3:反相高 效液相色谱分离对照发酵乳和瑞士乳杆菌发酵乳中生物活性多肽比较图(a曲线:对照发酵乳反相高效液相色谱215nm的洗脱图谱；b曲线:瑞士乳杆菌发酵乳3000Da上清液反相高效液相色谱215nm的洗脱图谱)图4:质量色谱提取图(m/z=439.29)图5:质荷比为439.29的片段的一级质谱6:质荷比为439.29的片段的二级质谱7:质荷比为439.29的多肽az、by断裂情况及计算得到的序列图8: [DPPH ]甲醇标准曲线图9:瑞士乳杆菌发酵乳中生物活性多肽对[DPPH ]自由基清除率图10:FeS04标准曲线结果图11:酶解处理后LPLP的总离子流12:酶解处理后LPLP的一级质谱图
具体实施例方式在进一步描述本发明具体实施方式
之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Samtoook等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition,2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego ；ffolffe, CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DSIN ENZYMOLOGY, Vol.304, Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.ffolffe, eds.), AcademicPress, San Diego,1999 ；和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119, ChromatinProtocols (P.B.Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999 等。实施例1活性肽的制备一、发酵乳的制备I)瑞士乳杆菌发酵乳采用脱脂 奶粉(新西兰NZMP牌脱脂奶粉)与水配置12wt%的脱脂乳(12g脱脂奶粉加入到88g水中，下同)。在无菌条件下，挑取瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus,CICC6024)菌落三环，将其加入已灭菌的12wt%的脱脂乳中，在无菌条件下搅拌均匀。接种完成后，用铝箔封口，以防止污染。置于培养箱中37°C培养19h。培养结束后，在无菌条件下将凝乳搅拌均匀，即完成瑞士乳杆菌的活化，制得用于制备瑞士乳杆菌发酵乳的发酵剂。取IOmL已制备的瑞士乳杆菌发酵剂接种到500mL已灭菌的12wt%脱脂乳中(接种率为2v/v%)，37°C发酵19h后，在无菌条件下搅开凝乳，在4°C条件下保存，得到瑞士乳杆菌发酵乳。2)对照发酵乳采用同样方法，使用保加利亚乳杆菌(Lactobacillus Bulgaricus,LB340)和嗜热链球茵(Streptococcus Thermophilus, TA40)作为发酵菌种制作对照发酵乳。具体方法为:在无菌条件下，分别挑取保加利亚乳杆菌与嗜热链球茵菌落三环，将其分别加入已灭菌的12wt%的脱脂乳中，在无菌条件下搅拌均匀。接种完成后，用铝箔封口，以防止污染。置于培养箱中37°C培养19h。培养结束后，在无菌条件下将凝乳搅拌均匀，即完成保加利亚乳杆菌与嗜热链球茵的活化，制得用于制备对照发酵乳的两种发酵剂。取5mL已制备的保加利亚乳杆菌发酵剂和5mL嗜热链球菌发酵剂，共同接种到500mL已灭菌的12被％脱脂乳中(接种率为2v/v%)，37°C发酵19h后，在无菌条件下搅开凝乳，在4°C条件下保存，得到对照发酵乳。二、生物活性多肽的确认1.实验方法I)样品处理分别将前一步骤制备的瑞士乳杆菌发酵乳和对照发酵乳，以及12wt%的脱脂乳装入离心管中进行低温离心，离心条件为9000rpm/min，4°C，20min。离心后弃沉淀，取上清液。
将上清液分别倒入超滤杯中，为了防止生物活性多肽被氧化，打开氮气罐压力阀充氮，同时打开磁力搅拌装置，以防止溶液出现浓差极化现象。使样品分别通过截留分子量为10kDa、3kDa的滤膜，待有滤液流出时进行收集。超滤过程中，应保持流速稳定，滤液清澈。流速控制在lmL/min左右，压力为0.r0.3MPa，分别收集瑞士乳杆菌发酵乳、对照发酵乳，以及未发酵的12wt%脱脂乳的滤液作为实验样、对照样以及空白对照，于-4V冷冻保存。2)质谱分析将前一步骤收集的瑞士乳杆菌发酵乳超滤后的滤液(实验样)和脱脂乳超滤后的滤液(空白对照)进行质谱分析，质谱条件如下:离子方式:ES+质量范围(m/z):100-1500毛细管电压(Capillary)(kV):3.0采样锥(V):35.0离子源温度(°C)):100去溶剂温度(°C ):350去溶剂气流(L/hr):600.0碰撞能量(eV):6. 0扫描时间(sec):0.3内扫描时间(sec):0.022.实验结果瑞士乳杆菌发酵乳超滤后的滤液(实验样)和脱脂乳超滤后的滤液(空白对照)的质谱对比结果见图1 2。图1中的A曲线为3000Da未经发酵的脱脂乳(空白对照)粗提物样品，图1中的B曲线为3000Da瑞士乳杆菌发酵乳粗提物样品(实验样)。经过比较可以看出，经过瑞士乳杆菌发酵后，3000Da未经发酵乳粗提物和3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳粗提物的组分上发生很大变化，且这些组分由于疏水性不同保留时间亦有所差异。此质谱质量范围为100Da-1500Da，因此可知脱脂乳在1500Da以下、210nm处有吸收的小分子物质相对较少；而经过瑞士乳杆菌发酵后，在这一分子量范围内的物质明显增多，说明了这些多肽并不存在于未经发酵处理的脱脂乳中，而是经瑞士乳杆菌发酵后才产生的。而且我们发现随着发酵时间的延长，多肽的丰度明显增多，进一步证实了通过瑞士乳杆菌的发酵，脱脂乳中原有的大分子蛋白被分解，从单一的大分子蛋白变为量多且复杂的小分子多肽。图2是3000Da未经发酵脱脂乳(空白对照)粗提物与3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳(实验样)粗提物不同分子量物质丰度差异的比较结果。纵向轴表明在脱脂乳粗提物中所含物质对应的分子量，横向轴表明发酵乳粗提物中所含物质对应的分子量。通过比较，可以得到瑞士乳杆菌发酵乳和未经发酵脱脂乳中，因为发酵所带来的差异较大的物质的分子量，从而选择这些质荷比的母离子通过二级质谱进行进一步的分析。如图1所示，分子量397.07Da，保留时间6.72分钟的物质在脱脂乳粗提物中含量较高(图1-A图谱中的峰)，而发酵乳中几乎没有。而分子量为232.lOTa，保留时间为
3.61min的物质在发酵乳和脱脂乳中的含量均比较高。因此，我们选择了在发酵乳中含量较高而在未经发酵的脱脂乳中含量较低的组分进行了差异比较，比较结果见表I。
表1:3000Da瑞士乳杆菌发酵乳粗提物与3000Da脱脂乳粗提物差异比较
权利要求
1.一种生物活性多肽，其氨基酸序列为LeU-Pro-LeU-Pix)。
2.权利要求1所述的生物活性多肽，其特征在于，所述生物活性多肽为乳源性。
3.编码权利要求1所述生物活性多肽的核苷酸片段。
4.权利要求3所述的核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段的序列如SEQID NO:2所示。
5.权利要求1-2任一权利要求所述生物活性多肽的制备方法，步骤如下: 1)发酵:将瑞士乳杆菌添加到脱脂乳中进行厌氧发酵，获得瑞士乳杆菌发酵乳； 2)多肽的粗提:对步骤I)的瑞士乳杆菌发酵乳进行低温离心分离，取上清液； 3)多肽的纯化: a.对步骤2)的上清液进行超滤处理，收集滤液； b.收集的滤液采用反向层析柱SOURSE5RPC ST进行反相高效液相色谱分离，收集生物活性多肽LPLP。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤I)所述厌氧发酵的条件为:发酵温度36 38°C，发酵时间15 20h。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤3)a所述超滤法所采用的滤膜的截留分子量分别为IOkDa和3kDa ;所述超滤过程中，压力范围为0.1 0.3MPa，滤液流速为.0.8 L 2mL/min。
8.权利要求1-2任一权利要求所述生物活性多肽在制备抗氧化和/或增强机体免疫力的食品、保健品及药物中的应用。
9.一种抗氧化药物，包含前述生物活性多肽LPLP或前述生物活性多肽LPLP的衍生物。
10.一种增强机体免疫力药物，包含前述生物活性多肽LPLP或前述生物活性多肽LPLP的衍生物。
全文摘要
本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种具有体外抗氧化活性和提高机体免疫力的乳源性生物活性多肽LPLP，其氨基酸序列为Leu-Pro-Leu-Pro。经过体外抗氧化实验、体外免疫功能促进实验，验证了多肽LPLP具有较好的抗氧化生物学活性和促进细胞免疫的活性一方面能够清除机体内的自由基，减少自由基对人体的伤害；另一方面，本发明的生物活性多肽LPLP还能够增强巨噬细胞的吞噬功能，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且不会引起机体的免疫排斥反应。对开发具有抗氧化功能及增强免疫功能的乳制品、保健品以及药物具有十分重要的意义。
文档编号A61K38/07GK103232526SQ20121053660
公开日2013年8月7日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者张少辉, 卢姗姗, 孙冠华, 马鎏镠, 周婕慧, 李锡安, 占东升 申请人:上海交通大学, 浙江熊猫乳品有限公司