感染性戊型肝炎病毒基因型3的重组体的制造方法与工艺

感染性戊型肝炎病毒基因型3的重组体相关申请的交叉引用本申请要求于2011年11月1日提交的美国临时申请第61/554,323号和于2011年1月10日提交的美国临时申请第61/431,377号的权益，所述申请各自在此通过引用并入本文用于所有目的。对作为ASCII文本文件提交的序列表的参考载入文件77867-827343_SEQLIST.TXT中的序列表，创建于2012年1月10日，其为62,887个字节，机器格式IBM-PC，MS-Windows操作系统，其全部内容通过引用并入本文中用于所有目的。发明背景由于在发展中国家引起急性肝炎的流行病和散发性病例，戊型肝炎病毒臭名昭著：实例包括，1956年新德里爆发期间出现了29300名病例以及在达尔富尔的国内难民营(InternallyDisplacedPersonsCamp)6个月内报道了2621名病例，其中如已报道的(1)，孕妇具有26-31％的最高死亡率(2)。HEV是发展中国家成年人急性肝炎的最重要或第二重要的原因。但与近期的教条相反，该病毒并不局限于发展中国家，并且随着对感染传播潜能的认识以及针对该病毒进行的测试，散发性病例在工业化国家中正在越来越多的得到确认。从历史上看，戊型肝炎被描述为经肠传播的，不会发展为慢性病的自身限制性肝炎(3)。然而，最近在欧洲鉴定出首例慢性戊型肝炎，并且慢性病自此被证明发生在免疫功能低下的实体器官移植接受者和HIV感染个体中(4,5,6,7)。虽然戊型肝炎感染通常会导致轻度至中度的疾病，但偶尔在急性病例中，在慢性感染患者以及尤其在患有慢性肝病或怀孕的那些患者中，引起暴发性肝功能衰竭(1,2,4,5,6,7,8)。此外，戊型肝炎一直被误诊为药物诱导的肝损伤，从而使药物试验或治疗方案复杂化(9)。自1983年发现以来，已记录的HEV传播几乎无一例外地与被污染的水联系在一起；在摄入未煮熟的鹿肉后，HEV感染的发现突然改变了(10,11)。戊型肝炎目前被认为不仅是发展中国家的水源性疾病，而且是工业化国家涌现的食源性疾病(11,12)。HEV为具有7.2kb的基因组大小的小的非包膜、单链RNA病毒(3)。HEV的7.2kb基因组是具有三个重叠的阅读框(ORF)的单链的正义RNA。约前5kb用作ORF1多蛋白的mRNA；所述多蛋白是否经蛋白水解加工仍是未知的。ORF1包含编码甲基转移酶/尿苷转移酶、NTP酶/解旋酶、RNA依赖的RNA聚合酶和泛素化活性的区域。此外，ORF1编码Y区和X，或未知功能的大区以及位于ORF中间附近的高变区(HVR)。HVR的长度和序列在毒株和基因型之间不同：其耐受小的缺失，但复制水平在细胞培养物中严重被揭制。ORF2和ORF3从单一的双顺反子亚基因组RNA翻译，以分别产生660个氨基酸的衣壳蛋白和113-114个氨基酸的蛋白。所述ORF3蛋白对病毒颗粒从培养细胞中的有效释放是重要的，并为猕猴感染所必需的。至目前为止，已识别了感染人的四种HEV基因型(17)。基因型1和2感染只在人中被鉴定，而基因型3和4的病毒已从除人之外的猪、鹿、猫鼬、牛和兔中分离出来(18)。基因型3和4在猪中广泛存在，并且未煮熟的猪肉可为动物源性人感染的主要来源(12，18)。然而，跨物种传播还未被广泛研究并且很可能存在另外的人畜共患性储库。HEV感染长期被认为是持续2-7周的急性感染，并且不会发展成慢性病。然而，最近，慢性HEV感染已在免疫抑制的器官移植患者或艾滋病患者中被鉴定出来。更出乎意料的是，这些慢性病患者者中的一些已发展出神经系统症状并从脑脊液中分离出HEV。这些慢性病例已被鉴定为基因型3感染。HEV通常在体内复制至低滴度，其极难在培养的细胞中生长，并且大部分病毒的生命周期是未知的。Okamoto及其同事们最近使基因型3和基因型4毒株适合在两种人细胞系，即A549肺细胞和PLC/PRF/5肝癌细胞中复制至高滴度(19,20)。远未了解戊型肝炎的流行病学，特别是人畜共患方面需要进一步研究。因此，有必要开发可在细胞培养物中复制的HEV基因型毒株。另外，有开发HEV疫苗，例如，用于基因型3毒株的疫苗的必要。本发明部分涉及分离自慢性感染患者的基因型3病毒的发现(5)，其适合在人肝癌细胞中生长，并用于鉴定允许HEV感染的一组人、猪和鹿细胞培养物。本发明另外涉及所述适应病毒的特征以鉴定提供在细胞培养物中复制能力的序列变化。发明简述如以上所解释的，直至最近，戊型肝炎很少在工业化国家中被鉴定出来。戊型肝炎如今逐渐在整个西欧、一些东欧国家和日本被报道：这些病例大部分是由基因型3所致，该基因型在猪中是特有的，并且这些病例被认为是经动物传染获得的。然而，未能很好地了解传播途径。将感染人的HEV分为非动物源性(1型，2型)基因型和动物源性(3型，4型)基因型。HEV的细胞培养是低效且受限的，因此迄今为止，HEV仅在人细胞系中培养。本发明部分涉及对HEV基因型3病毒的新毒株的鉴定。HEV的Kernow-C1毒株(基因型3)，其分离自慢性感染患者，用于鉴定允许感染的人、猪和鹿的细胞系。所述Kernow-C1毒株对在人肝癌细胞中生长的适应情况选择了包含人核糖体蛋白基因的174个核糖核苷酸(58个氨基酸)的插入和其它突变的罕见病毒重组体。在本发明的上下文中，在论述实施例部分中所述的实验中鉴定的174个核糖核苷酸的插入方面，Kernow病毒基因组中的插入片段包含171个核糖核苷酸，其本身仅编码57个氨基酸。然而，由于其插入密码子内的核糖核苷酸之间，其插入导致了58个新的氨基酸。因此，在此该插入被称作具有174个核糖核苷酸并编码58个氨基酸。因此，在一些实施方案中，本发明涉及cDNA克隆以开发将所需序列插入HEV而不会灭活该病毒的载体平台。在一些实施方案中，本发明提供了基因型3戊型肝炎病毒的野生型毒株及其细胞培养适应的子代。在一些实施方案中，本发明提供了包含本文所述的基因型3戊型肝炎病毒的野生型毒株序列的载体。在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的复制型基因型3戊型肝炎病毒、或来源于如本文所述的复制型基因型3戊型肝炎病毒的嵌合病毒或减毒病毒、以及例如可用于研究戊型肝炎的人畜传播和用于HEV疫苗和免疫原性组合物的开发的细胞培养系统的感染性cDNA克隆。在一些实施方案中，本发明涉及HEV疫苗，其包含来自本文所述的基因型3戊型肝炎病毒的序列及其减毒病毒衍生物。在一方面，本发明涉及感染性戊型肝炎病毒(HEV)cDNA克隆，其中所述cDNA克隆与SEQIDNO:l有至少95％的序列一致性，并且如参考SEQIDNO:5的HEV核苷酸序列所确定的在ORFl中包含插入片段。在一些实施方案中，所述HEVcDNA克隆包含SEQIDNO:l的核酸序列。在一些实施方案中，所述HEVcDNA克隆在ORFl序列中有插入片段，该插入片段编码长度为20-100个氨基酸的符合读框的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述插入片段编码长度为30、35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述ORF1中的插入片段与SEQIDNO:9有至少50％的一致性，或至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的一致性。在一些实施方案中，所述ORF1中的插入片段与SEQIDNO:9有至少90％的一致性，或至少95％、至少96％、至少97％或至少98％的一致性。在一些实施方案中，所述插入片段包含SEQIDNO:9所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述插入片段在HEV的ORF1-编码区内的位置，其中所述插入片段的第一氨基酸序列相对于SEQIDNO:6所示的氨基酸序列为氨基酸750。在另一方面，本发明涉及包含戊型肝炎病毒(HEV)核酸序列的感染性cDNA克隆，其中所述克隆在编码ORF1的高变区的核酸序列区域中包含插入片段。在一些实施方案中，所述HEVcDNA克隆在ORF1序列中有插入片段，其中所述插入片段编码长度为20-100个氨基酸的符合读框的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述插入片段编码长度为30、35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述ORF1中的插入片段与SEQIDNO:9有至少50％的一致性，或至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的一致性。在一些实施方案中，所述ORF1中的插入片段与SEQIDNO:9有至少90％的一致性，或至少95％、至少96％、至少97％或至少98％的一致性。在一些实施方案中，所述插入片段包含SEQIDNO:9所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述插入片段在ORF1的高变区中，例如所述插入片段正好在第749位之后，使得插入氨基酸序列起始于第750位，如参考SEQIDNO:6所确定的。在一些实施方案中，所述感染性cDNA克隆为基因型3HEV。在一些实施方案中，所述cDNA克隆为基因型1HEV。在一些实施方案中，所述感染性cDNA克隆为基因型2或基因型4克隆。在又一方面，本发明涉及包含细胞的细胞培养系统，所述细胞包含例如如之前两段中所述的、本发明的感染性cDNA克隆中任一种cDNA克隆的RNA转录物。在另一方面，本发明涉及产生疫苗的方法，所述方法包括将来自本发明的cDNA克隆，例如上述cDNA克隆的RNA转录物引入细胞系(例如人细胞系或猪细胞系)中，并得到由所述cDNA克隆产生的病毒。在又一方面，本发明提供了由如本文所述的感染性HEV克隆产生的病毒以及包含此类病毒的药物组合物。在一方面，本发明涉及产生疫苗的方法，所述方法包括将包含与启动子可操作地连接的编码具有SEQIDNO:4或SEQIDNO:8所示序列的ORF2的异源核酸序列的表达盒引入宿主细胞中；并得到ORF2蛋白。在又一方面，本发明涉及产生疫苗的方法，所述方法包括将获自基因型3HEV的感染性cDNA克隆的RNA引入细胞系中，其中所述HEV克隆相对于SEQIDNO:5所示的HEV核酸序列，在编码ORF1高变区的核酸序列区域中包含长度为至少10个氨基酸的插入片段；并且其中所述RNA不能产生ORF3。在一些实施方案中，所述细胞系为猪细胞系或人细胞系。本发明还涉及得到在细胞培养物中具有复制能力的HEV毒株的方法，所述方法包括从慢性感染患者中获得病毒；感染培养中的细胞系，连续传代所述病毒，例如至少3代、至少4代、至少5代、至少6代或更多代；以及选择在细胞培养物中复制的来自慢性感染患者的突变体。在一些实施方案中，本发明涉及利用产生自复制性HEVcDNA克隆的RNA转录物的HEV病毒作为评价目标产品的HEV病毒状况的指示物。在一些实施方案中，此类方法包括将如本文所述的已知量HEV病毒加入待分析材料，例如血液、水、食品中；将所述材料进行去除病毒的过程，例如过滤、加热等；以及在病毒去除过程之后确定材料样品中存在的所加HEV病毒的量。残留HEV病毒的量指示病毒去除过程的功效。附图简述图1.Kernow-C1病毒在人肝癌细胞中生长的适应情况。将大约等量的粪便中的病毒(方框)或在HepG2/C3A细胞中连续传代6次的病毒(圆圈)以低MOI接种于HepG2/C3A细胞上，并通过HepG2/C3A细胞上的空斑形成测定和RT-PCR来分别定量释放到培养基中的感染性病毒(图A)和总病毒(图B)。所有收获的样品和保留的接种物的空斑测定一式三份，根据代码同时进行：直接比较表明粪便接种物，其产生少得多的病毒，实际上比传代接种物包含的感染性病毒多5倍。注意FFU和RNA尺度上的差异。误差棒为标准偏差。图2.人细胞和猪细胞上戊型肝炎病毒的滴度比较。将每种病毒的连续稀释物一式三份接种到8孔腔室玻片中的人HepG2/C3A细胞(实心柱)或LLC-PK1猪细胞(空心柱)上。三天后，对玻片编码，对ORF2蛋白进行免疫染色，手动计数终点空斑。不破坏代码直至对所有样品计数。学生t检验p值为0.006-0.016。图3.鹿细胞中ORF2的差异化翻译。(A)将鹿细胞用所示毒株感染，3天后进行免疫染色并将含ORF2蛋白(实线)、ORF3蛋白(虚线)以及两种蛋白(阴影线)的所有细胞计数。(B)将鹿细胞和S10-3人细胞用表达双顺反子mRNA的CMV质粒转染，所述双顺反子mRNA包含Sar-55(CMV-Sar)序列、Kernow-Cl(CMV-Kernow)序列或其中前29个核苷酸序列被Kernow-Cl的前29个核苷酸序列替代的Sar-55序列(CMV-MT29)。两天后，通过FACS对ORF2或ORF3蛋白免疫染色的细胞进行定量并依照染色细胞百分比计算ORF2与ORF3之比(如上所示)。图4.人序列插入至Kernow-Cl的高变区。人核糖体基因S17序列与通过从在HepG2/C3A细胞中传代6次的病毒中扩增的RT-PCR产物的直接测序获得的序列的比较。插入片段侧翼的HEV序列用下划线标示。(A)核苷酸:HEV(SEQIDNO:11)、S17(SEQIDNO:12)；(B)氨基酸HEV(SEQIDNO:13)、S17(SEQIDNO:14)。图5.S10-3细胞用连续的质粒构建体转染。所示限制性片段用从第6代病毒准种中扩增的相应片段取代。新的构建体用作下一次取代的本底并重复该程序直至所有的p1被p6序列取代。在同一实验中对所有的质粒进行转录、转染和对ORF2蛋白的免疫染色：在转染后3天收获三份样品并通过流式细胞术测试。给出相邻样本的学生t检验P值。P<0.05被认为是显著的。误差棒表示标准偏。图6.X区域中氨基酸882,904和965回复突变降低了转染水平。将S10-3细胞用缺少CCA和X区域突变的5'ORFl质粒、包含CCA和X区域突变的ORFl/CCA质粒、p6和包含CCA但无X区域突变的回复突变质粒来转染。转染后6天对三份样品的细胞进行免疫染色并通过流式细胞术来分析。给出P值并且误差棒表示标准偏差。图7.从P6去除S17序列消除了大部分点突变的适应作用。将S10-3细胞用带或不带S17序列的p1和p6质粒转染。在转染后第4天将三份样品用流式细胞术进行分析。P值均<0.0001除了pl/S17对比p6delS17。误差棒表示标准偏差图8.在S17插入片段存在下来自ORF2的荧光色素酶的表达是大量且延长的。在缺失S17插入片段或X基因区突变的p6基因组中，ORF2病毒的衣壳蛋白用gaussia荧光色素酶取代。在转染S10-3细胞后，每24小时完全更换培养基。图A由带S17插入片段的基因组(实心柱)或不带S17插入片段的基因组(阴影柱)产生的荧光色素酶单位的比值在每个时间点之上的括号中示出，误差棒为标准偏差。图B从由缺失三种X基因突变的两个独立的cDNA克隆编码的基因组的平均荧光色素酶产生(点柱和交叉阴影的柱)比p6/luc基因组的平均荧光色素酶产生(实心柱)下降了1/2.3-1/5.1。比值每个时间点之上的括号中示出。图9.S17插入片段中的同义突变对转染效率几乎无影响。将保守氨基序列的突变引入S17插入片段中的54/58密码子(突变体#1)或41/58密码子(突变体#2)的第三个碱基中并将RNA转录物转染至S10-3细胞中。转染的效率通过转染后5天三份样品的流式细胞术来确定。图10.编码不同HVR的p6基因组转录物的转染效率的比较情况。将三份样品在转染后第5天或第6天接受流式细胞术。误差棒表示标准偏差并且方括号内表示学生t检验P值。编码58个氨基酸的S17插入片段的174nt缺失或用以下替代，A：来自第1代的114nt的GTP酶或绿色荧光蛋白(GFP)的3’端174nt。#1和#2为两个独立的克隆。P6对比任何其它基因组的P值＝<0.0003。B：编码GFP的前58个氨基酸的5’174nt，#1-3＝3个独立的克隆。P6对比任何其它基因组的P值＝<0.001。C：S17插入片段的5’、中间或3’87nt的一半。P6对比任何其它基因组的P值＝<0.0002。D：117nt的S19核糖体蛋白基因插入片段。#1和#2为两个独立的克隆。P6对比任何其它基因组的P值＝<0.001并且3种GFP克隆之间的P值＝>0.27。图11.由p6编码的基因组或病毒可在猪LLC-PK1细胞中复制并感染猪LLC-PK1细胞。A：用缺少或包含S17插入片段的p6的转录物转染的猪细胞，在转染后第5天通过流式细胞术进行测定。B：从转染HepG2/C3A细胞的培养基中收获的p6病毒的三份样品在编码下在HepG2/C3A细胞(空心柱)和LLP-C1细胞(点柱)上进行平行滴定。图12.S17插入片段对S10-3和BHK-21细胞的Sar55转染的作用。S10-3(A)和BHK-21(B)细胞的转染效率通过流式细胞术来监测。图13.ORF3蛋白的缺失并不抑制HepG2/C3A培养物中细胞对细胞的传播。HepG2/C3A细胞用来自p6或p6/ORF3无效质粒的转录物电穿孔，与天然的HepG2/C3A细胞混合并在37℃下培养。在4天的每一天收获三份样品，用甲醇固定并储存于-80℃直至通过流式细胞术分析。误差棒表示标准偏差。两种病毒的第5天的值P＝0.74表示每种构建体转染的细胞数目相似。发明详述定义本文所用术语“戊型肝炎病毒”(“HEV”)是指病毒、病毒类型或病毒类别。HEV归于肝炎病毒属并为带有含三个开放阅读框(ORF)和5'和3'顺式作用元件的基因组大小为7.2kb的正义单链RNA二十面体病毒。ORF1编码甲基转移酶、蛋白酶、解旋酶和复制酶；ORF2编码衣壳蛋白和ORF3编码未定义功能的蛋白。单个已知血清型有四种主要的基因型。在本发明中，带有HEV病毒的“慢性感染”患者有至少六个月的感染。所述感染的持续时间可例如通过测量患者中HEV序列的水平，通常通过测量血清或粪便样品中病毒RNA的水平来测量。如本文所用的，就本发明HEV变体而言的“感染性”是指HEV在培养物中复制的能力。在本发明的上下文中，cDNA克隆被认为是“感染性克隆”或“复制型cDNA克隆”，因为其编码能够感染细胞并在细胞中复制的病毒RNA基因组。在典型的实施方案中，在体外利用噬菌体聚合酶从cDNA克隆合成病毒RNA基因组，并接着将所述RNA引入细胞中。在本发明中，“感染性”还指在细胞系中复制的能力。例如，当转染细胞系，例如人或猪的肝细胞系或肾细胞系如HepG2肝癌细胞系或LLC-PK1肾猪细胞系时，相比于用未修饰成包含赋予复制能力的插入片段的基因型所获得的转染子数量，得到更大数量的转染子，例如多至少10％、至少20％、至少50％、至少75％或至少100％或者更大数量的转染子。在典型的实施方案中，评价ORF2的水平以确定转染子的更大数量。在一些实施方案中，评价感染性病毒的数量(病毒产生的峰值)以确定本发明的HEV变体复制的能力。众所周知的测定，例如，空斑测定可用作感染性病毒数目的测量手段。本文所用的“复制型”HEV毒株为“感染性”HEV毒株；并且“感染性”HEV毒株应理解为“复制型”HEV毒株。测量ORF2产生的方法为本领域所熟知。例如，可应用流式细胞术或荧光显微术。如本领域所理解的，尽管肝细胞和肾细胞可常用于评价本发明的变体在培养物中复制的能力，但还可使用其它细胞，例如MRC5肺细胞。当结合例如细胞或核酸、蛋白或载体使用时，术语“重组”意指所述细胞、核酸、蛋白或载体已通过异源核酸或异源蛋白的引入或天然核酸或蛋白的改变来修饰，或者意指所述细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中不存在的基因或者表达以其它方式异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。本文术语“重组核酸”意指，一般而言原本在体外通过例如使用聚合酶和核酸内切酶进行核酸的操作以在自然中通常不存在的形式形成的核酸。以这种方式，实现不同序列的可操作连接。因此线性形式的分离的核酸，或者通过连接通常不连接的DNA分子在体外形成的表达载体，两者均被认为是用于本发明目的的重组。应理解的是一旦作出重组核酸并重新引入宿主细胞或生物体中，其将非重组地复制，即利用宿主细胞的体内细胞机制而非体外的操纵；然而，一旦重组产生此类核酸，虽然随后非重组地复制，其仍被视为用于本发明目的的重组。同样，“重组蛋白”为利用重组技术，即通过如上所述重组核酸的表达制备的蛋白。当涉及蛋白或肽时，短语与抗体“特异性(或选择性)结合”或与抗体“特异性(或选择性)免疫反应”是指其中抗体与目标蛋白结合的结合反应。在本发明的上下文中，抗体通常结合抗原例如本发明的HEV多肽，其亲和力比其对其它抗原的亲和力高至少10倍。本文可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白”指氨基酸残基的聚合体。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合体，以及天然存在的氨基酸聚合体、包含修饰残基的天然存在的氨基酸聚合体和非天然存在的氨基酸聚合体。术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及功能与天然存在的氨基酸相似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸以及之后被修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如，与氢结合的碳、羧基、氨基和R基，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫亚砜、甲硫甲基亚砜。此类类似物可具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指这样的化合物，该化合物具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但类似于天然存在的氨基酸发挥功能。氨基酸在本文可通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的其通常已知的三字母符号或单字母符号来指代。同样地，核苷酸可通过公认的单字母代码来指代。术语“保守型取代”参考蛋白或肽使用以反映基本不改变分子活性(特异性或结合亲和力)的氨基酸取代。典型的保守型氨基酸取代是指将一种氨基酸取代为具有相似的化学性质(例如电荷或疏水性)的另一种氨基酸。以下六组各自包含彼此可进行典型保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。术语“核酸”是指单链或双链的形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合体。除非特别限制，否则所述术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述天然核苷酸具有与参考核酸相似的结合特性并以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，否则特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子的取代)和互补序列以及明确表示的序列。术语“分离的”或“基本纯化的”意指基本不含其他细胞组分的化学组合物。此类组合物可在均质状态，尽管其可在干溶液或水溶液中。纯度和均一性通常利用分析化学的技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法或质谱来确定。制剂中存在的主要种类的蛋白为基本上纯化的。一般而言，基本上纯化或分离的蛋白应包含制剂中存在的所有大分子物质的80％以上。在一些实施方案中，纯化蛋白以代表存在的所有大分子物质的90％以上、95％以上或纯化至基本均质，其中通过常规技术没有检测到其它大分子物质种类。在两条或更多条核酸或多肽序列的情形下，术语“一致的”或百分比“一致性”是指当在比较窗，或利用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目测检查所测的指定区域内进行最大一致性比较和比对时，相同的或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基(例如，在指定区域内至少60％一致性、任选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性)的两条或更多条序列或子序列。可选地，百分比一致性可以是60％到100％的任一整数。这些定义也指核酸序列的互补物。通过在比较窗内比较两条最佳的对比序列来确定“序列一致性的百分比”，其中在所述比较窗中多核苷酸序列或多肽序列的部分与用于两条序列最佳对比的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，可包含添加或缺失(即空位)。所述百分比通过以下来计算：确定两条序列中存在的相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数并将结果乘以100以产生序列一致性的百分比。本文所用“比较窗”包括参考任何一段连续位置数的区段，其中在两条序列最佳对比后，序列可与连续位置数相同的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域内公知的。适合确定序列一致性百分比和序列相似性的算法的实例为BLAST和BLAST2.0算法，其分别在Altschuletal.(Nuc.AcidsRes.25:3389-402,1977)和Altschuletal.(J.Mol.Biol.215:403-10,1990)中描述。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)为公众获取(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。该算法包括，首先通过鉴定查询序列中长度W的短字符来鉴定高得分序列对(HSP)，其当与数据库序列中相同长度的字符对比时，匹配或满足某正值阈值得分T。T被称为邻近字符得分阈值(Altschuletal.,见以上)。这些最初的邻近字符命中作为开始搜索以找到包含它们的更长的HSP的种子。所述字符命中沿每条序列双向延伸，直到累积比对得分增加。对于核苷酸序列，利用参数M(一对匹配残基得分；永远>0)和N(不匹配残基罚分；永远<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，利用评分矩阵以计算累积得分。出现以下情况时，每个方向中的字符命中延伸停止累积比对得分从其最大得到的值下降数量X；由于一个或多个负得分残基对比的累积，累积得分达到0或0以下；或达到任一序列的末端时。所述BLAST算法参数W、T、和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用以下缺省值：字长(W)11、期望(E)10、M＝5、N＝-4和双链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下缺省值：字长3和期望(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见HenikoffandHenikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915,1989)算法(B)50、期望(E)10、M＝5、N＝-4和双链的比较。出于本申请的目的，一致性百分比通常用设置为缺省参数的BLAST2算法来确定。当用于给定氨基酸或多核苷酸序列的位置的上下文中时，“相应的”、“参考”、“对比”或“相对于”当给定氨基酸序列或多核苷酸序列与参考序列对比时，是指目标指定序列的残基位置。例如，当指HEVORF1编码序列的高变区中插入片段的位置时，所述目标序列与HEVORF1参考序列比对并与所述参考序列对比以确定ORF1的插入点。除非另外说明，否则术语“一(a)”或“一(an)”通常意指“一个或多个”。引言本发明部分基于基因型3HEV毒株中序列突变的发现，该突变赋予了在细胞培养物的不同细胞类型中复制的能力。本发明因而提供了编码HEV基因型3蛋白的核酸序列或HEV基因型3蛋白的具有生物学功能的片段、诊断和治疗试剂，以及使用如本文所述的HEV克隆例如用于制备疫苗的方法。在一方面，本发明涉及编码戊型肝炎病毒基因型3Kernow毒株及其变体的复制型变体的全长核苷酸序列的核酸，特别是cDNA。在另外的方面，本发明涉及通过将符合读框的核酸序列插入戊型肝炎病毒核酸序列编码ORF1的区域(例如，ORF1的高变区)中，修饰戊型肝炎病毒毒株以增加所述毒株在细胞培养物中复制的能力。本发明利用重组遗传学领域的常规技术，涉及合成编码目标多肽的多核苷酸和在表达系统中表达这些多核苷酸。一般而言，下述的重组DNA技术中的命名和实验室程序为本领域熟知且常用的那些。公开本发明中使用的通用方法的基础文献包括：Sambrook&Russell,MolecularCloning,ALaboratoryManual(分子克隆,实验室手册)(第3版,2001)；Kriegler,GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual(基因转移和表达：实验室手册)(1990)；以及CurrentProtocolsinMolecularBiology(现代分子生物学实验技术)(Ausubeletal,编辑,1994-2009以及更新的内容,WileyInterscience)。复制型HEV毒株本发明涉及能在细胞培养物中复制的HEVcDNA。在一个实施方案中，具有在细胞培养物中复制的能力的本发明的HEVcDNA，与具有SEQIDNO:l所示核苷酸序列的cDNA克隆有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性或更大的一致性。在一些实施方案中，本发明的HEVcDNA编码与SEQIDNO:2所示的ORF1序列有至少85％、通常为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性或更大一致性的HEVORF1。在一些实施方案中，具有复制能力的依照本发明的全长克隆与具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的cDNA克隆有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性或更大的一致性，并且相对于SEQIDNO:6在ORF1的高变区(其在SEQIDNO:6中通过下划线表示)中包含插入片段。在一些实施方案中，插入片段起始于氨基酸750，如参考SEQIDNO:6确定的。在一些实施方案中，插入片段编码长度为约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100或约200个氨基酸或更多的氨基酸序列。在一些实施方案中，插入氨基酸序列长度为50-65个氨基酸。在一些实施方案中，插入氨基酸序列长度为35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个氨基酸。在一些实施方案中，插入氨基酸序列长度为至少40、45、50或55个氨基酸。在一些实施方案中，插入片段长度为58个氨基酸。在一些实施方案中，插入片段具有SEQIDNO:9所示的序列。在一些实施方案中，编码插入片段的核苷酸插入片段的大小为ORF1，长度为约60个核苷酸至约300个核苷酸。在一些实施方案中，本发明的复制型HEV克隆相对于SEQIDNO:5在编码ORF2的区域中有突变。在一些实施方案中，本发明的复制型HEV克隆相对于SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，在编码ORF1高变区的区域中具有插入片段并且相对于SEQIDNO:5在编码ORF2的区域中具有其它突变。在其它实施方案中，本发明的复制型克隆具有一个或多个核苷酸的改变，其编码相对于SEQIDNO:6的ORF1中的13个氨基酸位置和/或相对于SEQIDNO:8的ORF2的2个氨基酸位置。在一些实施方案中，复制型克隆具有如本文所述的插入片段和一个或更多个另外的突变，其编码选自表4所示位置的氨基酸位置，所述位置相对于原始病毒在p6Kernow病毒中被突变。在一些实施方案中，本发明的复制型HEVcDNA在ORF1中，通常在ORF1的高变区中包含插入片段。复制型HEVcDNA可为任何基因型。在一些实施方案中，HEV基因型1毒株在ORF1中包含插入片段。在一些实施方案中，HEV基因型3毒株在ORF1中包含插入片段。在一些实施方案中，HEV基因型2毒株或基因型4毒株在ORF1中包含插入片段。包含插入片段的依照本发明的HEVcDNA相对于不包含插入片段的cDNA，具有提高的在细胞培养物中复制的能力。在一些实施方案中，插入片段在ORF1的高变区中。在一些实施方案中，插入在第749位之后，使得插入氨基酸序列起始于ORF1蛋白序列的第750位，如参考SEQIDNO:6确定的。在一些实施方案中，插入片段编码核糖体RNA蛋白的序列。插入片段例如可与SEQIDNO:9有至少75％、80％、85％、90％或95％或更大的一致性。在一些实施方案中，ORF1中的插入片段由SEQIDNO:10所示序列的下划线部分编码。复制型HEVcDNA可利用本领域熟知的技术来构建。例如，全长cDNA克隆可从通过RT-PCR产生的cDNA片段来装配。然后，此类cDNA克隆可被转录以得到用于转染至细胞中的RNA。如上所示，本发明包括作为实例如SEQIDNO:l所提供的参考cDNA序列的变体，其保留了在培养中的多种细胞系中复制的能力。此外，如本领域所理解的，由于遗传密码的简并性，应理解的是可作出核苷酸的许多选择，其将提供能够指导HEV开放阅读框产生的DNA序列。由本发明的HEVcDNA编码的多肽在另外的方面，本发明提供了由本发明的复制型HEVcDNA克隆编码的多肽以及利用本发明的复制型HEVcDNA克隆产生此类多肽的方法。在一些实施方案中，此类多肽可完全或部分纯化自通过转染了本发明的核酸序列的细胞产生的戊型肝炎病毒。在另一个实施方案中，一种或多种多肽从本发明的核酸序列的片段重组产生。而在另一个实施方案中，多肽是化学合成的。本发明的多肽，特别是结构性多肽，可作为疫苗开发中的免疫原或作为用于检测生物样品中HEV存在的诊断测定的开发中的抗原。在一些实施方案中，本发明提供具有以下序列的多肽或片段：SEQIDNO:2或SEQIDNO:6所示的ORF1氨基酸序列；SEQIDNO:4或SEQIDNO:8所示的ORF2氨基酸序列；或SEQIDNO:3或SEQIDNO:7所示的ORF3氨基酸序列；或以上的片段或变体。在一些实施方案中，本发明的多肽与SEQIDNO:4或SEQIDNO:8的ORF2蛋白有至少90％、95％或100％或更高一致性的序列。在一些实施方案中，本发明的多肽具有这样的序列，该序列与SEQIDNO:4或SEQIDNO:8的ORF2蛋白的片段有至少95％、通常至少96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列一致性，其中所述片段长度为至少200、至少300、至少400、至少500或至少600个氨基酸。在一些实施方案中，本发明的多肽具有与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的ORF1蛋白的片段至少85％、至少90％、至少95％、通常至少96％、97％、98％、99％或更高一致性的序列，其中所述片段长度为至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少700、至少1000或至少1500个氨基酸。在一些实施方案中，本发明提供了包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:4、SEQIDNO:3或SEQIDNO:7的氨基酸序列的多肽。本发明的多肽可用于，例如诊断和预后目的。例如，在一些实施方案中，本发明的多肽可用作免疫原以刺激抗体的产生。载体和宿主细胞本发明的复制型病毒可培养于多种宿主细胞中。例如，在一些实施方案中，RNA获自本发明的复制型cDNA克隆并被引入细胞系，例如人、猪、或啮齿类的肝细胞系中。在一些实施方案中，细胞系可为肝细胞系或肾细胞系，但还可应用其它的细胞系，例如肺细胞系。在一些实施方案中，复制型cDNA克隆可被引入原代细胞培养物中，例如肝细胞的原代培养物中。接着RNA产生感染性病毒。在一些实施方案中，可培养原代肝细胞，然后用HEV感染，或肝细胞培养物可来源于被感染动物的肝脏。此外，本领域技术人员已知的各种永生化方法可用于获得来源于肝细胞培养物的细胞系。例如，可将原代肝细胞培养物与多种细胞融合以保持稳定性。本发明的cDNA克隆的感染性可用多种测定来评价。例如，在一些实施方案中，一旦将获自cDNA克隆的RNA引入细胞中，便可评价蛋白例如ORF2的表达。在可选的实施方案中，可评价通过cDNA的初始RNA拷贝的引入而起始的病毒复制期间产生的RNA转录物。在典型的实施方案中，本发明的HEV克隆的复制能力通过确定用HEV克隆获得的转染子的数量来评价(即，利用cDNA克隆的RNA拷贝获得)。当在细胞系例如HepG2或其它细胞系中测定时，在ORF1中有插入片段的本发明的各种cDNA克隆被认为是，相对于缺少所述插入片段的相同cDNA克隆副本具有至少10％以上、通常至少20％以上或至少30％、40％、50％、80％或100％或更大数量的表达ORF2的转录子的复制型cDNA克隆。在本发明的上下文中，“复制型”cDNA克隆通常并非被直接引入细胞系中，而是用于体外转录。从转录获得的RNA被引入细胞系中。本领域技术人员理解的是还可测量检测ORF2水平的备选终点，例如病毒颗粒的产生峰值。在一个实施方案中，可将人细胞在体外培养并用本发明的核酸转染。然后可评价人细胞以确定该细胞是否显示出HEV感染的任何迹象。此类迹象包括在细胞中检测出病毒抗原，例如通过本领域通常已知的免疫荧光程序；通过蛋白印迹检测病毒多肽；以及经由诸如RT-PCR的方法检测细胞内新转录出的病毒RNA。经此类测试后，活的、感染性病毒颗粒的存在情况还可通过将细胞培养基或细胞裂解液注射至健康、易感的动物中，随后用HEV感染的症状的表现来显示。在一些实施方案中，本发明的感染性核酸可引入宿主动物，例如猪中，例如以评价HEV克隆的毒力。通过感染性核酸序列的转染产生的病毒的毒力表型可通过本领域已知的方法，例如通过肝酶水平(谷丙转氨酶(ALT)或异柠檬酸脱氢酶(ICD))的测量或通过肝活检的组织病理学来评价。在一个实施方案中，可将编码本发明多肽的核酸并入用于在宿主细胞中表达的表达盒中。表达系统为本领域熟知并且包括例如细菌如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。表达载体包括基于病毒的载体和质粒载体。在一些实施方案中，HEV多肽和肽在人宿主细胞中表达。在其它实施方案中，本发明还涉及由来自不同毒株的HEV序列组成的“嵌合核酸序列”。因此，在一个实施方案中，嵌合核酸序列可具有来自本发明的感染性克隆的序列，例如来自如本文所述的复制型cDNA克隆的编码ORF1的多核苷酸，以及诸如来自另一种HEV毒株的编码ORF2的多核苷酸的序列。此类嵌合序列可通过标准技术产生。在一些实施方案中，可缺失感染性核酸序列中所包含的基因或5'或3'非翻译区的全部或部分。然后，可将此类序列转染至带突变序列的宿主细胞(动物或细胞培养物)中。病毒复制可利用已知方法，例如RT-PCR来测量。在一些实施方案中，进行HEV基因的中心部分的缺失，例如以保留存在于HEV多蛋白内的蛋白之间并参与合适的多蛋白加工的切割位点边界。在一些实施方案中，设计本发明的核酸序列以具有用于在细胞培养系统，例如哺乳动物细胞培养系统中表达的优化密码子。例如，可根据宿主使用的特定密码子的频率选择密码子，以增加特定原核宿主或真核宿主中出现的肽/多肽表达的速度。在一些实施方案中，选择密码子以产生具有所需性质例如更长半衰期的RNA转录物。在一个实施方案中，将转染了本发明核酸序列的动物细胞(例如人细胞)在体外培养，并通过将抗病毒活性的候选抗病毒剂(化学物质、肽等)加入培养基中用候选试剂处理该细胞。接着经过足够的时间用于发生感染，之后通过本领域技术人员已知的方法对比未处理的对照细胞来确定病毒复制的存在与否。此类方法包括但不限于在细胞中检测病毒抗原，例如通过本领域熟知的免疫荧光程序；使用病毒多肽特异的抗体通过蛋白印迹检测病毒多肽；通过RT-PCR检测细胞内新转录出的病毒RNA；以及通过将细胞培养基或细胞裂解液注射至健康、易感的动物中用随后的HEV感染症状的表现来检测活的、感染性病毒颗粒的存在情况。对照细胞(仅用核酸序列处理)得到的结果与处理细胞(核酸序列和抗病毒剂)得到的结果的比较表明，若有的话，候选抗病毒剂的抗病毒活性的程度。当然，本领域技术人员很容易理解的是，此类细胞可在暴露于本发明的核酸序列之前或之后用候选抗病毒剂处理以确定所述试剂针对病毒感染和复制的哪一阶段或那些阶段是有效的。复制型病毒的分离本发明还提供了利用慢性感染HEV患者作为病毒的另外来源获得复制型病毒的方法。在典型的方法中，病毒分离自患者，通常为粪便样品，并用于感染细胞系，例如肝癌细胞系。病毒连续传代以使病毒适应细胞培养物的方法为本领域熟知。例如，病毒可利用以下方案来传代。得到粪便样品并匀浆以产生悬浮液，将悬浮液通过离心来澄清并使用澄清的悬浮液(或者病毒可通过超速离心进一步纯化，之后可将其稀释于所选的培养基中)。将粪便悬浮液或血清的等分试样覆盖到小培养平皿或烧瓶中排干的单层细胞(例如，HepG2/C3A)上并孵育(例如，在约34.5℃的温度下在CO2培养箱中持续5小时)。吸干接种物并加入细胞培养基。在相同温度下继续孵育。将培养基除去，每周更换一次或两次培养基，并对所收集的培养基进行能感染HepG2/C3A或另一种所需细胞系如LLC-PK细胞的病毒量的滴定。当培养基中的病毒滴度已上升至足够高的水平(例如，1000个空斑形成单位/mL)，将等分试样移出并用于接种另一烧瓶或平皿的细胞(例如，HepG2细胞)并重复该程序，例如5次，直至培养基中的病毒达到所需滴度。为了获得cDNA克隆，提取培养基等分试样中的病毒RNA，并反转录成cDNA，其通过PCR扩增，通常作为重叠片段，并克隆。将T7聚合酶启动子并入到基因组的5'端并将唯一的限制性位点作为PCR引物的一部分并入到3'端。将cDNA片段用合适的限制性酶消化并连接到一起以产生全长病毒基因组cDNA。将cDNA在大肠杆菌中扩增、纯化并在唯一的限制性位点线性化。将线性化的cDNA用T7聚合酶在体外转录。该RNA随后可用于转染细胞并产生复制型病毒基因组、病毒蛋白和感染性病毒颗粒。本领域技术人员理解的是这些方案有许多变化。以上概述的用于连续传代和cDNA克隆的方案是方案的实例而并不意图限制所应用的方案。本发明的HEVcDNA、病毒和蛋白的用途利用本发明的cDNA克隆产生的戊型肝炎病毒可通过本领域技术人员已知的方法从转染的细胞中纯化或部分纯化。在优选的实施方案中，病毒在其用作本发明的药物组合物和疫苗中的免疫原之前是部分纯化的。因此本发明涉及产生自本发明的HEV核酸序列的戊型肝炎病毒的用途。例如，相对于SEQIDNO:5在ORF1中有插入片段的HEV3型毒株(例如具有SEQIDNO:1所示序列的HEV3型或其变体)，用作活疫苗或被杀死的疫苗(例如福尔马林灭活的)中的免疫原以预防哺乳动物的戊型肝炎。在一些实施方案中，HEV3型毒株病毒有不可使用的ORF3。在此类实施方案中，ORF3可通过突变或缺失失活。本发明还涉及重组HEV蛋白作为诊断试剂和疫苗的用途。作为免疫原起作用的疫苗，可为细胞、来自转染了重组表达载体的细胞的细胞裂解液或包含所表达蛋白的培养物上清液。或者，免疫原为部分或基本纯化的重组蛋白。在一个实施方案中，疫苗利用直接的基因转移来给予。这可经由给予包含本发明核酸序列的真核表达...