治疗癌的组合物和方法

治疗癌的组合物和方法
【专利摘要】本发明提供治疗卵巢癌的组合物和方法。具体而言，本发明涉及施用具有α-叶酸受体(FRα)结合结构域和4-1BB(CD137)共刺激结构域的基因修饰的T细胞以治疗卵巢癌。
【专利说明】治疗癌的组合物和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年I月18日提交的美国临时申请号61/433，731的优先权，其通过参考以其整体并入本文。
【背景技术】
[0003]卵巢癌是大部分妇产科癌死亡的原因。2004年，在美国，诊断出25，580例新的病例，并且16，090名妇女死于卵巢癌。
[0004]该疾病在工业化国家中更加常见，日本除外。在美国，女性具有1.4%至
2.5%(40-60个女人中I个)的生命机会发展卵巢癌。年长女人处在最高的风险下。
[0005]尽管腹膜内化疗已经推荐为卵巢癌一线治疗的护理标准，但该推荐的基础已经受到了挑战。放射疗法对于晚期阶段是无效的，因为当关键器官在放射区域中时，不能安全递送高剂量。外科疗法也是无效的。
[0006]尽管初始成功的多科性治疗一细胞减数外科和随后组合化疗，但大部分晚期疾病患者最终复发并且不能治愈。由于该原因，急切需要治疗该恶性肿瘤的新治疗方法。
[0007]基于卵巢肿瘤是相对免疫原性的，诱导内源性T细胞应答的事实，卵巢癌尤其看起来适合过继性转移方法。
[0008]所以，需要改善的治疗形态以提供抗肿瘤免疫性，并且从而治疗卵巢癌和其他癌。
【发明内容】

[0009]本发明提供编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中分离的核酸序列包括α-叶酸受体(FRa)结合结构域的核酸序列和4_1BB(CD137)共刺激结构域的核酸序列。
[0010]在一种实施方式中，核酸序列进一步包括⑶3 ζ结合结构域的核酸序列。
[0011]在一种实施方式中，CAR包括SEQ ID Ν0:13或SEQ ID Ν0:22的氨基酸序列。
[0012]在一种实施方式中，编码CAR的分离的核酸序列包括SEQ ID Ν0:1或SEQ ID NO:20的核酸序列。
[0013]在一种实施方式中，FRa结合结构域是抗体或其FR a -结合片段。优选地，FRa结合结构域是Fab或scFV。
[0014]在一种实施方式中，FRa结合结构域结合肿瘤抗原，其中肿瘤抗原是FR α。在一种实施方式中，肿瘤抗原与上皮恶性肿瘤相关。在另一实施方式中，肿瘤抗原是与实体瘤相关。
[0015]在一种实施方式中，FRa结合结构域包括SEQ ID N0:15或SEQ ID N0:23的氨基酸序列。
[0016]在一种实施方式中，FRa结合结构域由SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:21的核酸序列编码。
[0017]在一种实施方式中，4-1BB共刺激结构域包括SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。[0018]在一种实施方式中，4-1BB共刺激结构域由SEQ ID NO:6的核酸序列编码。
[0019]在一种实施方式中，⑶3 ζ信号传导结构域包括SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。
[0020]在一种实施方式中，⑶3 ζ信号传导结构域由SEQ ID NO:7的核酸序列编码。
[0021]在一种实施方式中，分离的核酸序列进一步包括跨膜结构域的核酸序列。
[0022]本发明也提供分离的CAR，其包括FR α结合结构域和4-1ΒΒ共刺激结构域。
[0023]本发明也提供包括编码CAR的分离的核酸序列的基因修饰的T细胞，其中分离的核酸序列包括FR α结合结构域的核酸序列和4-1ΒΒ共刺激结构域的核酸序列。
[0024]本发明也提供包括编码CAR的分离的核酸序列的载体，其中分离的核酸序列包括FRa结合结构域的核酸序列和4-1ΒΒ共刺激结构域的核酸序列。
[0025]本发明也提供用于在对象中提供抗肿瘤免疫性的方法。在一种实施方式中，包括向对象施用有效量的包括编码CAR的分离的核酸序列的基因修饰的T细胞，其中分离的核酸序列包括FR α结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，从而在对象中提供抗肿瘤免疫性。在一种实施方式中，分离的核酸序列进一步包括CD3(信号传导结构域的核酸序列。
[0026]在一种实施方式中，共刺激结构域的存在提高T细胞存活。在另一实施方式中，共刺激结构域的存在增加对象中抗肿瘤免疫性的效能。
[0027]在一种实施方式中，对象是哺乳动物。优选地，对象是人。
[0028]本发明也提供 用于在对象中刺激对细胞群或组织的T细胞介导的免疫应答的方法。在一种实施方式中，方法包括向对象施用有效量的包括编码CAR的分离的核酸序列的基因修饰的T细胞，其中分离的核酸序列包括FR α结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，从而刺激对象中T细胞介导的免疫应答。
[0029]本发明也提供治疗对象中卵巢癌的方法。在一种实施方式中，方法包括向对象施用有效量的包括编码CAR的分离的核酸序列的基因修饰的T细胞，其中分离的核酸序列包括FR α结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，从而治疗对象中的卵巢癌。
[0030]本发明也提供治疗对象中癌症的方法。在一种实施方式中，方法包括向对象施用有效量的包括编码CAR的分离的核酸序列的基因修饰的T细胞，其中分离的核酸序列包括FRa结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，从而治疗对象中的癌症。
[0031]本发明也提供在诊断患有卵巢癌的对象中产生持续的基因工程化T细胞群的方法。在一种实施方式中，方法包括向对象施用有效量的包括编码CAR的分离的核酸序列的基因修饰的T细胞，其中分离的核酸序列包括FR α结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，其中持续的基因工程化T细胞群在施用后在对象中持续至少一个月。在一种实施方式中，持续的基因工程化T细胞群在施用后持续至少三个月。
【专利附图】

【附图说明】
[0032]当与附图结合阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方式的以下详细描述。为了说明本发明的目的，在附图中显示了目前优选的实施方式。然而，应当理解本发明不限于附图显示的实施方式的精确布置和手段。
[0033]图1是显示a FR CAR的构建和慢病毒基因转移至人T细胞的图像。[0034]图2是表明CAR+T细胞优先分泌Thl细胞因子的图像。
[0035]图3是显示直接的和特异性的肿瘤识别和杀死α FR+人卵巢癌的图像。
[0036]图4是显示在Winn试验中并入4-1ΒΒ信号传导结构域可增强抗肿瘤活性的图像。
[0037]图5是显示使用CAR基因疗法治疗大的、确定的人卵巢癌的图像:4-1ΒΒ共刺激介导增强的T细胞存活。
[0038]图6是显示表示嵌合抗α叶酸受体免疫受体a -FR4-1BB:⑶3 ζ转基因和载体构建体的附图的图像。将构建体克隆入PELNS骨架载体(底部)，其包含包装信号(Ψ)、中心聚嘌呤区/中心终止序列(cppt/CTS)和延伸因子1-α启动子(ef-la)。包装期间转移载体离开(driven off) 5’ LTR,并且当反转录时3’ SIN LTR复制至5’端。
[0039]图7是显示PELNS — M0vl9-4_1BB-CD3 ζ的质粒图的图像。
[0040]图8，包括图8Α和8Β，是显示抗a FR慢病毒载体工程化的T细胞产生和溶细胞活性的一系列图像。图8A显示a FR-结合嵌合受体的示意性图示。也构建具有截短的TCRC结构域的结合-对照嵌合受体和具有抗CD19scFv的特异性对照受体。图SB是显示在人初级⑶4T细胞上检测a FR-CAR蛋白质表达的图像。通过流式细胞术确定转导效率。
[0041]图9是显示通过流式细胞术确定AE17、AE17.FR、SK0V3上的FR的细胞表面表达(顶部)的图像。用小鼠抗人抗体皿18(浅灰色柱状图)或同种型对照(深灰色柱状图)温育细胞，随后用缀合FITC的山羊抗小鼠Ig染色。使用4h51Cr释放试验测定初级人T细胞上嵌合受体靶向表达a FR的细胞系的溶细胞活性(中间)。FRa+肿瘤靶可直接诱导T细胞细胞因子分泌。结果表示为来自至少3个分开实验的I个的三重孔的平均数和SD (底部)。
[0042]图10是显示体外有效的aFR-特异性杀死AE17.FR肿瘤细胞的图像。AE17和AE17.FR细胞以指示比用GFP温育的CAR+T细胞转导约20h，其后细胞在荧光显微法下拍照。每组T细胞的CAR转导效率是?40%-50%。
[0043]图11是显示体内aFR嵌合受体转导的T细胞的抗肿瘤活性的图像。NOD/scid/IL2r Y + (NOG)小鼠皮下注入混合有表达CAR的T细胞(IX IO6个细胞/小鼠)的SK0V3LUC (I X IO6个细胞/小鼠)。就在注入之前进行细胞的混合，以使T细胞和标靶的相互作用最小化。在接种之后每10天对动物照相，以评估肿瘤生长，并且使用“Living Image”软件量化来自表达荧光素酶的细胞的光子发射。
[0044]图12，包括图12A至12D，是一系列图像，其显示α FR重新靶向的T细胞体内根除大的预先建立的肿瘤:共刺激信号传导结构域的效果和施用的途径。图12Α和12C表明监测皮下注入3 X IO6个SK0V3细胞的小鼠的肿瘤生长直到肿瘤体积达到200?300mm3。在第40和45天，用肿瘤内注入20 X IO6个T细胞(?40% - 50%转基因阳性)治疗负载肿瘤的小鼠。图12B和12D表明经IT、IP和IV途径用表达BBz嵌合受体的T淋巴细胞治疗负载SK0V3的NOG小鼠，并且评估对肿瘤生长的影响。
[0045]图13是显示4-1BB信号体内增强人T淋巴细胞的持久性的图像。在第74天，从眼框后出血获得外周血，并且对其为人⑶45、⑶4和⑶8T细胞的存在染色。在对人⑶45+群设门之后，使用TruCount管(BD Biosciences)量化CD4+和CD8+子集。独立于注入的途径，在BBz组中的持久性最大。
[0046]图14，包括图14A至14C，是 显示α FR CAR BBz根除SK0V3肿瘤是抗原-特异性的一系列图像。图14A和14B显示在第40和45天用表达BBz CAR(抗α FR或⑶19)和GFP的淋巴细胞治疗的负载SKOV3的小鼠。图14C显示，二次T细胞注入之后3周获得来自负载SKOV3的NOG小鼠的外周血，并且通过FACS Trucount试验对⑶4和⑶8Τ细胞的存在量化。
[0047]图15，包括图15Α至15C，是显示α FR CAR BBz特异性T细胞抑制腹膜癌病的SK0V3鼠模型中肿瘤生长和腹水形成的一系列图像。图15A是显示⑶19CAR T细胞治疗之后，NOG小鼠中腹膜内注入SK0V3肿瘤导致腹部膨胀和结节性腹膜肿瘤的图像。当与用FRCAR BBz T细胞治疗的小鼠(左)比较时，小鼠发展腹水，如通过膨胀的腹部表明的(中间)，腹膜的尸检观察显示腹腔(右)内的结节性肿瘤块(箭头)。图15B和15C显示腹膜内/静脉注入aFR CAR BBz T细胞延迟肿瘤进展和腹水形成，并且提高存活率。用⑶19CAR或a FR CART细胞治疗的NOG小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。
[0048]图16是显示a FR CAR BBz-特异性T细胞的过继性转移诱导卵巢癌肺转移退行的图像。尽管肿瘤响应a FR-特异性T细胞的注入而退行，但⑶19-特异性T细胞治疗的小鼠中肿瘤逐渐生长。
[0049]图17是显示从健康供体分离的⑶4T细胞在20的MOI下用表达GFP的HIV源的慢病毒载体转导并且培养29天的图像。X轴表示倍数扩大(圆形)或GFP表达百分数(三角形)。转导的细胞是开符号和模拟转导的细胞是闭符号。
[0050]图18，包括图18A至图18E，描绘体外FRa CAR转导的人T细胞的产生和特异性免疫识别。图18A显示基于M0vl9的CAR构建体的示意性图示,所述构建体包含单独⑶3 ζ胞质结构域(Μ0ν19- ζ )或组合⑶137共刺激模块(Μ0ν19-ΒΒ ζ )。显示具有截短的⑶3 ζ结构域(MOv19- Δ ζ )和抗CD19-BB ζ CAR的FR a -特异性CAR。VL，可变L链；L,连接体；VH,可变H链；TM，跨膜区域。图18B描绘在用慢病毒转导之后在人⑶3-设门细胞上M0vl9CAR表达(实体黑线)与平行的未转导的T细胞(填充的灰色柱状图)的比较。显示转导百分数。图18C描绘通过流式细胞术确定的各种人卵巢癌细胞系进行的表面FR α表达(实体黑线)；同种型抗体对照(填充的灰色柱状图)。图18D描绘用FR α +癌细胞系温育过夜之后，Μ0ν19-ζ和Μ0ν19-ΒΒζ CAR转导的T细胞而不是Μ0ν19_ Λ ζ抗CD19-BB ζ T细胞的抗原-特异性IFN- 分泌。显示来自三重培养物的平均IFN-Y浓度土 SEM (pg/mL)。图18E描绘在18-小时生物发光试验中，以指示的E/T比，通过FRa CAR+⑶8+T细胞抗原-特异性杀死FRa +肿瘤细胞。未转导的T细胞(UNT)或gfp-转导的人⑶8+T细胞用作对照。
[0051]图19，包括图19A至图19D，显示人Μ0ν19-ΒΒζ CAR T细胞体内根除大的预先建立的肿瘤，并且显示CD137共刺激信号`传导结构域的效果和施用的途径。在第O和5天，用肿瘤内注入8X IO6个CAR+T细胞治疗负载建立的皮下肿瘤的NSG小`鼠，并且每2周成像。图19A描绘肿瘤生长，如通过测径器测量[V=l/2(长度X宽度2)]评估的。图19B显示最后T细胞剂量之后2周和4周与Μ0ν19- ζ和对照治疗组相比，在MCM`9-BB ζ CAR治疗的小鼠中，SK0V3fLuc+生物发光信号减少。经肿瘤内、腹膜内或静脉内途径用8 X IO6个MOv 19-BB ζT细胞治疗负载SK0V3fLuc的NSG小鼠。图19C描绘肿瘤生长，如通过测径器测量评估的。图19D显示在第73天(最后T细胞剂量之后4周)，⑶137信号传导体内提高在外周血中人⑶4+和⑶8+T细胞的存活率。使用TruCount方法量化来自血液的⑶4和⑶8T细胞。显示每个治疗组中所有评估的小鼠的平均细胞浓度(细胞/μ L) 土SD。[0052]图20，包括图20A至图20D，显示CAR T细胞的肿瘤根除是抗原-特异性的。在第O和5天，用表达Μ0ν19-ΒΒζ、抗CD19-BB ζ或gfp的8X IO6个T细胞(40%转导效率)经肿瘤内注入治疗具有皮下SK0V3fLuc+肿瘤的NSG小鼠。图20A描绘通过测径器每2至3天测量肿瘤体积。在最后T细胞注入之后，收集外周血3周。图20B描绘血液的人⑶4+和⑶8+T细胞/ μ I的绝对数。显示平均细胞计数土SD。图20C描绘通过使用山羊抗小鼠IgGF (ab' ) 2，在由流式细胞术测量的来自治疗小鼠外周血的人⑶3+T细胞上FR α -和⑶19-特异性CAR的表达。显示每组的平均CAR+表达频率土SD。图20D描绘绝对CAR+T细胞计数，其计算为每μ L血液人⑶3+Τ细胞的数量乘以CAR+百分数。测定平均计数土SD。
[0053]图21是表明对肿瘤的体内CAR T细胞定位是抗原-特异性的一系列图像。在第O和5天，用静脉内注入表达Μ0ν19-ΒΒζ (顶部)、抗CD19-BB ζ (中间)或gfp (底部)的8X IO6个T细胞治疗具有皮下SK0V3fLuc+肿瘤的NSG小鼠。从安乐死的小鼠收集生长大约另外40天的SK0V3肿瘤，并且对其染色用于人CD3表示(褐色)。代表性切片以X 100放大显示。
[0054]图22，包括图22A至图22D，显示Μον19-ΒΒζ T细胞在腹膜癌病的SK0V3鼠模型中抑制肿瘤生长和腹水形成。图22Α描绘接收腹膜内注入的5 X IO6个SK0V3fLuc+肿瘤细胞的NSG小鼠，并且将其随机分成4组，然后开始在肿瘤接种后第30和35天经腹膜内或静脉内注入表达Μ0ν19-ΒΒζ或抗CD19-BB4的9 X IO6个T细胞的疗法。图22Β描绘用Μ0ν19_ΒΒ ζT细胞(左)经静脉内(顶部)或腹膜内(底部)注入治疗的代表性NSG小鼠。如通过膨胀的腹部表明的(中间)，用抗CD19-BB4 T细胞(右)治疗的小鼠发展腹水。腹膜的尸检观察显示结节性肿瘤块(箭头；极右)。图22C描绘用Μ0ν19-ΒΒ ζ或抗⑶19-ΒΒ ζ T细胞经静脉内或腹膜内注入治疗的负载肿瘤的NSG小鼠的卡普兰-迈耶肿瘤-相关的存活曲线。图22D描绘负载肿瘤的NSG小鼠的卡普兰-迈耶总存活率。
[0055]图23，包括图23Α和图23Β，显示FR α -特异性T细胞的过继性转移诱导卵巢癌肺转移的退行。具有3天建立的SK0V3fLuc+肿瘤的NSG小鼠在肺中、在第3天和第8天接收表达Μ0ν19-ΒΒζ或抗⑶19-Β Βζ的6X IO6个T细胞的尾静脉注入。图23Α描绘肿瘤，如通过BLI监测的。图23Β描绘量化的来自fLuc+肿瘤细胞的平均值土SD生物发光信号光子发身寸。
[0056]图24显示用Μ0ν19-ΒΒ ζ或Μ0ν19_ζ转导的初级人T细胞在用FR α +癌细胞系刺激之后优先产生Thl细胞因子。转导的T细胞(I X IO5个CAR+T细胞)单独培养(没有其他)或用等数量的人FRa+SK0V3或抗原阴性ΡΕ0-1卵巢癌细胞刺激过夜。收获来自3个独立培养物的无细胞上清液，并且在温育?20小时后合并，并且使用细胞计量珠阵列技术(cytometric bead array technology)量化指不的人Thl/Th2细胞因子。值表不指不的细胞因子的IFN-Y浓度(pg/ml)。
[0057]图25，包括图25A至图25C，显示工程化表达FR α -特异性CAR的初级人T细胞体外裂解FRa+细胞系。图25Α描绘转导不表达人FR α的天然小鼠恶性间皮瘤细胞系AE17，以表达高表面水平的人FRa (AE17.FRa)，如流式细胞术显示的。转导以表达Μ0ν19_ ζ、MOv 19-ΒΒ ζ、MOv19-Δ ζ或抗CD19-BB ζ CAR,或绿色荧光蛋白(gfp)的初级人T细胞与Cr51标记的天然AE17或AE17.FRa细胞系以指定的效应子与标靶比共同培养4小时。图25B描绘特异性靶细胞溶胞作用的百分数，计算为(实验的释放-自发的释放)+ (最大的释放-自发的释放)X100。结果表示为三重孔的平均数，误差条表示标准偏差。转导以表达ΜΟν19- ζ、MOv 19-ΒΒ ζ、MOv19- Δ ζ或抗CD19-BB ζ CAR的人T细胞在各种效应子与标靶比下与表达gfp的ΑΕ17或AE17.FR α细胞共同培养24小时。图25C描绘转导的细胞在荧光显微方法下照相。通过gfp标记的粘附肿瘤细胞的成像减少指示靶细胞溶胞作用。
[0058]图26，包括图26A至图26D，显示肿瘤退行与体内工程化的人T细胞的稳定持久性相关，并且取决于提供CD137共刺激信号传导。图26A描绘肿瘤负荷，如通过T细胞注入之后4周每个治疗组的平均生物发光信号测量的。图26B描绘体内T淋巴细胞的持久性，其通过Trucount方法在转移经静脉内、肿瘤内或腹膜内途径递送的表达Μ0ν9_ΒΒ ζ的T细胞或肿瘤内施用表达Μ0ν19- ζ的T细胞或对照载体(Μ0ν19-Λ ζ或gfp ;对照)之后4周评估。图26C显示T细胞疗法之后4周，工程化的人T细胞的稳定持久性(X轴)与生物发光信号负相关(y轴；r=-0.78)。单独在培养基中(未显示)或与SK0V3 —起培养3天之后，检测通过FR-特异性CAR CD8T细胞的Bc1-Xl表达。与MOv19- ζ CAR+T细胞(6.7%)相比，在用FRa +肿瘤细胞刺激之后，Bcl-XL表达优先在Μ0ν19-ΒΒ ζ CAR T细胞群中增加(15.4%)。单独在培养基中培养不诱导在CAR T细胞中的Bcl-XL表达。图26D描绘3个独立的共同培养之一的代表性FACS分析。
[0059]图27是描绘T细胞疗法之后切除的肿瘤样本的肉眼评估的一系列图像。从NSG小鼠收获肿瘤，所述NSG小鼠肿瘤内(1.t.)注入盐水或负载gfp、Μ0ν19-Λ ζ、Μ0ν19_ ζ、MOv 19-ΒΒ ζ CAR的T细胞；或静脉内α.ν.)或腹膜内α.ρ.)注入Μ0ν19-ΒΒζ T细胞。“没有肿瘤”表示其中没有检测到肿瘤的小鼠。在第一次T细胞注入后大概40天安乐死时从小鼠收获肿瘤。
[0060]图28是描绘本文其他地方详述的临床试验的研究方案计划的图像。
[0061]图29是显示被工程化以表达包含人源化的C4scFv的全人抗FRCAR的初级人T细胞体外识别并且应答表达FR的癌细胞系。scFv有效地在被转导以表达第一(-Z)或第二(-28z)CAR(上部；对于gfp共同表达使用双顺反子载体)的T细胞表面上表达。当与表达FR的卵巢癌或乳腺癌细胞共同培养过夜时，CAR转导的而不是未转导的(UNT)T细胞分泌IFN-g。很少表达至不表达FR的细胞系(A2780和C30)未被识别(下部)。
[0062]图30是总结SEQ ID NO同一性的图像。
[0063]发明详述
[0064]本发明涉及治疗癌症的组合物和方法，所述癌症包括但不限于上皮癌。本发明涉及转导以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞过继细胞转移的策略。CAR是联合对期望抗原(例如，肿瘤抗原)的基于抗体的特异性和T细胞受体-活化细胞内结构域以产生显示特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
[0065]本发明一般地涉及被基因修饰以稳定表达期望的CAR的T细胞的应用。表达CAR的T细胞在本文中被称为CAR T细胞或CAR修饰T细胞。优选地，该细胞可被基因修饰，以在它表面上稳定表达抗体结合结构域，给予MHC非依赖性的新型抗原特异性。在一些例子中，T细胞被基因修饰，以稳定表达CAR，所述CAR将特异性抗体的抗原识别结构域与CD3- ζ链或FcyRI蛋白的细胞内结构域联合成为单一嵌合蛋白。
[0066]在一个实施方式中，本发明的CAR包括具有抗原识别结构域的胞外结构域、跨膜结构域和胞浆结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在另一个实施方式中，可选择跨膜结构域，或可由氨基酸置换修饰，以避免这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。优选地，跨膜结构域为CDSa铰合结构域。
[0067]相对于胞浆结构域，本发明的CAR可被设计以由其本身包括⑶28和/或4-lBB(CD137)信号传导结构域，或与在本发明的CAR的内容下有用的任何其他期望的胞浆结构域(一个或多个)联合。在一个实施方式中，CAR的胞楽；结构域可被设计以进一步包括⑶3-ζ的信号传导结构域。例如，CAR的胞浆结构域可包括但不限于⑶3-ζ、4-1ΒΒ和CD28信号传导模块和其组合。因此，本发明提供了 CAR T细胞和它们用于过继疗法的方法。
[0068]在一种实施方式中，本发明的CAR T细胞可通过将包括靶向α-叶酸受体(aFR或FRa)的期望CAR的慢病毒载体引入细胞产生。例如，慢病毒载体包括进入细胞的包含抗FRa、⑶8 α铰合和跨膜结构域，和人4-1BB和⑶3 ζ信号传导结构域的CAR。本发明CAR的抗FRa结构域可为结合FRa的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段和人源化的抗体。因此，如本文使用，抗FRa (或抗aFR)表示靶向FRa的任何组合物。本发明的CAR T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
[0069]在一个实施方式中，本发明涉及利用淋巴细胞注入施用表达CAR的基因修饰T细胞，以治疗具有癌症或处于具有癌症风险下的患者。优选地，自体淋巴细胞注入用于治疗。自体PBMC从需要治疗的患者收集，和T细胞利用本文描述和本领域已知的方法进行活化和扩展，并且随后注入返回患者。
[0070]本发明包括利用表达包括⑶3-ζ和4-1BB共刺激结构域两者的抗-FR a CAR的T细胞(也被称为FR a -特异性CAR T细胞)。本发明的FR a -特异性CAR T细胞可承受稳固的体内T细胞扩展，并可建立FR a -特异性记忆细胞，其在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量。在一些例子中，本发明的注入患者的FRa-特异性CAR T细胞可消除患有上皮卵巢癌的患者体内的癌细胞。然而，本发明不限于FRa-特异性CART细胞。更确切地，本发明包括与选自CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3 ζ信号结构域和其任何组合的一种或 多种细胞内结构域融合的任何抗原结合部分。
[0071]定义
[0072]除非另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明涉及领域的技术人员通常理解的相同的含义。尽管可在测试本发明的实践中使用类似于或等于本文描述的那些的任何方法和材料，但优选的材料和方法在本文中进行描述。在描述和要求保护本发明中，将使用以下术语。
[0073]也应理解本文使用的术语仅是为了描述【具体实施方式】的目的，并不意欲是限制性的。
[0074]本文使用冠词“一个(a) ”和“一个(an) ”，指的是该冠词语法对象的一个或多于一个(即，指的是至少一个)。以例子说明，“一个元件”表示一个元件或多于一个的元件。
[0075]如本文使用的“大约”，当指的是可测量的值诸如量、时间期间等时，表示包括从给定值±20%或土 10%的变化，更优选±5%，甚至更优选土 1%，和还要更优选±0.1%的变化，只要这种变化适于实施公开的方法。
[0076]如本文使用，术语“FR α结合结构域”可指本领域技术人员已知的任何FR α特异性结合结构域。在一种实例中，FRa结合结构域包括单链可变片段(scFv)，其包括特异性结合FRa的抗体的重链可变区(Vh)和轻链可变区(')。抗FRa抗体、抗体片段和它们的变体在本领域是熟知的，并且在下列美国专利公开中充分描述:U.S20100055034 ；U.S.20090324594 ；U.S.20090274697 ；U.S.20080260812 ；U.S.20060239910 ；U.S.20050232919 ；U.S.20040235108，其所有通过引用以它们的整体并入本文。在一种实施方式中，FRa结合结构域是抗FRa抗体的同系物、变体、异构体或功能片段。每个可能性表示本发明单独的实施方式。
[0077]如本文使用，术语“4-1BB (⑶137)共刺激结构域”可指4-1BB的任何序列，其包括，例如，4-1BB的刺激信号传导结构域。本领域已知4-1BB的刺激信号传导结构域和它们的变体，并且充分描述在美国专利公开20050113564中，其通过参考以其整体并入本文。本领域已知4-1BB的核酸和氨基酸序列和它们的变体，并且充分描述在下列美国专利公开中:U.S.20060063923 ；U.S.20060029595 ；U.S.20030082157 ；U.S.20020168719 ；U.S.20040091476 ；U.S.20050113564 ;和 U.S.20060002904，其所有通过引用以它们的整体并入本文。在一种实施方式中，4-1BB (⑶137)共刺激结构域是4-1BB (⑶137)的同系物、变体、异构体或功能片段。每个可能性表示本发明分开的实施方式。
[0078]“活化”，如本文所用的，指的是已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“活化的T细胞”等指的是经历细胞分裂的T细胞。
[0079]术语“抗体”，如本 文所用的，指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2,以及单链抗体和人源化抗体(Harlow 等，1999，In:Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, NY ；Harlow 等，1989，In:Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor, New York ;Houston 等，1988, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883 ；Bird等，1988，Science242:423-426)。
[0080]术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分，并指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段，由抗体片段形成的线性抗体、scFv抗体和多特异性抗体。
[0081]“抗体重链”，如本文所用的，指的是以它们自然发生构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较大的链。
[0082]“抗体轻链”，如本文所用的，指的是以它们自然发生构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较小的链，K和λ轻链指的是两种主要的抗体轻链同种型。
[0083]如本文所用的术语“合成抗体”，指利用重组DNA技术产生的抗体，诸如例如，由如本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语也应当被解释为指已经由DNA分子的合成产生的抗体，所述DNA分子编码抗体并且该DNA分子表达抗体蛋白或规定抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列已经利用本领域可用和广泛公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
[0084]如本文所用的术语“抗原”或“Ag”被定义为激发免疫应答的分子，该免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员将理解任何大分子——实际上包括所有的蛋白质或肽，可用作抗原。此外，抗原可源自重组或基因组DNA。技术人员将理解任何DNA—其包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此编码如本文使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不必单独地由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是本发明包括但不限于，多于一个的基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以不同的组合进行布置，以引起期望的免疫应答。此夕卜，技术人员将理解抗原根本不必由“基因”进行编码。容易显而易见的是抗原可被产生、合成或可源自生物学样本。这种生物学样本可包括但不限于组织样本、肿瘤样本、细胞或生物学流体。
[0085]如本文所用的术语“抗肿瘤效应”，指的是生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌性病症相关的各种生理症状的改善清楚表示。“抗肿瘤效应”也可由本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤在第一位置发生的能力清楚表示。
[0086]根据本发明，术语“自体抗原”指由免疫系统错误识别为外源(foreign)的任何自身抗原。自体抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。
[0087]如本文所用的术语“自身免疫疾病”被定义为由自身免疫应答产生的紊乱。自体免疫疾病是对自身抗原的不适当和过度应答的结果。自身免疫疾病的例子包括但不限于阿狄森氏疾病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克罗恩氏疾病、糖尿病(I型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏疾病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏疾病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病变、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等等。
[0088]如本文所用的，术语“自体”指关于源自相同个体的任何物质，它随后被再次引入该个体。
[0089]“同种异基因的(allogeneic) ”指的是源自相同物种的不同动物的移植物。
[0090]“异种的(xenogeneic) ”指的是源自不同物种的动物的移植物。
[0091]如本文所用的术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌症细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其他部分。各种癌症的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。
[0092]如本文使用的术语“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的关联(cognate)共刺激分子的抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等等)上的分子，由此除了通过例如将TCR/CD3复合物与用肽负载的MHC分子结合提供的初级信号之外，还提供介导T细胞应答的信号，所述T细胞应答包括但不限于增殖、活化、分化等等。共刺激配体可包括但不限于 CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-Ll、PD_L2、4_1BBL、0X40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体也包括，特别是与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，诸如但不限于CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD_1、IC0S、淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3 和与 CD83 特异性结合的配体。[0093]“共刺激分子”指的是与共刺激配体特异性结合的T细胞上的关联结合伴侣，由此介导T细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖，共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
[0094]如本文所用的，“共刺激信号”指的是与初级信号结合，诸如TCR/CD3连接作用，导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
[0095]“疾病”是动物的一种健康状态，其中动物不能保持稳态，和其中如果不改善该疾病，则动物的健康继续恶化。与之相比，动物中的“紊乱”是一种健康状态，其中动物能够保持稳态，但其中动物的健康状态与它没有处于该紊乱相比不太有利。保持不治疗，紊乱不必定引起动物健康状态的进一步降低。
[0096]如本文所用的“有效量”，指提供治疗性或预防性益处的量。
[0097]“编码”指的是多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特异性序列用作模板合成在生物学过程中的其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于那个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的编码链，和用作转录基因或cDNA的模板的非·编码链两者，都可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
[0098]如本文所用的“内源的”指的是来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。
[0099]如本文所用的，术语“外源的”指的是任何从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的物质。
[0100]如本文所用的术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0101]“表达载体”指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有本领域已知的那些，诸如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
[0102]“同源的”指的是两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则所述分子在那个位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比为由两个序列共有的匹配或同源的位置数除以比较的位置数XlOO的函数。例如,如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，则两个序列是60%同源的。以例子说明，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50%的同源性。通常，当比对两个序列以给出最大同源性时，进行比较。
[0103]如本文所用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为起到抗体作用的一类蛋白质。由B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。包括在该类蛋白质中的五个成员为IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA为存在于身体分泌物诸如唾液、泪液、母乳、胃肠分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是在多数对象的初级免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它在凝集反应、补体结合和其他抗体应答中是最有效的免疫球蛋白，并且在抵御细菌和病毒方面是很重要的。IgD是不具有已知抗体功能的免疫球蛋白，但可用作抗原受体。IgE是在暴露于过敏原后，通过引起从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体，介导速发过敏性的免疫球蛋白。
[0104]如本文所用的，“指导材料”包括出版物、记录、图表或任何其他可用于传达本发明组合物和方法的有用性的表达媒介。本发明的试剂盒的指导材料可例如被附加在包含本发明的核酸、肽和/或组合物的容器上，或与包含核酸、肽和/或组合物的容器一起运送。可选地，指导材料可与容器分开地运送，目的是指导材料和化合物由接受者配合使用。
[0105]“分离的”指从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但部分或完全与它的自然状态的共存物质分离的同一核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或例如，可存在于非自然环境，诸如宿主细胞。
[0106]在本发明的内容中，对于通常发生的核酸碱基使用以下缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，和“U”指的是尿苷。
[0107]除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可在某一版本中包含内含子(一个或多个)。
[0108]如本文所用的“慢病毒”指的是反转录病毒科的属。在反转录病毒中慢病毒是唯一能够感染非分裂细胞的；它们可传递显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，以便它们是基因传递载体的最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV是所有慢病毒的例子。源自慢病毒的载体提供了完成显著水平基因体内转移的工具。
[0109]如本文所用的术语“调节”指与缺少治疗或化合物的对象中的应答水平相比，和/或与以其他方式相同但未治疗的对象中的应答水平相比，介导对象中应答水平的可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导对象优选人的有益的治疗性应答。
[0110]除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。
[0111]术语“可操作地连接”指的是调节序列和异源核酸序列之间的功能连接，其产生后者的表达。例如，当第一核酸序列位于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子被可操作地连接至编码序列。通常地，可操作地连接的DNA序列是邻近的，其中在相同的阅读框中必须连接两个蛋白编码区。
[0112]术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意欲指示相对于来自组织或器官的正常细胞的表达水平，来自疾病区如患者的特定组织或器官内的实体瘤的细胞中肿瘤抗原表达的异常水平。具有以肿瘤抗原过表达为特征的实体瘤或血液学恶性肿瘤的患者可由本领域已知的标准测定确定。
[0113]免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c)、静脉内(1.v.)、肌肉内(1.m.)或胸骨内注射，或注入技术。
[0114]术语“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，并指的是服从本文描述方法的任何动物或其细胞，不论是体外或原位。在一些非限制性实施方式中，患者、对象或个体为人。
[0115]如本文所用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸为核苷酸的多聚体。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可交换的。本领域技术人员具有核酸为可被水解成单体“核苷酸”的多核苷酸的一般常识。单体核苷酸可被水解成核苷。如本文所用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有的核酸序列，所述手段包括但不限于重组手段，即，从重组文库或细胞基因组，利用普通克隆技术和PCR?等等克隆核酸序列，和通过合成手段。
[0116]如本文所用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可交换使用，并指的是由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须包含至少两个氨基酸，和对可包括蛋白质或肽的序列的最大数目的氨基酸没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，所述肽或蛋白质包括通过肽键相互连接的两个或多个氨基酸。如本文所用的，该术语指的是短链，其在本领域中也例如通常被称为肽、寡肽和寡聚体；和较长链，其在本领域中通常被称为蛋白质，其具有很多类型。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
[0117]如本文所用的术语“启动子”被定义为开始多核苷酸序列的特异性转录需要的，由细胞的合成机器识别，或引导合成机器的DNA序列。
[0118]如本文所用的，术语“启动子/调节序列”指可操作地连接至启动子/调节序列的基因产物表达所需的核酸序列。在一些例子中，该序列可为核心启动子序列，并且在其他例子中，该序列也可包括基因产物表达所需的增强子序列和其他调节元件。启动子/调节序列可例如为以组织特异方式表达基因产物的序列。
[0119]“组成型”启动子为核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在细胞的多数或所有生理学条件下在细胞中产生基因产物。
[0120]“诱导型”启动子为核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在基本上仅当相应于启动子的诱导物存在于细胞中时，在细胞中产生基因产物。
[0121]“组织-特异性”启动子为核苷酸序列，其当与编码基因或由基因规定的多核苷酸可操作地连接时，使得基本上只要细胞为相应于启动子的组织类型的细胞，则在细胞中产生基因产物。
[0122]如本文所用的关于抗体的术语“特异性结合”指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样本中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨种反应性本身不改变抗体的类别成为特异性的。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体的类别成为特异性的。在一些例子中，术语“特异性的结合”或“特异性地结合”可关于抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用使用，用于指该相互作用依赖化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体通常识别和结合特异性蛋白结构而不是一般地识别和结合蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异性的，则在包含标记的“A”和抗体的反应中存在包含表位A(或游离的、未标记的A)的分子，将降低结合至抗体的标记的A的量。
[0123]通过术语“刺激”指通过结合刺激分子(例如，TCR/⑶3复合物)与它的关联配体，由此介导信号转导事件——诸如但不限于经TCR/CD3复合物的信号转导——诱导的初级应答。刺激可介导一些分子的改变的表达，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织
[0124]“刺激分子”，作为本文使用的术语，指与存在于抗原呈递细胞上的关联刺激配体特异性结合的T细胞上的分子。
[0125]如本文所用的“刺激配体”指如此配体，其当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B-细胞等等)上时，可与T细胞上的关联结合伴侣(在本文中被称为“刺激分子”)特异性结合，由此介导T细胞的初级应答，其包括但不限于，活化、免疫应答的开始、增殖等等。刺激配体在本领域中是公知的，并包括，特别是利用肽、抗-CD3抗体、超激动剂抗-CD28抗体和超激动剂抗-CD2抗体负载的MHC I类分子。
[0126]术语“对象”意欲包括在其内可引起免疫应答的活有机体(例如，哺乳动物)。对象的例子包括人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。
[0127]如本文所用的“基本上纯化的”细胞为基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指的是已经与在其天然发生状态中与其正常相关联的其他细胞类型分离的细胞。在一些例子中，基本上纯化的细胞群指的是均质细胞群。在其他例子中，该术语简单地指的是已经与在其天然状 态中与其正常相关联的细胞分离的细胞。在一些实施方式中，体外培养细胞。在其他实施方式中，不在体外培养细胞细胞。
[0128]如本文所用的术语“治疗性的”表示治疗和/或预防。治疗性效应通过疾病状态的抑制、缓和或根除获得。
[0129]术语“治疗有效量”指的是将引起由研究者、兽医、医学医生或其他临床医生正在寻找的组织、系统或对象的生物学或医学应答的对象化合物的量。术语“治疗有效量”包括以下的化合物的量:当被施用时，其足以预防治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个的发展，或以一定程度减轻治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个。治疗有效量将根据化合物、疾病和其严重性、和待治疗的对象的年龄、重量等而变化。
[0130]“治疗”疾病，作为本文使用的术语，指降低对象经历的疾病或紊乱的至少一种迹象或症状的频率或严重性。
[0131]如本文所用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指的是如此过程，通过该过程外源的核酸被转移或引入宿主细胞。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经由外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代对象细胞和它的子代。
[0132]如本文所用的短语“转录控制下”或“可操作地连接”指启动子处于与多核苷酸有关的正确的位置和朝向，以控制通过RNA聚合酶进行的转录的开始和多核苷酸的表达。
[0133]“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、反转录病毒载体等等。[0134]范围:在该公开中，本发明的多个方面可以以范围形式中示出。应当理解范围形式中的描述仅是为了方便和简洁，并不应被解释为对本发明范围不可动摇的限制。因此，范围的描述应被考虑为具有具体公开的所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。例如，范围诸如从I至6的描述应被考虑为具有具体公开的子范围诸如从I至3、从I至4、从I至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、
5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点是适用的。
[0135]说里
[0136]本发明提供了治疗癌症等疾病的组合物和方法。该癌症可为血液学恶性肿瘤、实体瘤、原发肿瘤或转移性肿瘤。优选地，该癌症为上皮癌，或换言之为癌。更优选地，该癌症为上皮卵巢癌。利用本发明的组合物和方法可治疗的其他疾病包括病毒、细菌和寄生虫感染以及自身免疫疾病。
[0137]在一个实施方式中，本发明提供了工程化以表达CAR的细胞(例如，T细胞)，其中CAR T细胞显示抗肿瘤性质。本发明的CAR可被工程化以包括胞外结构域，所述胞外结构域具有融合至T细胞抗原受体复合物ζ链(例如，CD3()的细胞内信号传导结构域的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时,能够基于抗原结合特异性改变(redirect)抗原识别。示例性抗原为FRa，因为该抗原在恶性上皮细胞上表达。然而，本发明不限于靶向FRa。相反地，本发明包括任何抗原结合部分，当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，以便肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，以便患者的肿瘤负荷(tumorburden)缩小或消除。抗原结合部分优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合部分与选自CD137 (4-1ΒΒ)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3 ζ信号结构域和其任 何组合的一个或多个细胞内结构域融合。
[0138]在一个实施方式中，本发明的CAR包括⑶137 (4-1ΒΒ)信号传导结构域。这是因为本发明部分地基于CAR-介导的T-细胞应答可利用共刺激结构域的添加而进一步提高的发现。例如，与没有被工程化以表达⑶137 (4-1ΒΒ)的其他方式相同的CAR T细胞相比，包括CD137(4-1BB)信号传导结构域显著增加了抗肿瘤活性和CAR T细胞的体内持久性。
[0139]鉬合物
[0140]本发明提供了包括细胞外结构域和细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)。胞外结构域包括靶-特异性结合元件，其另外被称为抗原结合部分。细胞内结构域或另外的胞浆结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
[0141]在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入间隔结构域。如本文所用的，术语“间隔结构域”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包括上至300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸和最优选地25至50个氨基酸。
[0142]抗原结合部分
[0143]在一个实施方式中，本发明的CAR包括另外被称为抗原结合部分的靶-特异性结合元件。部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可选择抗原结合结构域，以识别用作与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记的配体。因此，可用作本发明的CAR的抗原部分结构域的配体的细胞表面标记的例子包括与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫疾病和癌细胞相关的那些标记。
[0144]在一个实施方式中，本发明的CAR可经由工程化特异性结合至肿瘤细胞上抗原的期望抗原结合部分而被工程化，以便靶向兴趣肿瘤抗原。在本发明的内容中，“肿瘤抗原”或“过度增生性紊乱(hyperproliferative disorder)抗原”或“与过度增生性紊乱相关的抗原”指的是对于特定过度增生性紊乱诸如癌症共同的抗原。本文讨论的抗原仅以实例的方式被包括。该列举不意欲是穷尽的，并且更多的实例对于本领域技术人员将是容易显而易见的。
[0145]肿瘤抗原是由引起免疫应答特别是T-细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的抗原结合部分的选择将取决于待治疗癌症的具体类型。肿瘤抗原在本领域中是公知的，并包括例如神经胶质瘤相关的抗原、癌胚抗原(CEA)、β_人绒毛膜促性腺素、α-胎蛋白(AFP)、凝集素-反应的AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-UMN-CA IX、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2 (AS)、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺-特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ES0-l、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺-癌肿瘤抗原-1 (PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性白细胞弹性蛋白酶、印hrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-1、IGF-11、IGF-1 受体和间皮素。
[0146]在一个实施方式中，肿瘤抗原包括与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原癌症表位。恶性肿瘤表达可用作免疫攻击的靶抗原的许多蛋白。这些分子包括但不限于组织-特异性抗原诸如MART-1、黑素瘤中的酪氨酸酶和GP100、和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺-特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子诸如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2的组。而另一组的靶抗原为胎性癌抗原诸如癌胚抗原(CEA)。在B-细胞淋巴瘤中，肿瘤-特异性个体基因型免疫球蛋白构成对个体肿瘤唯一的真正的肿瘤-特异性免疫球蛋白抗原。B-细胞分化抗原诸如CD19、CD20和CD37是B-细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。这些抗原中的一些(CEA、HER-2、⑶19、⑶20、个体基因型)已经有限成功地用作利用单克隆抗体的被动免疫疗法的标靶。
[0147]本发明中提及的该类型肿瘤抗原也可为肿瘤-特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA为对肿瘤细胞唯一的，并不发生在身体的其他细胞上。TAA相关的抗原不是对肿瘤细胞唯一的，并且相反，其在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的病症下，也在正常细胞上进行表达。肿瘤上的抗原表达可在使免疫系统能够响应抗原的病症下发生。TAA可为在胚胎发育期间，当免疫系统不成熟并且不能响应时，在正常细胞上表达的抗原，或它们可为在正常细胞上以极低的水平正常存在的抗原，但其在肿瘤细胞上以高得多的水平进行表达。
[0148]TSA或TAA抗原的非限制性例子包括以下:分化抗原诸如MART-1/MelanA(MART-1)、gpl00 (Pmell7)、酪氨酸酶、TRP_1、TRP_2和肿瘤-特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE, GAGE-1、GAGE-2、pl5 ;过表达的胚胎抗原诸如CEA ;过表达的致癌基因和突变的肿瘤-抑制基因诸如p53、Ras, HER-2/neu ；由染色体易位产生的独特的肿瘤抗原诸如 BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-1GK、MYL-RAR ;和病毒抗原，诸如 Epstein Barr 病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的、基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO, pl85erbB2、pl80erbB_3、c_met、nm_23Hl、PSA、TAG-72、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K_ras、β -联蛋白、CDK4、Mum-1、pl5、pl6、43_9F、5T4、791Tgp72、α -胎蛋白、β -HCG, BCA225、BTAA, CA125、CA15_3\CA27.29\BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、C0-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、M0V18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2 结合蛋白 \ 亲环蛋白 C 相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP 和 TPS。
[0149]在优选的实施方式中，CAR的抗原结合部部分靶向如此抗原，所述抗原包括但不限于 FRa、CD24、CD44、CD133、CD166、印CAM、CA-125、HE4、0val、雌激素受体、孕酮受体、HER-2/neu、uPA、PA1-1 等等。
[0150]取决于待靶向的期望抗原，本发明的CAR可被工程化以包括对期望抗原靶特异性的适当的抗原结合部分。例如，如果FRa是待靶向的期望抗原，则FRa的抗体可用作抗原结合部分，并入本发明的CAR。
[0151]在一个实施方式中，本发明的CAR的抗原结合部部分靶向FRa。优选地，本发明的CAR中的抗原结合部部分为抗-FRa scFV，其中抗-FRa scFV的核酸序列包括SEQ ID:3中提出的序列。在一个实施方式中，抗-FRa scFV包括编码SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方式中，本发明的CAR的抗-FR a scFV部分包括SEQ ID NO: 15中提出的氨基酸序列。
[0152]在一种实施方式中，本发明的CAR中抗原结合部部分是人源化的抗FRa SCFV，其中人源化的抗FRa scFV的核酸序列包括SEQ ID:21中提出的序列。在一种实施方式中，人源化的抗FRa scFV包括编码SEQ ID N0:23的氨基酸序列的核酸序列。在另一实施方式中，本发明的CAR的人源化的抗FR a scFV部分包括SEQ ID NO: 23中提出的氨基酸序列。
·[0153]跨膜结构域
[0154]对于跨膜结构域，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
[0155]跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。在天然来源中，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。具体用于本发明的跨膜区可源于T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、⑶137、⑶154(即至少包括上述中的跨膜区(一个或多个))。可选地，跨膜结构域可为合成的，在该情况下，它将包括占主导的疏水残基诸如亮氨酸和缬氨酸。优选地，将在合成跨膜结构域的每一端上发现苯基丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸之间，可在CAR的跨膜结构域和胞浆信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。
[0156]优选地，本发明的CAR中的跨膜结构域为CD8跨膜结构域。在一个实施方式中,CD8跨膜结构域包括SEQ ID N0:5的核酸序列。在一个实施方式中，⑶8跨膜结构域包括编码SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方式中，⑶8跨膜结构域包括SEQID NO: 17的氨基酸序列。
[0157]在一些例子中，本发明的CAR的跨膜结构域包括CD8铰合结构域。在一个实施方式中，⑶8铰合结构域包括SEQ ID N0:4的核酸序列。在一个实施方式中，⑶8铰合结构域包括编码SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方式中，⑶8铰合结构域包括SEQ ID NO: 16的氨基酸序列。
[0158]胞浆结构域
[0159]本发明的CAR的胞浆结构域或另外的细胞内信号传导结构域是造成其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化的原因。术语“效应子功能”指的是细胞的专有功能。例如，T细胞的效应子功能可为包括细胞因子分泌的细胞溶解活性或辅助活性。因此术语“细胞内信号传导结构域”指的是转导效应子功能信号并指导细胞实施专有功能的蛋白部分。尽管通常可使用整个细胞内信号传导结构域，但在很多例子中，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。术语细胞内信号传导结构域因此指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
[0160]用于本发明的CAR的细胞内信号传导结构域的优选例子包括T细胞受体(TCR)的胞浆序列和协同行动以在抗原受体结合后开始信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同的功能能力的任何合成序列。
[0161]已知通过TCR单独产生的信号不足以完全活化T细胞，并且也需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可由两个不同类的胞浆信号传导序列介导:通过TCR(初级胞浆信号传导序列)开始抗原-依赖性初级活化的那些和以抗原-非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号(次级胞浆信号传导序列)的那些。
[0162]初级胞浆信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级胞浆信号传导序列可包含信号传导基序，其已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。
[0163]包含在本发明中具有具体用途的初级胞浆信号传导序列的ITAM的例子包括源于TCR ζ、FcR Y、FcRP、CD3 Y、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b 和 CD66d 的那些。特别优选地，本发明的CAR中的胞 浆信号传导分子包括源于CD3 ζ的胞浆信号传导序列。
[0164]在优选的实施方式中，CAR的胞浆结构域可被设计以本身包括CD3- ζ信号传导结构域，或可与在本发明的CAR的内容中有用的任何其他期望的胞浆结构域(一个或多个)联合。例如，CAR的胞浆结构域可包括CD3(链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。这种分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、0X40、CD30、CD40、PD_1、IC0S、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与⑶83特异性结合的配体等等。因此，尽管本发明主要以4-1BB作为共刺激信号传导元件的例子，但其他共刺激元件也位于本发明的范围内。
[0165]本发明的CAR的胞浆信号传导部分内的胞浆信号传导序列可以随机或以规定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸，可形成该连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。
[0166]在一个实施方式中，胞浆结构域被设计以包括CD3_(的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实施方式中，胞浆结构域被设计以包括CD3-(的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。还在另一个实施方式中，胞浆结构域被设计以包括⑶3- ζ的信号传导结构域和⑶28和4-1ΒΒ的信号传导结构域。
[0167]在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括4-1ΒΒ的信号传导结构域和⑶3- ζ的信号传导结构域，其中4-1ΒΒ的信号传导结构域包括SEQ ID NO:6中提出的核酸序列和⑶3-ζ的信号传导结构域包括SEQ ID Ν0:7中提出的核酸序列。
[0168]在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括4-1ΒΒ的信号传导结构域和⑶3- ζ的信号传导结构域，其中4-1ΒΒ的信号传导结构域包括编码SEQ IDNO: 18的氨基酸序列的核酸序列，和⑶3- ζ的信号传导结构域包括编码SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的核酸序列。
[0169]在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括4-1ΒΒ的信号传导结构域和⑶3-ζ的信号传导结构域，其中4-1ΒΒ的信号传导结构域包括SEQ ID NO: 18中提出的氨基酸序列，和CD3-(的信号传导结构域包括SEQ ID NO: 19中提出的氨基酸序列。
[0170]载述
[0171]本发明包括包含CAR序列的DNA构建体，其中该序列包括可操作地连接至细胞内 结构域的核酸序列的抗原结合部分的核酸序列。可用于本发明的CAR的示例性细胞内结构域包括但不限于⑶3-ζ、⑶28、4-1ΒΒ等等的细胞内结构域。在一些例子中，CAR可包括CD3- ζ、CD28、4-1BB等等的任何组合。
[0172]在一个实施方式中，本发明的CAR包括抗-FRa scFv、人⑶8铰合和跨膜结构域、和人4-1BB和⑶3ζ信号传导结构域。在一个实施方式中，本发明的CAR包括SEQ ID NO:1中提出的核酸序列。在另一实施方式中，本发明的CAR包括编码SEQ ID Ν0:13的氨基酸序列的核酸序列。在另一实施方式中，本发明的CAR包括SEQ ID NO: 13中提出的氨基酸序列。
[0173]在一种实施方式中，本发明的CAR包括人源化的抗FR a scFv、人⑶8铰合和跨膜结构域，和人4-1BB和⑶3ζ信号传导结构域。在一种实施方式中，本发明的CAR包括SEQID NO:20中提出的核酸序列。在另一实施方式中，本发明的CAR包括编码SEQ ID Ν0:22的氨基酸序列的核酸序列。在另一实施方式中，本发明的CAR包括SEQ ID Ν0:22中提出的氨基酸序列。
[0174]编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产，而不被克隆。
[0175]本发明也提供了其中插入本发明的DNA的载体。源于反转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖(propagation)。慢病毒载体具有超过源自致癌反转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的额外优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的额外优点。
[0176]简单概括，通常通过可操作地连接编码CAR多肽或其部分的核酸至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码CAR的天然或合成核酸的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
[0177]本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5，399，346、5，580，859、5，589，466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
[0178]该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
[0179]进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如 Sambrook 等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，W001/96584 ；W001/29058 ;和美国专利号6，326，193)。
[0180]已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，反转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入反转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
[0181]额外的启动子元件，例如增强子，调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管近来已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
[0182]合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1 a (EF-1 α )。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40 (SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV) 长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
[0183]为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
[0184]报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因:其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因(例如，U1-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
[0185]将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
[0186]将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如 Sambrook 等(2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸I丐转染。
[0187]将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是反转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒1、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5，350，674和5，585，362。
[0188]将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
[0189]在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸 可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
[0190]适于使用的脂质可从商业来源中获得。例如，二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma, St.Louis, MO 中获得；憐酸二嫁腊酯(“DCP”)可从K&K Laboratories (Plainview,NY)中获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring中获得；二肉豆蘧酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从 Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL)中获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质原液可被保存在大约-20°C下。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”为通用术语，其包括通过产生封闭的脂双层或聚集体而形成的多种单一和多层脂质工具。脂质体可以以具有含有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构为特征。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们自发形成。在形成封闭的结构和使水和溶解的溶质陷入脂双层之间前，该脂质成分经历自身重排(Ghosh等，191Glycobiology5:505-10)。然而,也包括与正常的囊泡结构相比具有溶液中的不同结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的非均一聚集体而存在。同样考虑的是脂质转染胺-核酸复合物。
[0191]不管用于将外源核酸引入宿主细胞的方法，或以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂，以便证实在宿主细胞中存在重组DNA序列，可实施多种测定。这样的测定包括例如本领域技术人员公知的“分子生物学”测定，诸如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR ；“生物化学”测定，诸如例如通过免疫学手段(EL1SA和蛋白质印迹)或通过本文描述的鉴定落入本发明范围内的试剂的测定，检测特定肽的存在或不存在。
_2] T细胞的活化和扩展
[0193]不论在T细胞遗传修饰以表达期望的CAR之前或之后，T细胞都可通常使用以下所述的方法活化和扩展:例如美国专利6，352，694 ;6，534，055 ;6，905，680 ;6，692，964 ；5，858，358 ;6，887，466 ;6，905，681 ;7，144，575 ;7，067，318 ;7，172，869 ;7，232，566 ；7，175，843 ;5，883，223 ;6，905，874 ;6，797，514 ;6，867，041 ;和美国专利申请公布号20060121005。
[0194]通常地，本发明的T细胞通过与表面的接触进行扩展，所述表面具有附着于其的刺激CD3/TCR复合物相关信·号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，T细胞群可如本文所述的诸如通过与固定在表面上的抗-CD3抗体、或其抗原-结合片段或抗-⑶2抗体接触，或通过和与钙离子载体组合的蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑制素)接触进行刺激。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群可在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗-CD3抗体和抗-CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，使用抗-CD3抗体和抗-CD28抗体。可与在本领域中公知的其他方法一样，可使用包括9.3、B-T3、XR-Q)28 (Diacione, Besancon, France)的抗-CD28 抗体的例子(Berg 等，Transplant Proc.30(8):3975-3977, 1998;Haanen 等，J.Exp.Med.190 (9): 13191328，1999; Garland 等，J.1mmunolMeth.227 (1-2): 53-63，1999)。
[0195]在一些实施方式中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可在溶液中或连接至表面。当连接至表面时，试剂可被连接至同一表面(即，以“cis”形式)或分开的表面(即，以“trans”形式)。可选地，一种试剂可被连接至表面和另一种试剂处于溶液中。在一个实施方式中，提供共刺激信号的试剂被结合至细胞表面，并且提供初级活化信号的试剂在溶液中或被连接至表面。在一些实施方式中，两种试剂可都在溶液中。在另一个实施方式中，试剂可处于可溶形式，随后被交联至表面，诸如表达Fe受体或抗体的细胞或将结合该试剂的其他结合剂。在这点上,见例如用于人造抗原呈递细胞(aAPC)的美国专利申请公布号20040101519和20060034810，其被考虑用于活化和扩展本发明的T细胞。
[0196]在一个实施方式中，两种试剂被固定在珠上，在同一珠即“cis”上或分开的珠即“trans”上。作为例子，提供初级活化信号的试剂为抗-CD3抗体或其抗原-结合片段，和提供共刺激信号的试剂为抗-CD28抗体或其抗原-结合片段；并且两种试剂都以相等的分子数量被共固定至同一珠。在一个实施方式中，使用结合至用于⑶4+T细胞扩展和T细胞生长的珠的1:1比率的每种抗体。在本发明的一些方面中，使用结合至珠的抗CD3:CD28抗体的比率，以便与利用1:1比率观察到的扩展相比，观察到T细胞扩展的增加。在一个具体的实施方式中，与利用1:1比率观察到的扩展相比，观察到从大约I至大约3倍的增加。在一个实施方式中，结合至珠的⑶3:⑶28抗体的比率处于100:1至1:100的范围中和其间的所有整数值。在本发明的一个方面中，比抗-CD3抗体更多的抗-CD28抗体被结合至颗粒，即⑶3:⑶28的比率小于I。在本发明的一些实施方式中，结合至珠的抗⑶28抗体与抗⑶3抗体的比率大于2:1。在一个具体的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:100的⑶3:⑶28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:75的⑶3:⑶28比率。在进一步的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:50的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:30的⑶3:⑶28比率。在一个优选实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:10的⑶3:⑶28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:3的⑶3:⑶28比率。还在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的3:1的⑶3:⑶28比率。
[0197]从1:500至500:1和其间任何整数值的颗粒与细胞的比率可用于刺激T细胞或其他靶细胞。因为在本领域技术人员可容易地领会到，颗粒与细胞的比率可取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小尺寸的珠仅可结合一些细胞，而较大的珠能结合很多。在一些实施方式中，细胞与颗粒的比率在从1:100至100:1的范围内和其间任何整数值，和在进一步的实施方式中，该比率包括1:9至9:1和其间任何整数值，也可用于刺激T细胞。抗-⑶3-和抗-⑶28-结合的颗粒与产生T细胞刺激的T细胞的比率可如以上记录的变化，然而一些优选的值包括 1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1: 1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1 和 15:1，一个优选的比率为至少 1:1 颗粒每 T 细胞。在一个实施方式中，使用1:1或更小的颗粒与细胞的比率。在一个具体的实施方式中，优选的颗粒:细胞比率为1:5。在进一步的实施方式中，颗粒与细胞的比率可根据刺激天数而改变。例如，在一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在第一天为从1:1至10:1，和额外的颗粒每天或此后每隔一天直至10天，以从1:1至1:10的最终比率(基于添加日的细胞计数)被添加至细胞。在一个具体的实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为1:1并在刺激的第三和第五天被调节至1: 5。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以在第一天最终比率为1:1，并在刺激的第三和第五天最终比率为1:5。在另一个实施方式中，颗粒与 细胞的比率在刺激的第一天为2:1并在刺激的第三和第五天被调节至1:10。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以在第一天最终比率为1:1，和在刺激的第三和第五天最终比率为1:10。本领域技术人员将理解多种其他比率可适于用于本发明。特别地，比率将根据颗粒大小和细胞大小和类型而变化。
[0198]在本发明的进一步的实施方式中，细胞诸如T细胞，与包被试剂的珠组合，随后分离该珠和细胞，并且随后培养该细胞。在一个可选实施方式中，在培养前，不分离包被试剂的珠和细胞，而是在一起进行培养。在进一步的实施方式中，珠和细胞首先通过施加力诸如磁力被聚集，产生增加的细胞表面标记的连接作用，由此诱导细胞刺激。
[0199]作为例子，可通过允许附接抗-⑶3和抗-⑶28的顺磁珠(3X28个珠)接触T细胞，来连接细胞表面蛋白。在一个实施方式中，细胞(例如，IO4至IO9个T细胞)和珠(例如，以1:1比率的DYNABEADS? M-450⑶3/⑶28T顺磁珠)在缓冲液优选PBS (没有二价阳离子诸如，钙和镁)中进行联组合。此外，本领域技术人员可容易理解可使用任何细胞浓度。例如，靶细胞可在样本中非常稀少并仅占0.01%的样本，或整个样本(即，100%)可包括感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的内容内。在一些实施方式中，可期望显著降低其中颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用大约20亿细胞/ml的浓度，在另一个实施方式中，使用多于I亿细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用细胞浓度10、15、20、25、30、35、40、45或50X IO6细胞/ml。还在另一个实施方式中，使用细胞浓度75、80、85、90、95或100X IO6细胞/ml，在进一步的实施方式中，可使用125或150X IO6细胞/ml的浓度。利用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩展。进一步地，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，诸如CD28-阴性T细胞。这样的细胞群可具有治疗价值并将在一些实施方式中期望获得。例如，利用高浓度的细胞允许更有效选择正常具有更弱⑶28表达的⑶8+T细胞。
[0200]在本发明的一个实施方式中，混合物可被培养数个小时(大约3个小时)至大约14天或其间任何个小时的整数值。在另一个实施方式中，混合物可被培养21天。在本发明的一个实施方式中，珠和T细胞在一起培养大约八天。在另一个实施方式中，珠和T细胞在一起培养2-3天。也可期望数个周期的刺激，以便T细胞的培养时间可为60天或更多天。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMl培养基1640或X-vivol5, (Lonza))，其可包含增殖和存活必须的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白细胞介素-2 (IL-2)、胰岛素、IFN- Y、IL-4、IL-7、GM-CSF, IL-10、IL-12、IL-15、TGFp 和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂诸如N-乙酰基-半胱氨酸和 2-巯基乙醇。培养基可包括 RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、a -MEM、F_12、X_Vivol5 和X-Vivo20、优选的(Optimizer),具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充适当量的血清(或血浆)或限定的激素组，和/或足够T细胞的生长和扩展量的细胞因子(一个或多个)。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅被包括在实验培养物中，而不包括在注入对象的细胞培养物中。靶细胞被保持在支持生长必须的条件下，例如，适当的温度(例如，37°C )和气氛(例如，空气加5%C02)。
[0201]已经暴露于变化刺激时间的T细胞可显示不同的特性。例如，典型的血液或单采的(apheresed)外周血单 核细胞产物具有比细胞毒性或抑制T细胞群(T。，CD8+)更多的辅助T细胞群(TH，⑶4+)。T细胞通过刺激⑶3和⑶28受体的离体扩展在大约8-9天前产生主要由Th细胞组成的T细胞群，而在大约8-9天后，T细胞群包括渐增的更多的T。细胞群。因此，取决于治疗目的，用主要包括Th细胞的T细胞群注入对象可为有利的。类似地，如果已经分离了 T。细胞的抗原-特异性亚型，则它可有益于以更大的程度扩展该亚型。
[0202]进一步地，除了⑶4和⑶8标记，其他表型标记在细胞扩展过程的进程期间，也显著地但以大部分可重复地变化。因此，这种重复性使针对具体目的调节活化的T细胞产物的能力能够实现。
[0203]治疗性应用
[0204]本发明包括用慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)。例如，LV编码将特异性抗体的抗原识别结构域与CD3- ζ、CD28、4-1BB或任何其组合的细胞内结构域联合的CAR。因此，在一些例子中，转导的T细胞可引起CAR-介导的T-细胞应答。[0205]本发明提供了 CAR改变初级T细胞对肿瘤抗原的特异性的用途。因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤:施用给哺乳动物表达CAR的T细胞，其中CAR包括特异性地与预定标靶相互作用的结合部分，包括例如人CD3(的细胞内结构域的ζ链部分，和共刺激信号传导区。
[0206]在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达CAR，和CAR T细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
[0207]在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。在另一个实施方式中，本发明的CAR T细胞发展成可被重新活化以抑制任何额外肿瘤形式或生长的特异性记忆T细胞。例如，不期望地，本发明的FRa-特异性CART细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量，并形成特异性记忆T细胞。不希望被任何具体的理论所束缚，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，CAR T细胞可体内分化成中心记忆样状态。
[0208]不希望被任何具体的理论所束缚，由CAR-修饰T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合部分特异性的免疫应答。例如，FR α -特异性CART细胞引起对表达FRa的细·胞特异性的免疫应答。
[0209]尽管本文公开的数据具体公开了包括抗-FRa scFV、Ara8a铰合和跨膜结构域、和人4-1BB和CD3 ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化，如本文其他地方所述的。S卩,本发明包括CAR中任何抗原结合部分产生对抗原结合部分特异性的CAR-介导的T-细胞应答的用途。例如，本发明的CAR中的抗原结合部分可出于治疗癌症的目的靶向肿瘤抗原。
[0210]可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和一些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤,和恶性瘤,例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
[0211]在一种实施方式中，本发明的CAR的抗原结合部部分设计为治疗具体的癌症。FRa是糖基磷脂酰肌醇-锚定的蛋白质，其在上皮恶性肿瘤谱中的癌细胞的表面上过表达，但是在正常组织中受限。因此，设计为靶向FRa的CAR可用于治疗特征为展示FRa过表达的细胞和/或组织的任何疾病或紊乱，其包括但不限于上皮癌。例如，设计为靶向FR a的CAR可用于治疗癌症和紊乱，其包括但不限于卵巢癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、结直肠癌、其他实体癌等等。
[0212]然而，本发明不应被解释为仅限于本文公开的抗原标靶和疾病。相反地，本发明应被解释为包括任何与可使用CAR治疗的疾病相关的抗原标靶。
[0213]本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
[0214]对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生:i)扩展细胞，?)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。[0215]离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
[0216]在此通过引用并入的在美国专利号5，199，942中描述的造血干细胞和祖细胞的离体扩展程序，可被应用至本发明的细胞。其他合适的方法在本领域中是已知的，因此本发明不限于细胞离体扩展的任何具体方法。简单地说，T细胞的离体培养和扩展包括:(I)从外周血收获物或骨髓外植体收集来自哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩展这样的细胞。除了美国专利号5，199，942中描述的细胞生长因子，其他因子诸如flt3-L、IL-U IL-3和c_kit配体，也可用于培养和扩展细胞。
[0217]除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
[0218]通常地，如本文所述活化和扩展的细胞可用于治疗和预防无免疫应答的个体中产生的疾病。特别地，本发明的CAR-修饰的T细胞用于治疗卵巢癌。在一些实施方式中，本发明的细胞用于治疗处于形成卵巢癌风险中的患者。因此，本发明提供了治疗或预防卵巢癌的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。
[0219]本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
[0220]本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
[0221]当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出:包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以IO4至IO9个细胞/kg体重的剂量，优选IO5至IO6个细胞/kg体重的剂量——包括那些范围内的所有整数值——施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.0f Med.319:1676,1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
[0222]在一些实施方式中，可期望向对象施用活化的T细胞，并随后重新抽取(redraw)血液(或实施单采血液成分术)，根据本发明活化来自其中的T细胞，和用这些活化和扩展的T细胞再注入该患者。该过程可每几个周进行多次。在一些实施方式中，T细胞可从IOcc至400cc的血液抽取中进行活化。在一些实施方式中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或IOOcc的血液抽取中进行活化。不被理论所束缚，利用多份血液抽
取/多个再输注方案可用于选出一些T细胞群。
[0223]对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(1.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过1.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。
[0224]在本发明的一些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗:所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用:化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫烧蚀剂诸如CAM PATH、抗-CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇类、FR901228、细胞因子和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶——韩调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导(雷帕霉素)重要的P70S6激酶(Liu 等，Cell66:807-815，1991;Henderson 等，Tmmun.73:316-321，1991;Bierer 等，Curr.0pin, Tmmun.5:763-773, 1993)。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体诸如0KT3或CAMPATH的T细胞烧蚀疗法结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的细胞组合 物在B-细胞烧蚀疗法诸如与CD20反应的试剂例如Rituxan后进行施用。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
[0225]施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。例如，CAMPATH的剂量对于成人患者将通常在I至大约IOOmg的范围中，通常每天施用，持续I和30天之间的时期。尽管在一些例子中可使用上至40mg每天的较大剂量(美国专利号6，120，766中描述)，但优选的日剂量为I至IOmg每天。
[0226]实验实施例
[0227]本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解 释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。
[0228]没有进一步的描述，相信利用先前的描述和以下的说明性实施例，本领域技术人员可制造和利用本发明的化合物，并实践请求保护的方法。以下工作实施例因此具体指出本发明的优选实施方式，并不解释为以任何方式限制本公开背景的剩余部分。
[0229]现在描述在这些实验中使用的材料和方法。
[0230]产牛.抗.-α -叶酸受体(α FR) Τ 体分子(body molecule)[0231]抗-aFR scFv (M0vl9)用作模板，用于使用下列引物PCR扩增780-bp M0vl9片段:
[0232]
【权利要求】
1.编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括α-叶酸受体(FRa)结合结构域的核酸序列和4_1BB(CD137)共刺激结构域的核酸序列。
2.权利要求1所述的分离的核酸序列，进一步包括CD3(信号传导结构域的核酸序列。
3.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中CAR包括SEQID NO: 13或SEQ ID NO: 22的氨基酸序列。
4.权利要求1所述的分离的核酸序列，包括SEQID NO:1或SEQ ID N0:20的核酸序列。
5.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述FRa结合结构域是抗体或其FRa -结合片段。
6.权利要求5所述的分离的核酸序列,其中所述FRa-结合片段是Fab或scFv。
7.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述FRa结合结构域结合肿瘤抗原，其中所述肿瘤抗原是FR a。
8.权利要求7所述的分离的核酸序列，其中所述肿瘤抗原与上皮恶性肿瘤相关联。
9.权利要求7所述的分离的核酸序列，其中所述肿瘤抗原与实体瘤相关联。
10.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述FRa结合结构域包括SEQID NO: 15或SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
11.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述FRa结合结构域由SEQID NO:3或SEQ ID NO:21的核酸序列 编码。
12.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述4-1BB共刺激结构域包括SEQIDNO: 18的氨基酸序列。
13.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述4-1BB共刺激结构域由SEQID NO:6的核酸序列编码。
14.权利要求2所述的分离的核酸序列，其中所述CD3(信号传导结构域包括SEQIDNO: 19的氨基酸序列。
15.权利要求2所述的分离的核酸序列，其中所述CD3ζ信号传导结构域由SEQ IDNO:7的核酸序列编码。
16.权利要求1所述的分离的核酸序列，进一步包括跨膜结构域的核酸序列。
17.分离的嵌合抗原受体(CAR)，其包括FRa结合结构域和4-1BB共刺激结构域。
18.权利要求17所述的分离的CAR，进一步包括⑶3ζ信号传导结构域。
19.权利要求17所述的分离的CAR，其中所述CAR包括SEQID NO: 13或SEQ ID NO: 22的氨基酸序列。
20.权利要求17所述的分离的CAR，其中所述FRa结合结构域是抗体或其FR a -结合片段。
21.权利要求20所述的分离的CAR，其中所述FRa-结合片段是Fab或scFv。
22.权利要求17所述的分离的CAR，其中所述FRa结合结构域结合肿瘤抗原，其中所述肿瘤抗原是FRa。
23.权利要求22所述的分离的CAR，其中所述肿瘤抗原与上皮恶性肿瘤相关联。
24.权利要求22所述的分离的CAR，其中所述肿瘤抗原是与实体瘤相关联。
25.权利要求17所述的分离的CAR，其中所述FRa结合结构域包括SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
26.权利要求17所述的分离的CAR，其中所述4-1BB共刺激结构域包括SEQID NO: 18的氨基酸序列。
27.权利要求18所述的分离的CAR，其中所述⑶3ζ信号传导结构域包括SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。
28.权利要求17所述的分离的CAR，进一步包括跨膜结构域。
29.基因修饰的T细胞，包括编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括FR α结合结构域的核酸序列和4-1ΒΒ共刺激结构域的核酸序列。
30.载体，包括编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括FR α结合结构域的核酸序列和4-1ΒΒ共刺激结构域的核酸序列。
31.用于在对象中提供抗肿瘤免疫性的方法，所述方法包括:向所述对象施用有效量的基因修饰的T细胞，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括FRa结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，从而在所述对象中提供抗肿瘤免疫性。
32.权利要求31所述的方法，其中所述分离的核酸序列进一步包括CD3(信号传导结构域的核酸序列。
33.权利要求31所述的方法，其中所述共刺激结构域的存在提高T细胞存活率。
34.权利要求31所述的方法，其中所述共刺激结构域的存在增加所述对象中的抗肿瘤免疫性的效能。
35.权利要求31所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
36.权利要求31所述的方法，其中所述对象是人。
37.用于在对象中刺激对细胞群或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括:向所述对象施用有效量的基因修饰的T细胞，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括FR α结合结构域的核酸序列和4-1ΒΒ共刺激结构域的核酸序列，从而刺激所述对象中T细胞介导的免疫应答。
38.治疗对象中卵巢癌的方法，所述方法包括:向所述对象施用有效量的基因修饰的T细胞，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括FRa结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，从而治疗所述对象中的卵巢癌。
39.治疗对象中癌症的方法，所述方法包括:向所述对象施用有效量的基因修饰的T细胞，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括FRa结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，从而治疗所述对象中的癌症。
40.在诊断具有卵巢癌的对象中产生持续的基因工程化T细胞群的方法，所述方法包括:向所述对象施用有效量的基因修饰的T细胞，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括FR α结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，其中所述持续的基因工程化T细胞群在施用后在所述对象中持续至少一个月。
41.权利要求40所述的方法，其中所述持续的基因工程化T细胞群在施用后在人中持续至少3个月 。
【文档编号】A61P35/00GK103442768SQ201280013888
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2012年1月18日 优先权日:2011年1月18日
【发明者】D·J·鲍威尔, G·聪孔斯 申请人:宾夕法尼亚大学董事会