专利名称：S100家族蛋白的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物医药技术领域的方法，具体是一种SlOO家族蛋白的应用。
背景技术：
肝纤维化(hepatic fibrosis)是肝脏在受到损伤后,细胞外基质在损伤处过度沉积的病理过程。大多数慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化，其病因大致可分为感染性(病毒性肝炎，寄生虫感染等)，化学毒物性(如酒精、对乙酰氨基酚、氨甲喋呤、过量维生素A等)，自身免疫反应(自身免疫性肝炎，原发性胆汁性肝硬化等)，先天性代谢缺陷(威尔逊氏病、血色病和各种贮积病等)，肥胖以及慢性炎症性疾病(如结节病)等。肝纤维化的长期积累，会最终导致肝硬化(hepatic cirrhosis)的发生，肝脏中肝小叶结构和血液循环途径逐渐被改建，肝脏慢慢变形、变硬，后期则出现不同程度的门静脉高压和肝脏功能紊乱、代谢功能受损，直至导致上消化道出血、肝腹水，甚至肝癌等并发症的发生，从而造成患者死亡。
肝硬化在人类主要死亡原因中居4-6位，是除几种癌症之外最易致死的疾病，患者在5年内的死亡率为50%。全世界每年死于肝硬化的人数超过了 50万，并有逐渐增加的趋势。在西方国家中，肝硬化患者多为酒精性肝病或者慢性丙型肝炎所致。在中国，由于慢性乙型肝炎病人达到了 2000万人，导致我国肝纤维化的发病率较高，而且其中近25% 30% 慢性乙肝病人可发展为肝硬化。越来越多的病人急需药物和肝移植的救治，因此对于肝纤维化以及肝硬化的治疗，是我国乃至全世界都急切需要解决的问题。但是目前在临床上还并没有太多有效的药物。
肝纤维化的形成一般长达十多年，是一个相当复杂的过程，它包括了肝实质细胞的坏死，肝星状细胞的激活，细胞外基质的沉积等过程。肝纤维化是一个复杂的生理过程， 受多种因素的影响，随着研究的深入，发现越来越多的信号通路和细胞因子参与到肝星状细胞的激活和调节肝纤维化的作用中。因此，肝纤维化是一个复杂的调控网络。
SlOO是最大的EF手型结构钙离子结合蛋白家族，已发现该家族有超过20个成员。SlOO蛋白家族都为酸性小分子量蛋白，分子量在10到12kDa之间，并且仅存在于脊椎动物中。通过对这些基因的序列进行比对，发现它们在物种间具有高度的同源性。此家族的蛋白在结构上由两个不同的EF手型结构所组成，这两个手型结构通过一个疏水的铰链区相连[Schafer B. ff. , Heizmann C. ff. Trends Biochem Sci, 1996 (4) :134-40. ]。SlOO 蛋白多以非共价键结合的二聚体形式存在，当SlOO蛋白与钙离子结合后，构象会发生变化， 暴露出蛋白内部的疏水区域，用于与其它蛋白相互结合[DempseyA. C. , Walsh M. P. , Shaw G. S. Structure, 2003 (7) :887-97.]。研究发现，SlOO蛋白家族在蛋白磷酸化，调节酶活性，维持钙离子平衡，细胞骨架动力学，细胞生长、迁移、分化和凋亡等生理活动中起重要作用[Donato R.1nt J Biochem Cell Biol, 2001(7) :637-68. ; Santamaria-Kisiel L.， Rintala-Dempsey A. C. , Shaw G. S. Biochem J, 2006 (2) :201-14.]。此外，还发现它们和人类的一些疾病相关联，如神经系统疾病，心肌症，癌发生和炎症等[Marenholz1,HeizmannC. ff. , Fritz G. Biochem Biophys Res Commun,2004(4) :1111-22.]。
近年来，越来越多的研究发现，许多SlOO家族成员能被分泌到细胞外，进入外周血液循环系统，发挥类似细胞因子的作用，包括S100A4、S100A6、S100A7、S100A8、S100A9、 S100A11、S100B、S100P等，而且这些成员的受体都是晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE) [Sparvero L. J. , Asafu-A djei D. , Kang R., et al.J Transl Med，2009 :17. ]。RAGE最初被鉴定为一系列蛋白及脂类的糖基化和氧化中间产物的受体，在炎症、肾衰竭、神经变性疾病和糖尿症中都发挥作用[Ramasamy R.， Vannucci S. J. , Yan S. S. , et al. Glycobiology, 2005 (7) :16R_28R·]。最近的研究发现， RAGE同样也作为SlOO家族成员的受体，通过与SlOO蛋白结合，从而激活细胞内的信号通路，调节细胞的增殖或者凋亡[LeclercE.，Fritz G.，Weibel M.，et al.J Biol Chem, 2007(43) :31317-31.]。
经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN101275951，
公开日2008_10_01， 记载了一种《鉴定肝纤维化及肝硬化的分子标记及其微阵列系统板》，该技术包括白蛋白； 丙氨酰(膜)氨肽酶；膜联蛋白A2;载脂蛋白F ;淀粉状蛋白β (Α4)前体蛋白；α2_糖蛋白1，锌结合；甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶；补体成分8，α肽；趋化因子(C-C基元)配基 19 ;补体因子H相关4 ;补体因子H相关5 ;胶原，I，α 2;胶原，III，α I;胶原，XVIII，α I ； 核心蛋白聚糖；皮肤桥蛋白；亚胺甲基转移酶环化脱氨酶；糖原合成酶2 ;凝溶胶蛋白；干扰素Y ;乳酸脱氢酶B ;内腔蛋白；中间α (球蛋白)抑制因子Hl ;血小板衍生生长因子受体，α肽；SlOO钙结合蛋白Α4;甲状腺素受体相关蛋白I;金属肽酶抑制因子I;以及肿瘤坏死因子；其中之一或者至少包括编码这些蛋白质的基因其中之一，在这些蛋白质或基因其中有8个为上调节基因，13个为下调节基因，9个为治疗标靶，该技术为具筛选能力的分子标记，以早期警告严重肝纤维化或肝硬化的发生，该分子标记也是做为对药物设计具潜力的标靶。但该技术仅公开了 S100A4在肝纤维化过程的表达上调，但并未给出任何工业应用。发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种SlOO家族蛋白的应用，为治疗肝纤维化提供了更多的作用靶点，以筛选肝纤维化治疗药物。
本发明是通过以下技术方案实现的
本发明涉及一种SlOO家族蛋白的应用，将SlOO家族蛋白作为药靶分子用于筛选肝纤维化治疗药物。
所述的SlOO 家族蛋白包括但不限于为 S100A4、S100A6、S100A7、S100A8、S100A9、 S100A11、S100B、S100P 等，优选为 S100A4、S100A6、S100A8、S100A9 或 S100A11 中之一；进一步优选为S100A6蛋白及其突变体，其功能性活性片段或其类似物。
所述的S100A6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的应用， 具体通过按照高通量药物筛选的方法和步骤，通过评价待筛选化合物拮抗SlOO家族蛋白生物活性，经过初筛、复筛、深入筛选、确定筛选等步骤，获得活性先导化合物。
本发明还涉及所述的sRAGE蛋白作为活性成分可以治疗肝纤维化疾病的方法，该方法包括给予患者有效剂量的上述sRAGE蛋白。
所述的有效剂量，即治疗量，是指足以产生疗效的量。有效量可分一或多次给药。 通常，有效量足以缓和、改善、稳定、减慢或延迟疾病的进一步发展。
所用的活性成分，其有效剂量可随给药模式和待治疗疾病的严重程度而变化。对大部分大型哺乳动物而言，每天施以有效成分的总剂量约为O. Ol-1OOOmgo通常，成人临床给药量的范围为O. 01-200mg/日，优选为O. 05-100mg/日。
所述的筛选肝纤维化治疗药物是指将经过饥饿培养的细胞中加入所述SlOO家族蛋白后，施加肝纤维化治疗药物并培养后根据细胞活力进行药物筛选，获得活性化合物。
所述的饥饿培养是指将细胞接种在96孔细胞板里，在无血清的条件下培养，诱导细胞凋亡。
所述的SlOO家族蛋白的用量为50μ gmL。
所述的施加肝纤维化治疗药物是指在加入SlOO家族蛋白的同时加入不同浓度的待筛选化合物并培养两天。
所述的细胞包括但不限于动物离体细胞细胞，优选为肿瘤细胞，进一步优选为神经母细胞瘤细胞。
本发明进一步涉及一种sRAGE蛋白在制备肝纤维化治疗药物中的用途。
所述的sRAGE蛋白，即可溶性RAGE (soluble RAGE, sRAGE)为RAGE (晚期糖基化终产物受体，receptor for advanced glycation end products)的胞外区，sRAGE 通过与外周系统中的RAGE配体相结合，导致这些配体无法与膜上的正常RAGE受体相结合，从而起到了阻断配体的刺激作用，sRAGE是体内RAGE配体的天然拮抗剂。
本发明的所述的sRAGE蛋白优选为hsRAGE及其突变体；其功能性活性片段或其类似物；具有高度同源性的同系物以及编码包含SEQ IDN0. 2描述的氨基酸序列的蛋白质的载体例如DNA载体(质粒或病毒)。功能性活性片段或类似物可通过添加、插入、修饰、取代或缺失以上所列的氨基酸序列中的一或多个氨基酸残基而形成。
所述的sRAGE蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
本发明涉及一种药物组合物，包含作为活性成分的上述sRAGE蛋白以及载体或赋形剂。
所述的药物组合物的剂型包括片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、口服液、醑剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、注射剂、注射用无菌粉末、栓剂等，优选为固态组合物，尤其是冻干粉针剂。
所述的载体是指用于将本发明的融合体蛋白传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。
另一方面，本发明公开了所述的sRAGE作为活性成分可以预防或治疗肝纤维化疾病的方法，该方法包括给予患者有效剂量的上述sRAGE 。
本发明首次发现S100家族蛋白与肝纤维化的发生有着紧密的联系，证明了过量的S100A6能加重肝纤维化，并以S100家族蛋白作为药靶分子在筛选肝纤维化治疗性蛋白 sRAGE，其能有效治疗肝纤维化，为肝纤维化的治疗提供了新的研究思路，也为治疗肝纤维化提供了新的候选药物筛选平台和候选药物。
本发明的药用组合物可根据熟知的及公认的制药生产要求的方法制备。药用组合物适宜包含本发明的蛋白质以及药学上可接受的载体，并适宜为单位剂量形式。本发明的 药用组合物可包含前药形式的本发明的蛋白质，该前药可在接受者宿主体内代谢转化成本 发明物的活性形式。本发明的药用组合物还可与其它疗法联合应用，如同时、序贯或分别应用。本发明 的药用组合物可包含有其它活性作用物。
图1为肝纤维化过程中S100家族成员的转录变化示意图。图2为肝纤维化造模后小鼠肝脏切片的Masson染色示意图。图3为肝纤维化形成及恢复过程中S100家族成员的转录变化示意图。图4为不同程度肝纤维化造模小鼠肝纤维化面积统计示意图。图5为不同程度肝纤维化造模小鼠肝脏中羟脯氨酸的含量示意图。图6为不同肝纤维化程度下S100家族成员的转录变化示意图。图7为免疫组织化学鉴定S100A6在肝纤维化过程中的表达和细胞定位示意图。图8为正常人肝脏组织和肝纤维化病人肝脏组织切片Masson染色和S100A6的免 疫组化示意图。图9为rhS100A6重组蛋白在小鼠肝纤维化过程中的作用实验肝脏组织切片 Masson染色示意图。图10为rhS100A6重组蛋白在小鼠肝纤维化过程中的作用实验的肝纤维化面积统 计示意图。图11为血清中层粘连蛋白的含量测定示意图。图12为肝脏中羟脯氨酸含量的测定示意图。图13为Coll a 1基因的转录变化示意图。图14为rhS100A6重组蛋白单独诱导小鼠肝纤维化的发生实验的Masson染色示 意图。图15为rhS100A6能提高原代肝星状细胞的细胞活力示意图。图16为流式细胞分析rhS100A6对原代肝星状细胞的细胞周期的影响示意图。图17为rhsRAGE蛋白生物活性的测定图18为rhsRAGE重组蛋白在小鼠肝纤维化过程中的作用实验肝脏组织切片 Masson染色示意图。图19为rhsRAGE重组蛋白在小鼠肝纤维化过程中的作用实验的肝纤维化面积统 计示意图。图20为肝脏中羟脯氨酸含量的测定示意图。图21为Collal and Col3 a 1基因的转录变化示意图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
一、动物模型的制备
1、小鼠肝纤维化形成及恢复模型
参照文献(AoyamaT. , Inokuchi S. , Brenner D. A. , Seki E. . CX3CL1-CX3CR1Interaction Prevents Carbon Tetrachloride-1nduced Liver Inflammation and fibrosis in mice. Hepatology，2010，52 (4) : 1390-400)建立小鼠动物模型，大致步骤如下
将雄性C57BL/6小鼠，按O. 5mL/kg体重的剂量腹腔注射CCl4，连续注射9周，每周两次，9周后停止注射，使小鼠开始自我恢复；分别在注射前CCl4，造模后6周，造模后9周， 停止注射后6周，停止注射后12周取6只小鼠，用苯巴比妥按10 μ L/g体重的剂量麻醉小鼠，通过眼球采集外周血后处死小鼠，获取肝脏组织；
2、不同程度小鼠肝纤维化模型
参照文献(AoyamaT. , Inokuchi S., Brenner D. A. , Seki E. . CX3CL1-CX3CR1Interaction Prevents Carbon Tetrachloride-1nduced Liver Inflammation and fibrosis in mice. Hepatology, 2010，52 (4) : 1390-400)建立小鼠动物模型，大致步骤如下
将雄性C57BL/6分为4组，每组6只。一组为对照组，另外三组为实验组。对实验组用腹腔分别注射高中低不同剂量的CCl4溶液，连续注射9周，每周两次；9周后，用苯巴比妥按10yL/g体重的剂量麻醉小鼠，通过眼球采集外周血后处死小鼠，获取肝脏组织；
二、原代肝星状细胞的制备和培养
参照文献(WeiskirchenR. ,Gressner A. M. .1solation and Culture of Hepatic Stellate Cells, Methods Mol Med，2005，117:99-113.)，分离纯化和培养小鼠原代肝星状细胞，大致步骤如下
向小鼠肝脏灌注IV型胶原酶，将肝脏消化成单个细胞，利用梯度离心将非实质细胞与肝实质细胞分离，再利用差速贴壁的方法，将肝星状细胞与其它非实质细胞分离，从而得到原代的小鼠肝星状细胞。
三、重组人S100A6蛋白的制备
参照文献(HeH, Yang T, Jia S, Zhang R, Tu P, Gao J, Yuan Y, Han ff, Yu Y. Expression and purification of bioactive high-purity human S100A6in Escherichia col1. Protein Expr Purif, 2012,83 (I) :98-103.)利用大肠杆菌原核表达系统来表达S100A6，纯化得到的重组rhS100A6蛋白，大致步骤如下
通过从H印G2细胞中得到人的S100A6基因插入到pET28质粒中，从而得到 hS100A6原核表达载体，再将构建好的质粒转化到大肠杆菌中，通 过IPTG诱导表达，再将大肠杆菌超声破碎，获得总蛋白液，接下来经过阴离子柱交换层析以及分子筛两步方法对蛋白进行纯化，最终得到的重组rhS100A6蛋白。
所述的H印G2细胞购自上海市岳阳路320号中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，用含20%的胎牛血清和10%的DMSO的DMEM培养液悬浮后保存在液氮中。
四、重组rhsRAGE蛋白的制备
参照文献(OstendorpT. , Weibel M. , Leclerc E. , et al. Biochem Biophys Res Commun, 2006 (I) :4_11)利用毕赤酵母真核表达系统来表达sRAGE，纯化得到的重组rhsRAGE蛋白，大致步骤如下
将人的sRAGE基因插入到pPICZ a A质粒中，从而得到hsRAGE酵母表达载体，再将构建好的质粒转化到酵母中，通过诱导表达，将培养上清中的蛋白采用阳离子柱交换层析以及分子筛两步方法对蛋白进行纯化，最终得到的重组rhsRAGE蛋白。
五、实验方法
1、肝脏组织切片制备以及Masson染色观察
按照常规方法进行肝脏组织切片制备以及Masson染色，同时Masson染色的肝脏组织切片通过对每个个体随机选取了 5飞个100倍视野，大约O. 3mm2的肝脏组织面积，利用NIS-Elements软件统计了其中的肝纤维化面积，计算出纤维化面积占肝脏面积的百分比。
2、肝脏组织中脯氨酸含量的测定
采用南京建成羟脯氨酸测试盒来测定小鼠肝脏组织中羟脯氨酸的含量，具体步骤按照试剂盒说明书进行操作。
3、定量 PCR
采用SYBR Premix ExTaq定量PCR试剂(TaKaRa公司)，分别检测肝脏组织中I型和III型胶原、小鼠SlOO和β -actin进行荧光定量PCR，引物如下，对应SeqIDNo. 3 SeqIDNo. 18。
小鼠sl00a4CAGCACTTCCTCTCTCTTGGTC
CCCTCTTTGCCTGAGTATTTGT
小鼠sl00a6CCAGACTGCGACACATTCCAT
TTGTCACCTTCCTTGCCAGAGT
小鼠sl00a8ATGCCCTCTACAAGAATGACT
AGATGCCACACCCACTTTTAT小鼠sl00a9CGACACCTTCCATCAATACTCTA
ATCAGCATCATACACTCCTCAAA
小鼠 SlOOallGCCACCGTCAGCCACAGTC
TTGTTTCCATCCTTCCCGCT
小鼠 β-actin AGCCTTCCTTCTTGGGTATG
GTGTTGGCATAGAGGTCTTTAC
小鼠colIalCAGACCTGTGTGTTCCCTACTCA
GGATAGCGACATCGGCGG
小鼠col3alGCGAGCGGCTGAGTTTTATG
TAGGACTGACCAAGGTGGCTG
4、S100A6 和 RAGE免疫组织化学染色
按照常规免疫组织化学方法，采用抗小鼠S100A6和RAGE分别检测肝脏组织中S100A6和 RAGE。
5、放射性免疫法检测血清中层粘连蛋白的含量
采用上海海研医学生物技术有限公司层粘连蛋白放射性免疫测试试剂盒来对小鼠血清中羟脯氨酸的含量进行测定，具体步骤按照试剂盒说明书的要求进行操作。
6、细胞周期检测
按照常规流式细胞方法，检测原代肝星状细胞的细胞周期。
7、细胞活力的检测
按照CCK-8法，检测原代肝星状细胞的细胞活力。实施例1
CC14诱导的小鼠肝纤维化模型基因芯片检测
CC14诱导的小鼠肝纤维化模型，通过连续9周给小鼠腹腔注射CC14，诱导肝纤维化的形成，然后分别采集了注射前，注射后6周、9周以及停止CC14注射后，肝脏开始自我恢复6周、12周的小鼠肝脏组织，通过基因芯片(Affymetrix公司)检测
结果
进行聚类分析，对整个过程中表达变化的基因进行分类。发现随着纤维化的发生约有254条基因的表达量呈明显增加的趋势，但到了恢复阶段，它们的表达量又恢复到了正常水平。在这些基因中，除了包括胶原蛋白，基质金属蛋白酶，炎症因子等与肝纤维化相关联的基因外，从中还发现了一类钙离子结合蛋白家族——SlOO蛋白家族，其很多成员都会随着肝纤维化的发生，出现基因表达量上调的情况(图1)。实施例2
肝纤维化过程中SlOO家族基因表达变化
2.1小鼠肝纤维化形成及恢复模型的SlOO家族基因表达变化
参照前面动物模型的步骤，制备小鼠肝纤维化形成及恢复模型，收集了包括注射前正常小鼠的肝脏样本，以及造模6周和9周的肝纤维化发病过程的肝脏样本，还有停止注射后让小鼠自我恢复6周和12周的肝脏样本，将这些肝脏组织做成石蜡切片，进行Masson 染色，验证肝纤维化的程度，如图2，通过Masson染色，细胞核被苏木精染成紫色，细胞质被丽春红染成红色，而纤维组织会被固绿染成绿色(图2中箭头所指部位)，从切片中可以看到，正常的肝脏组织很少有纤维化的存在(图2-A)。而在造模6周后，在肝脏中的中央静脉区开始出现纤维组织(图2-B)，造模9周后，纤维组织不断增多，并沿着中央静脉区向四周扩散(图2-C) 。停止CC14注射，让肝脏自我恢复6周后，发现纤维组织逐渐减少，仅集中在中央静脉区域(图2-D)。当恢复到12周时，肝脏中几乎没有纤维组织(图2-E)。从染色结果可以清楚地看到，所造模型符合小鼠肝纤维化的形成以及恢复整个过程。
采集不同时期的肝脏样本，通过定量PCR验证SlOO基因家族在肝纤维化的形成以及恢复过程的基因表达变化。选取了 SlOO家族中的五个成员——S100A4、S100A6、S100A8、 S100A9和S100A11作为定量PCR的目标基因。
结果如图3。由图中可以看到，随着肝纤维化的发生，S100A4、S100A6、S100A8、 S100A9和S100A11这5个基因的转录水平都发生了明显的升高，到第9周时达到最高值。 相比于正常肝脏，在第9周时，S100A4和S100A6均提高了 2倍多，S100A11提高了 3倍，而 S100A8和S100A9分别提高了 5倍和7倍。9周之后，随着肝纤维化的恢复，5个基因的转录水平表现出很快的下降趋势，到第15周时，其转录水平基本上与正常时的水平相当，仅 S100A4表达量仍高于正常肝脏，但也已经明显下降。到第21周时，5个基因的转录水平基本回到了正常水平。
以上的结果基本与前期基因芯片的结果相吻合，SlOO家族的基因转录水平都是随着肝纤维化的发生而提高，并随着肝脏自身的恢复，表达量又恢复到正常水平。
2. 2不同程度的小鼠肝纤维化模型的SlOO家族基因表达变化
参照前面动物模型的步骤，通过向小鼠腹腔注射不同剂量的CC14，获得不同程度的小鼠肝纤维化模型，将肝脏组织做成石蜡切片，进行Masson染色，验证肝纤维化的程度， 计算出纤维化面积占肝脏面积的百分比，如图4。注射O. 25mL/kg体重CC14剂量的小鼠肝脏，其纤维化占整个肝脏的3. 5%，注射O. 5mL/kg体重CC14剂量的小鼠肝脏，其纤维化占整个肝脏的6%，而注射lmL/kg体重CC14剂量的小鼠肝脏，其纤维化占到了整个肝脏的8%左右。
羟脯氨酸是合成胶原纤维的必需氨基酸，所以羟脯氨酸的含量能反应纤维合成的速度，在一定程度上表明肝纤维化的程度。因此，采用羟脯氨酸检测试剂盒对肝脏中的羟脯氨酸进行了测定，发现随着CC14注射剂量的增加，肝脏内羟脯氨酸的含量也随之升高，注射lmL/kg体重CC14剂量时，肝脏内羟脯氨酸的含量能达到O. 5μ g/mg湿重，接近正常肝脏的2倍(图5)。
在建立了 3种不同程度的小鼠肝纤维化模型之后，选取了 SlOO家族中的五个成员-S100A4、S100A6、S100A8、S100A9和S100A11作为定量PCR的目标基因，研究了在不同肝纤维化程度下，这些基因相对于对照组表达量的变化情况，结果如图6，从定量PCR的结果可以看出，S100A4、S100A6、S100A8、S100A9和S100A11这5个基因的转录水平，都是随着纤维化程度的加深而升高的。在O. 25mL/kg的CC14剂量下，5个基因相对于正常小鼠， 其转录水平的提高程度不是很明显，仅仅提高了不到I倍的水平。而在O. 5mL/kg的CC14 剂量下，5个基因的表达都有很大幅度的提高，提高水平在3-5倍之间。在lmL/kg的CC14 剂量下，5个基因的表达水平均为4组中最大的。相比于正常小鼠，310(^4提高了3.5倍， S100A6提高了 3. 3倍，S100A11提高了 4倍，S100A8提高了 7倍，而S100A9提高得最多，提高了 8倍。
2. 3S100A6在肝脏中表达细胞的定位
在确定了 SlOO家族基因的表达与肝纤维化具有相关性之后，通过免疫组织化学染色来鉴定肝脏中SlOO家族蛋白表达的定位。选取了 SlOO家族中的S100A6蛋白作为研究对象，对正常小鼠和纤维化小鼠的肝脏进行免疫组织化学染色。通过染色，表达S100A6 的细胞会表现出深褐色，因此，如图7，发现，相比于正常小鼠(图7-A和C)，纤维化小鼠肝脏中S100A6的表达量更显著(图7-B和D)，这与定量PCR发现肝纤维化时期S100A6的表达高于正常小鼠相一致。另外，观察发现S100A6的表达位置都集中在血管周围发生纤维化的部位，并且存在于非实质细胞中(图7-B和D，箭头所指部位)，而在肝实质细胞中的表达却不明显。
2. 4肝纤维化病人的肝脏中S100A6免疫组织化学
从上海市第六人民医院获得了人的肝脏组织切片，包括了正常的肝组织(图8-A) 以及肝纤维化的组织，通过Masson染色，可以看到患 有肝纤维化的肝脏中已经有大量的纤维组织(图8-B)，证实病人已经进入肝硬化早期。通过对S100A6进行免疫组化，发现在正常的肝脏中，S100A6表达量同样保持在很低的水平(图8-C和E)，而在肝硬化早期的肝脏中， S100A6在血管区的纤维部位存在着大量表达(图8-D和F，如图中箭头所示)，而且也集中在非实质细胞中，结果与采用CC14诱导的小鼠肝纤维化模型相一致，从而也说明了 CC14诱导的小鼠肝纤维化模型能较好的反映肝纤维化临床的表现。
分别从肝纤维化的发病过程以及肝纤维化的严重程度两个方面研究了 SlOO家族成员的转录变化，发现随着肝纤维化的发生，Sioo家族成员的表达量显著提高，而肝纤维化恢复时，SlOO的表达量又回到了正常水平。另外，SlOO家族成员的表达量还与肝纤维化的严重程度成正相关，即肝纤维化越严重，其表达量越高。由此说明了 Sioo家族成员与肝纤维化的发生有着重要的关系。
采用的是CC14诱导的小鼠肝纤维化模型，由于考虑其可能与肝纤维化临床的发病机理存在着差异，因此通过免疫组化对人的肝脏切片进行研究比较，发现在肝硬化的早期，S100A6的表达量要显著的高于正常肝脏，其结果与的CC14诱导的小鼠肝纤维化模型相一致，因此也表明了 CC14诱导的小鼠肝纤维化模型能较好的反映肝纤维化临床的发病机理。
由于SlOO家族的基因是以簇状排列在基因组中的，其转录调控的机理也较为相似，因此除了 S100A6，SlOO其它家族的成员也很可能在非实质细胞中表达。而肝星状细胞更是直接与肝纤维化相关联，因此预测SlOO家族的蛋白很可能直接作用于肝星状细胞上。实施例3
S100A6在肝纤维化过程中的作用研究
3. lrhS100A6重组蛋白的肝纤维化动物实验
小鼠肝纤维化模型与蛋白给药方法
将雄性C57BL/6小鼠腹腔注射lmL/kg体重剂量的CC14溶液，连续注射11周，每周注射两次，从第9周开始将小鼠分为两组，一组为对照组，另一组为实验组，实验组的小鼠皮下注射O. 5mg/kg体重的rhS100A6,对照组注射相同体积的PBS,每天注射一次,连续三周；11周结束后采集外周血并获取肝脏组织进行后续测试；
结果显示
通过肝脏组织的石蜡切片进行Masson染色来分析肝纤维化的程度，另外，还对血清中的层粘连蛋白含量，肝组织中羟脯氨酸含量，以及肝组织中I型胶原的表达量等几个反映肝纤维化的指标来对实验后的小鼠肝纤维化程度进行评定。通过对肝脏组织的石蜡切片进行Masson染色，发现相对于正常的肝脏组织，对照组和实验组都出现了比较明显的肝纤维化，如图9。对照组中，纤维化都集中于中央静脉区，部分中央静脉之间形成了纤维桥接(图9-A和B)。相比于对照组，注射rhS100A6的小鼠，其纤维化程度要更加严重，中央静脉区纤维化区域更厚(图9-C和D，图中箭头所指部位)，而且中央静脉之间几乎都形成了纤维桥接，甚至在汇管区也出现了纤维化。利用NIS-Elements软件统计了其中的肝纤维化面积，计算出纤维化面积占肝脏面积的百分比，如图所示，对照组的肝纤维面积占肝脏组织面积的10%，而实验组的肝纤维化面积达到了 16%，两者具有显著的差异(p〈0. 001 )，如图10。
然后，采用放射性免疫试剂盒检测了正常小鼠，注射PBS小鼠以及注射rhS100A6 小鼠这三组的血清中层粘连蛋白的含量。层粘连蛋白作为细胞外基质，在肝纤维化过程中会大量表达，其表达量的多少能反映出纤维化的程度。经过检测发现注射了 rhS100A6的小鼠血清中的层粘连蛋白的含量为36. 9ngmL，高于对照组的24. 7ngmL(p<0. 05)，如图11。因此从血清中层粘连蛋白含量这一指标来看，注射了 rhS100A6的小鼠其肝纤维化程度要高于对照组的小鼠。
如图12，发现对照组的小鼠肝脏内羟脯氨酸的含量为O. 5 μ g/mg湿重，而注射rhS100A6的小鼠肝脏内羟脯氨酸的含量能达到O. 7 μ g/mg湿重，比对照组高出40% (p〈0. 001)，说明注射rhS100A6的小鼠肝脏内羟脯氨酸的合成明显增多，也从一个侧面反映了胶原合成的增多，纤维化更严重。
通过定量PCR，发现相比于正常的肝脏组织，PBS组的小鼠肝脏中Coll α I基因的表达量提高了 10倍左右，而注射rhS100A6的小鼠肝脏中Coll α I基因的表达量提高了超过16倍，如图13，说明其Colla I的合成远多于对照组(ρ〈0. 05)，也表明了其纤维化比对照组小鼠要严重。
从上面的实验可以总结得出，通过对CC14肝纤维化造模的小鼠注射rhS100A6重组蛋白，会显著加重肝纤维化的程度。
3. 2rhS100A6单独诱导小鼠肝纤维化发生的动物实验
雄性C57BL/6小鼠分为两组，实验组小鼠皮下注射O. 5mg/kg体重的S100A6，对照组注射相同体积的PBS，每天注射一次，连续三周；3周结束后，采集外周血并获取肝脏组织进行后续测试。
结果
三周后，将小鼠的肝脏组织石蜡切片进行Masson染色，如图14，发现无论是注射 PBS，还是rhS100A6，小鼠的肝脏并没有出现显著的肝纤维化，也没有出现大量肝实质细胞的坏死。由此说明了 S100A6不能单独诱导肝纤维化的发生，也并不能独立地激活肝星状细胞。结合之前CC14诱导的肝纤维化实验中，S100A6对肝纤维化的加剧作用，表明S100A6很可能不是作用于肝星状细胞激活的第一个阶段，而可能是在第二个阶段发挥作用，即维持肝星状细胞的增殖。实施例4
S100A6对原代肝星状细胞的作用
4. 1S100A6对原代肝星状细胞的 细胞活力的影响
I)将原代肝星状细胞接种在RPMI1640培养液(含10%FBS)中，分于96孔板，每孔 200 μ L, 5,000 个 / 孔；
2)培养24小时后，换含1%FBS的RPMI1640培养液培养24h ；
3)换含有不同浓度的S100A6的无血清RPMI1640培养液中，培养48h，对照加入等量的PBS ；
4)小心吸去上清，加入90 μ L新鲜RPMI1640培养液，再加入10 μ L CCK-8溶液，继续培养4h ；
5)同时设置调零孔，每组设定6个复孔；
6)每半个小时在酶联免疫检测仪450nm处测量各孔的吸光值；
7)相对细胞活力的计算相对细胞话J) =* 100%,
结果将分离纯化得到的原代肝星状细胞培养在96孔细胞板中，在饥饿状态下， 加入不同浓度的rhS100A6，培养两天后用CCK-8试剂检测细胞的活力，如图15，发现在O.3 μ g/mL是rhS100A6对原代肝星状细胞几乎无影响，但是随着rhS100A6剂量的增加，原代肝星状细胞的活力也明显增加，当rhS100A6浓度为I μ g/mL时，细胞活力提高了 20%，当 rhS100A6浓度提高到10 μ g/mL时，细胞活力提高了 80%，而当rhS100A6浓度在50 μ g/mL以上时，细胞活力提高了将近100%。由此可以看出，在体外，148/1^的1^10(^6就可以显著提高肝星状细胞的细胞活力，并随着rhS100A6剂量的升高而提高，直至50 μ g/mL时达到饱和。
4. 2S100A6对原代肝星状细胞的细胞周期的调控
I)将原代肝星状细胞培养在6cm培养皿中；
2)培养24h后，换含1%FBS的RPMI1640培养液培养24小时；
3)换含有5 μ M S100A6的1%或3%FBS的RPMI1640培养液中，培养48小时，对照加入等量的PBS ；
4)用胰酶将原代肝星状细胞消化下来，I，000rpm离心5min，去上清；
5)加 PBS 洗一次，I, OOOrpm 离心 5min,去上清；
6)用3mL PBS将细胞悬浮，逐滴加入到_20°C C预冷的7mL无水乙醇中，使乙醇终浓度为70%，放入-20°C C冰箱过夜，使细胞充分固定；
7)过夜后，I, OOOrpm离心5min,去上清；
8)加入PI染色液，室温避光处理30min ；
9)用 PBS 洗一次，I, OOOrpm 离心 5min,去上清；
10)加入500 μ L PBS，充分悬浮细胞，转入到流式管中，进行流式分析。
结果通过流式细胞仪对细胞的周期进行分析，发现在1%FBS培养条件下，对照组 Gl期的细胞数量占88. 4%，多于培养液中加入rhS100A6蛋白的细胞的83. 9%。对照组S期的细胞数量占8. 6%，G2期数量只有3%，而培养液中加入rhS100A6蛋白的细胞(图·16-A)， S期数量占8. 9%，G2期更是数量增加到7. 2% (图16B)，对比S期和M期细胞的数量，说明 rhS100A6能促进DNA合成和细胞增殖。在3%FBS培养条件下，对照组Gl期的细胞数量占 75. 1%，同样多于培养液中加入rhS100A6蛋白的细胞的70. 5%，对照组S期的细胞数量占 18.4%，G2期数量为6.5% (图16C)，而培养液中加入rhS100A6蛋白的细胞，其S期数量为8.8%，相比对照组要少，但是G2期数量却增加到了 20. 7% (图16D)。由此可以得出，在没有外界的刺激下，1%FBS培养条件下，对照组的细胞较多的处于Gl期，很少进行DNA合成。而在3%FBS培养条件下，对照组的细胞虽有部分进行DNA合成，但大多都处于S期。而培养液中加入rhS100A6，不仅能刺激细胞从Gl期进入到S期，还能从S期进入G2期，因此说明 S100A6具有加快肝星状细胞的细胞周期的作用。(图16流式细胞分析rhS100A6对原代肝星状细胞的细胞周期的影响。1%FBS条件下加入PBS (A)或rhS100A6 (B)，3%FBS条件下加入 PBS (C)或 rhS100A6 (D))。实施例5
SlOO家族蛋白活性抑制剂的筛选
已知SlOO家族蛋白通过结合到表达RAGE受体的细胞，从而诱发细胞内的信号通路，而sRAGE是体内RAGE配体的天然拮抗剂。在前面的实验中发现SlOO家族与肝纤维化的发生有着明显的相关性，通过S100A6的动物实验也证明了 S100A6能刺激肝星状细胞的增殖，导致肝纤维化的加重。因此，计划采用sRAGE作为体内RAGE的天然的拮抗剂这一特性，来拮抗S100A6的对于RAGE的激活作用。另外，SlOO家族其它成员也是以RAGE为受体， 同样很可能在肝纤维化过程通过RAGE来刺激肝星状细胞，因次通过sRAGE能起到多方面的拮抗作用。由于人和小鼠的SlOO家族蛋白的相似度在85%以上，sRAGE的相似度为80%，而人和小鼠在RAGE其它配体的相似度上却比较低，因此选择采用人的sRAGE作为小鼠肝纤维化治疗的药物，第一，人的sRAGE同样与有着高相似度的小鼠SlOO家族蛋白有较高的亲和性，第二，可以避免人的sRAGE与小鼠RAGE其它配体的结合，避免产生更多的干扰。
将SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞)接种在96孔细胞板里，在无血清的条件下，对细胞进行饥饿培养，诱导细胞凋亡，在加入50 μ g/mL rhS100A6的基础上，同时加入不同浓度的rhsRAGE，培养两天后，用CCK-8试剂盒对细胞活力进行测定。
结果发现10μ g/mL rhsRAGE都能显著抑制rhS100A6促进细胞凋亡的作用，而且相比于PBS对照，细胞的活力还有显著的提高，如图17。在浓度达到50 μ g/mL时，相比对照都能将细胞活力提高80%。
所述的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞购自上海市岳阳路320号中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，用含20%的胎牛血清和10%的DMSO的RPMI1640培养液悬浮后保存在液氣中。实施例6
sRAGE治疗肝纤维化的作用
通过腹腔注射CC14，连续11周，诱导小鼠的肝纤维化，从第9周开始将小鼠分为 5组,每组10只,其中4组为实验组,每天皮下分别注射O. 5mg/kg体重和1. 5mg/kg体重的 rhsRAGE，连续注射3周。另外一组为对照组，每天皮下注射相同体积的PBS。实验结束后， 获取5组小鼠的肝脏组织和血清。通过采用肝脏组织的石蜡切片进行Masson染色来分析肝纤维化的程度，另外，还检测了肝组织中羟脯氨酸含量，以及肝组织中I型胶原，III型胶原的表达量等几个反映肝纤维化的指标，对实验后的小鼠肝纤维化程度进行了评定。
结果通过对肝脏组织的石蜡切片进行Masson染色，如图18，发现对照组小鼠的肝脏在中央静脉区形成了比较明显的肝纤维化，中央静脉之间形成了纤维桥接(图18A和 B)。注射rhsRAGE的小鼠，在O. 5mg/kg体重剂量时，与对照小鼠没有显著的差异(图18C和 D)，而在1. 5mg/kg体重剂量时，发现其纤维化程度有一定程度的减轻，在中央静脉区的纤维组织区域相对较小，侵入到组织中的纤维也较少(图18E和F)。利用NIS-Elements软件统计了其中的肝纤维化面积，计算出纤维化面积占肝脏面积的百分比，如图19所示，对照组的肝纤维面积占肝脏组织面积的9. 6%，注射O. 5mg/kg体重的rhsRAGE的小鼠，其纤维化面积占肝脏面积的7. 8%，虽然比对照略有降低，但同样在统计学上没有显著差异。而注射1.5mg/kg体重的rhsRAGE的小鼠,其纤维化面积占肝脏面积的7. 1%,相比对照组下降了约 25%,通过统计学检验,与对照组小鼠存在显著的差 异(p〈0. 01),从而说明1. 5mg/kg体重的 rhsRAGE能显著地减轻肝纤维化。
再利用羟脯氨酸检测试剂盒对肝脏中的羟脯氨酸进行了测定，如图20，发现对照组的小鼠肝脏内轻脯氨酸的含量为O. 4 μ g/mg湿重,而注射O. 5mg/kg体重的和1. 5mg/kg 体重的rhsRAGE的小鼠肝脏内羟脯氨酸的含量分别为O. 30和O. 29 μ g/mg湿重，在统计学上与对照组相比均有显著的差异，说明注射了 rhsRAGE的小鼠肝脏内羟脯氨酸的合成明显减少，也从一个侧面反映了胶原合成的减少，表明其肝纤维化程度相比对照组要轻。
又采用定量PCR的方法检测了肝脏组织中I型胶原Colla I和III型胶原Col3a I 两个基因的表达量变化。如图21，发现相比于对照组，注射1. 5mg/kg体重剂量的rhsRAGE 小鼠其肝脏中Coll a I和Col3 a I两个基因相比对照组都有明显的下降，Coll a I基因的表达量下降了 55%，Col3a I基因的表达量下降了 40%，因此说明了注射1. 5mg/kg体重剂量的rhsRAGE能显著降低肝脏中I型和III型胶原的表达量。
从以上的实验可以看出，通过对CC14造模的肝纤维化小鼠注射rhsRAGE重组蛋白，来拮抗小鼠体内的RAGE配体，特别是SlOO家族蛋白，发现r rhsRAGE2却具有明显降低小鼠肝纤维化的疗效，尤其当rhsRAGE的剂量达到1. 5mg/kg体重时，能显著减轻小鼠肝纤维化的程度。
上述实施例中部分技术操作信息为本领域技术人员的常规认知，实践者可参看有关细胞生物学、组织结构学以及胚胎学的标准的教科书及评论。包括Teratocarcinomas and embryonic stem cell A practical approach[E. J. Robertson 编，IRL 出版有限公司，1987] ；Guide to techniques in 小鼠 Development [P. M. Wasserman 等编，学术出版社，1993] ；Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro [Μ. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225 900,1993] !Properties and uses of Embryonic Stem Cells Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy[P. D. Rathjen等，Reprod. Fertil. Dev. 10 31,1998]。
细胞生物学、蛋白质化学、和抗体技术可以在“蛋白科学中的当前方案” [J. E. Colligan等编辑，ffiley&Sons]、“细胞生物学中的当前方案” [J. S. Bonifacino等， ffiley&Sons]和“兔疫学功时当亦方案” [J. E. Colligan等编辑，ffiley&Sons]中找到。与本发明相关的试剂、克隆载体、和基因操作试剂盒可从商业供应商那得到，例如BioRad、 Stratagene> Invitrogen、ClonTech 以及 sigma-AIdrich 公司。
细胞培养方法通常在“动物细胞培养基本技术手册”最新版本(R.1. Freshney编辑，Wiley&Sons); “细胞培养一般技术”(M. A. Harrison和1. F. Rae，剑桥大学出版);和“胚胎干细胞方法和操作规定” (K. Turksen编辑，Humana出版)中有描 述。组织培养基和试剂可从商业供应商那得到，例如 Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma Chemical Co.、以及 ICN Biomedicals。
权利要求
1.一种SlOO家族蛋白的应用，其特征在于，将SlOO家族蛋白作为药靶分子用于筛选肝纤维化治疗药物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述的SlOO家族蛋白包括S100A4、S100A6、 S100A7、S100A8、S100A9、S100A11、S100B、S100P。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述的SlOO家族蛋白为S100A4、S100A6、 S100A8、S100A9 或 S100A11 中之一。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述的SlOO家族蛋白为S100A6蛋白及其突变体，其功能性活性片段或其类似物。
5.根据权利要求2或3或4所述的应用，其特征是，所述的S100A6蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述的筛选肝纤维化治疗药物是指将经过饥饿培养的细胞中加入所述Sioo家族蛋白后，施加肝纤维化治疗药物并培养后根据细胞活力进行药物筛选，获得活性化合物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征是，所述的饥饿培养是指将细胞接种在96孔细胞板里，在无血清的条件下培养，诱导细胞凋亡。
8.根据权利要求1或6所述的应用，其特征是，所述的SlOO家族蛋白的用量为50μ g/mL
9.根据权利要求6所述的应用，其特征是，所述的施加肝纤维化治疗药物是指在加入 SlOO家族蛋白的同时加入不同浓度的待筛选化合物并培养两天。
10.一种sRAGE蛋白的应用，其特征在于，用于制备肝纤维化治疗药物。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征是，所述的sRAGE蛋白，即可溶性晚期糖基化终产物受体的胞外区，sRAGE通过与外周系统中的RAGE配体相结合，导致这些配体无法与膜上的正常RAGE受体相结合，从而起到了阻断配体的刺激作用。
12.根据权利要求10或11所述的应用，其特征是，所述的sRAGE蛋白是指hsRAGE及其突变体；其功能性活性片段或其类似物；具有高度同源性的同系物以及编码包含SEQ ID NO. 2描述的氨基酸序列的蛋白质的载体。
13.根据权利要求10或11所述的应用，其特征是，所述的sRAGE蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
14.一种药物组合物，其特征在于，包含作为活性成分的，如权利要求13-17中任一所述的sRAGE蛋白以及载体或赋形剂。
15.根据权利要求14所述的组合物，其特征是，所述的药物组合物的剂型包括片剂、 胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、口服液、醑剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、注射剂、注射用无菌粉末或栓剂。
16.根据权利要求14所述的组合物，其特征是，所述的药物组合物的剂型为固态组合物。
17.根据权利要求14所述的组合物，其特征是，所述的药物组合物的剂型为冻干粉针剂。
18.根据权利要求14所述的组合物，其特征是，所述的载体是指用于将本发明的融合体蛋白传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。
全文摘要
一种生物医药技术领域的S100家族蛋白的应用，将S100家族蛋白作为药靶分子用于筛选肝纤维化治疗药物；具体通过按照高通量药物筛选的方法和步骤，通过评价待筛选化合物拮抗S100家族蛋白生物活性，经过初筛、复筛、深入筛选、确定筛选等步骤，获得活性先导化合物。本发明为治疗肝纤维化提供了更多的作用靶点，以筛选肝纤维化治疗药物。
文档编号A61K38/17GK103031359SQ201210579728
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者俞雁, 韩伟, 何虹霖 申请人:上海交通大学