用于胰腺癌早期检测和治疗的抗粘蛋白抗体的制作方法

用于胰腺癌早期检测和治疗的抗粘蛋白抗体的制作方法
【专利摘要】本文描述了使用抗胰腺癌抗体或其片段，例如鼠、嵌合、人源化或人PAM4抗体的组合物和方法。所述抗体显示出新颖有用的诊断特性，例如高特异性结合胰腺和其它癌症，但不结合正常或良性胰腺组织，并且结合高百分比的早期胰腺癌。优选地，所述抗体结合胰腺癌粘蛋白，例如MUC1或MUC5ac，并且用于早期胰腺癌的检测和诊断。在更优选的实施方案中，所述抗胰腺癌抗体可用于血清样品的免疫测定，其中所述免疫测定检测血清中早期胰腺癌的标记物。最优选地，所述血清在免疫测定之前使用有机相，例如丁醇萃取。或者，使用PAM4和抗CA19.9抗体的免疫测定可用于提高对胰腺癌的灵敏度。
【专利说明】用于胰腺癌早期检测和治疗的抗粘蛋白抗体
[0001]相关申请案
[0002]本申请要求提交于2011年2月15日的美国临时专利申请序列第61/443，007号的优先权。要求保护的优先权申请文本全文以引用的方式并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请包含序列表，其以ASCII格式通过EFS-Web提交，并且全文据此以引用的方式并入。所述ASCII副本创建于2012年2月2日，命名为IMM315W0.txt，大小为49，209字节。
[0005]发明背景发明领域
[0006]本发明涉及结合胰腺癌粘蛋白，优选地结合选自MUCl、MUC5ac和MUC16的粘蛋白的抗胰腺癌抗体及其抗原结合片段。更优选地，抗体或其片段高选择性地结合胰腺癌细胞，以允许在疾病的最早期检测和/或诊断胰腺癌。最优选地，对于健康对照，基于抗体的测定能够检测约85%或更多的胰腺癌，假阳性率为约5%或更小。在具体实施方案中，所述方法和组合物可用于通过筛选来自受试者的血清样品检测和/或诊断胰腺癌，优选地通过血清样品分析可检测60%或更多的I期胰腺癌，以及80%或更多的II期胰腺癌。在其它实施方案，使用抗粘蛋白抗体的免疫测定法可与使用其它胰腺癌标记物，例如CA19.9的免疫检测法组合，从而在不降低特异性的情况下提供胰腺癌检出率的改善。
[0007]在优选的实施方案中，抗胰腺癌抗体与PAM4抗体结合相同的表位或竞争结合胰腺癌粘蛋白，所述PAM4抗体包.含轻链可变区互补性决定区(OTR)序列⑶Rl (SASSSVSSSYLY,SEQ ID NO:1)、CDR2 (STSNLAS，SEQ ID NO: 2)和 CDR3 (HQWNRYPYT，SEQ ID NO: 3);以及重链 CDR 序列 CDR1(SYVLH，SEQ ID NO: 4)、CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO: 5)和CDR3 (GFGGSYGFAY，SEQ ID NO:6) ?最优选地，抗胰腺癌抗体是人源化PAM4(hPAM4)抗体，其包含轻链 CDR 序列 CDRl (SASSSVSSSYLY, SEQ ID NO:1), CDR2 (STSNLAS, SEQ IDNO: 2)和 CDR3 (HQWNRYPYT，SEQ ID NO: 3);和重链 CDR 序列 CDRl (SYVLH，SEQ ID NO: 4),CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO: 5)和 CDR3 (GFGGSYGFAY，SEQ ID NO: 6)，以及人抗体框架区(FR)和恒定区序列。
[0008]相关领域
[0009]胰腺癌是主要发生在胰管细胞中的胰腺恶性生长。该疾病是第九大常见的癌症形式，但在男性和女性中分别是第四大和第五大癌症死亡的主要原因。与监测和/或筛选技术已导致癌症相关死亡率降低的其它主要癌症不同的是，每年死于胰腺癌的患者数量持续上升(Jemal等，2009，CA Cancer J Clin59:225-49)。对于胰腺癌，一年后的总体存活率仅为20%，5年后小于4%。这种预后差的主要原因包括当根治性措施对于提供成功结果具有更大可能时，不能在早期检测疾病，以及缺乏晚期疾病的有效治疗。
[0010]一般来讲，患有早期疾病的患者比那些患有晚期疾病的患者具有更高的存活率。那些手术切除局部疾病的患者具有22%的5年相对存活率，而患有不可切除的晚期转移性疾病的患者为 1-2% (Horner 等，2009，SEER Cancer Statistics Review, 1975-2006, NCI,BetheSda，MD)。虽然早期检测为成功治疗干预提供了更高可能性，但22%的5年相对存活率可转化为不可接受的局部疾病高死亡率78% (Bilimoria等，2007，Ann Surg246:173-80)。
[0011]胰腺癌最常见的症状包括黄疸、腹痛和体重减轻，它们与其它现有因素一起在性质上是非特异性的。因此，在肿瘤生长的早期诊断胰腺癌通常是困难的，并且需要广泛的诊断性病情检查(diagnostic work-up),通常包括探查手术。内镜超声检查和计算机断层成像是目前可用的最佳无创性胰腺癌诊断方式。然而，小肿瘤的可靠检测，以及来自局灶性胰腺炎的胰腺癌分化是困难的。当肿瘤延伸到被膜的外部侵入周围器官和/或大规模转移时，大多数胰腺癌患者目前在晚期才被诊断出来。(Gold等,2001, Crit.Rev.0ncology/Hematology,39:147-54)。
[0012]当前可用于胰腺癌的治疗程序均不能治愈，或基本上提高存活时间。手术切除是提供存活机会的唯一形式。然而，由于重大的肿瘤负担，仅有10%至25%的患者有机会“根治性切除”。对于那些经历手术治疗的患者，五年存活率仍然很低，平均仅约10%。
[0013]胰腺癌的早期检测和诊断，以及疾病的适当分期将提供更大的存活优势。多个实验室试图根据肿瘤相关标记物向血流的释放，以及活检样品中标记物质的检测开发诊断程序。前面表征的胰腺癌最佳肿瘤相关标记物是CA19.9的免疫测定。该唾液酸化Lea表位结构水平的升高存在于70%的胰腺癌患者中，但不存在于所检查的任何局灶性胰腺炎样品中。然而，CA19.9水平在多种其它恶性和良性病症中被发现升高，目前该测定不能用于诊断。该测定用于监测，术后CA19.9血清水平的持续增加是预后差的指示。多种其它单克隆抗体(MAb)在发育的不同阶段使用免疫测定进行诊断已有所报道。这些包括但不限于:DUPAN2、SPANU B72.3、Ia3 和各种抗 CEA (癌胚抗原或 CEACAM5)抗体。
[0014]抗体，尤其是MAb和工程化抗体或抗体片段，已经广泛测试，并且在各种人类疾病，包括癌症、自体免疫性疾病、感染性疾病、炎性疾病和心血管疾病的检测和治疗中显示出重要性[Filpula and McGuire, Exp.0pin.Ther.Patents (1999) 9:231-245]。抗体或抗体衍生剂的临床应用主要取决于其`结`合到特定疾病相关的特异性靶抗原的能力。选择性对于人类疾病的检测和治疗阶段期间将诊断或治疗剂，例如药物、毒素、细胞因子、激素、激素拮抗剂、酶、酶抑制剂、寡核苷酸、生长因子、放射性核素、血管新生抑制剂或金属递送至靶位置是有价值的，尤其是诊断或治疗剂对体内正常组织有毒的情况下。放射性标记抗体用于多种恶性肿瘤，包括卵巢癌、结肠癌、甲状腺髓样癌和淋巴癌，获得了一些成功。经验证，该技术也可用于胰腺癌。然而，前面报道的抗胰腺癌抗原的抗体迄今未成功用于胰腺癌的有效治疗或早期检测和/或诊断。
[0015]在本领域中，仍然存在与正常胰腺组织和其它正常组织相比，对胰腺癌和其它类型的癌症表现出高选择性的抗体的需要。具体地讲，仍然存在优选地在疾病的最早期作为有效诊断和/或治疗胰腺癌工具的抗体的需要，并且该抗体表现出对靶抗原摄取的增强，对健康个体血液中组分的结合降低，从而在偶联此类抗体时，最佳地保护正常组织和细胞免受毒性治疗剂的侵害。此类抗体用于检测体液尤其是血液中胰腺癌相关抗原，只要该疾病从良性疾病适当分化，即能够改善其早期诊断，并且还可用于监测治疗的响应，还通过指出疾病负担潜在地增强了预后。
[0016]概述[0017]在各种实施方案中，本发明涉及结合胰腺癌细胞，很少结合或不结合正常或非赘生性胰腺细胞的抗体、抗原结合抗体片段和融合蛋白。优选地，抗体结合最早期的胰腺癌，PanIN-1A的检出率为约54%，PanlB为75%并且PanIN-2为86%。更优选地，抗体结合80%至90%或更多的人类侵袭性胰腺癌、导管内乳头状粘液瘤、PanIN-lA, PanIN-1B和PanIN-2病变。最优选地，抗体可区分早期胰腺癌和非恶性病症，例如胰腺炎。此类抗体特别可用于癌症的早期检测和早期胰腺癌和良性胰腺病症之间的鉴别诊断。在优选的实施方案中，此类抗体可用于怀疑患有早期胰腺或某些其它癌症的个体样品的体内或先体外后体内分析。更优选地，抗体可用于通过血清样品的分析检测和诊断早期胰腺癌。
[0018]抗体、抗体片段或融合蛋白可通过用粘蛋白免疫和/或选择来衍生，优选地与人类胰腺癌的粘蛋白反应。因此，抗体、抗体片段和融合蛋白优选地结合胰腺癌细胞相关抗原。更优选地，抗体、抗体片段或融合蛋白可结合胰腺癌中表达的粘蛋白，例如MUCl或MUC5ac。
[0019]在替代实施方案中，抗体、抗体片段或融合蛋白能够结合合成肽序列，例如结合噬菌体展示肽。可结合抗胰腺癌抗体的示例性肽包括但不限于:WTWNITKAYPLP(SEQ ID NO:7)和ACPEffffGTTC(SEQ ID N0:8)。此类合成肽可以是直链的或环状的，并且可以或不可以与抗体竞争结合内源性胰腺癌抗原。合成肽序列某些位置中的氨基酸与其它相比对抗体结合的重要性较小。例如，在SEQ ID NO:7中，肽序列第7、8和11位残基K、A和L在仍然保持抗体结合时可以变化。相似地，在SEQ ID N0:8中，序列第8和9位苏氨酸残基可以变化，但第9位苏氨酸的取代可显著影响抗体结合肽。
[0020]抗体与靶胰腺癌抗原的结合可通过用试剂，例如二硫苏糖醇(DTT)和/或高碘酸盐处理靶抗原来抑制。因此，抗体结合胰腺癌抗原可取决于二硫键的存在和/或靶抗原的糖基化状态。在更优选的实施方案中，主题抗体识别的表位不与其它报道的粘蛋白特异性抗体，例如MA5抗体、CLH2-2抗体和/或45M1抗体交叉反应(参见如Major等,J HistochemCytochem.35:139-48,1987 ;Dion 等，Hybridoma 10:595-610，1991)。
.[0021]主题抗体或片段可以是裸抗体或片段，或优选地偶联至少一种治疗和/或诊断齐U，用于将该试剂递送到靶组织。在替代实施方案中，PAM4抗体或片段可以是双特异性融合蛋白或抗体的部分，该融合蛋白或抗体具有针对靶细胞抗原的第一结合位点和针对半抗原的第二结合位点，所述半抗原偶联可靶向构建体。可靶向构建体可以继而连接至少一种治疗和/或诊断剂，其用于预靶向技术。
[0022]在优选的实施方案中，主题抗体、抗体片段或融合蛋白包含鼠、嵌合、人源化或人PAM4抗体或片段，该抗体或片段包含轻链可变区⑶R序列⑶Rl (SASSSVSSSYLY，SEQID NO:1)、CDR2 (STSNLAS，SEQ ID NO: 2)和 CDR3 (HQWNRYPYT，SEQ ID NO: 3);以及重链可变区 CDR 序列 CDR1(SYVLH，SEQ ID NO: 4)、CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO:5)和CDR3(GFGGSYGFAY，SEQ ID NO:6)。
[0023]特定实施方案可涉及使用鼠PAM4抗体，优选地包含鼠PAM4可变区序列的组合物和方法，如图1A和IB中所公开(SEQ ID N0:10和SEQ ID N0:12)。此类鼠PAM4抗体或片段可用于体外或先体外后体内诊断技术，例如怀疑患有胰腺癌或其它类型癌症的受试者的组织样品的免疫组织化学分析或体液样品的免疫测定。
[0024]其它特定实施方案可涉及使用嵌合PAM4抗体的组合物和方法，所述抗体包含连接到人抗体恒定区序列的鼠可变区序列。优选地，嵌合PAM4抗体或片段包含图2A和2B中示出的cPAM4可变区序列(SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14)。此类嵌合抗体在人类中的免疫原性比鼠抗体低，同时保持了亲本鼠抗体的抗原结合特异性。嵌合抗体是本领域熟知的，可用于诊断和/或治疗癌症。
[0025]其它特定的实施方案可涉及使用人源化PAM4抗体或其片段的组合物和方法，所述抗体或其片段包含如上文所讨论的鼠PAM4MAb的互补性决定区(CDR)和人抗体框架区(FR)以及恒定区序列。在优选的实施方案中，人源化PAM4抗体或其片段的轻链和重链可变区的FR包含至少一个被鼠PAM4MAb的对应FR取代的氨基酸。还更优选地，人源化PAM4抗体或其片段可包含至少选自鼠PAM4重链可变区(图1B，SEQ ID NO: 12)的第5、27、30、38、48、66、67和69位氨基酸残基的氨基酸残基和/或至少一个选自鼠PAM4轻链可变区(图1A，SEQ ID勵:10)的第21、47、59、60、85、87和100位氨基酸残基的氨基酸。最优选地，人源化PAM4抗体或其片段包含图4B的hPAM4VH氨基酸序列(SEQ ID NO: 19)和图4A的hPAM4VK氨基酸序列(SEQ ID NO: 16)。
[0026]在替代实施方案中，抗胰腺癌抗体可以是结合与嵌合PAM4(cPAM4)抗体相同的抗原决定簇(表位)，或与嵌合PAM4 (cPAM4)抗体竞争结合人胰腺粘蛋白的鼠、嵌合、人源化或人抗体。如下文所讨论，cPAM4抗体是包含轻链可变区⑶R序列⑶Rl (SASSSVSSSYLY，SEQID NO:1)、CDR2 (STSNLAS，SEQ ID NO:2)和 CDR3 (HQWNRYPYT，SEQ ID NO:3);以及重链可变区 CDR 序列 CDRl (SYVLH，SEQ ID NO: 4)、CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO:5)和⑶R3 (GFGGSYGFAY，SEQ ID NO:6)的抗体。结合相同抗原决定簇的抗体可通过多种本领域已知的技术识别，例如使用CPAM4抗体作为竞争抗体并且人胰腺粘蛋白作为靶抗原的竞争性结合研究。(参见例如下文实施例1。)阻断(竞争)结合cPAM4抗体的人胰腺粘蛋白的抗体称为交叉阻断抗体。优选地，此类交叉阻断抗体通过与包含人胰腺癌粘蛋白的提取物免疫制备。
[0027]另一个实施方案为癌症细胞靶向诊断免疫偶联物，其包含结合至少一种诊断(或检测)剂的抗胰腺癌抗体、抗体片段或融合蛋白。
`[0028]优选地，诊断剂选自放射性核素、造影剂、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁离子、酶和光敏诊断剂。还更优选地，诊断剂为具有20和4，OOOkeV之间能量的放射性核素，或选自 n0In、mIn、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、9°Y、89Zr、94mTC、94TC、99mTC、1201、
123K124K125K131K 154-158Gd^2p^llc^13N^150^186Re^188Re^51Mn^52mMn^55CoJ2AsJ5Br J6Br^82mRb^
83Sr的放射性核素，或其它γ-、β_或正电子发射体。在特别优选的实施方案中，诊断放射性核素18F用于标记和PET成像，如下文实施例中所描述。18F可通过络合到金属例如铝，然后18F-金属络合物结合偶联至靶蛋白、肽或其它分子的螯合部分而连接抗体、抗体片段或肽。
[0029]另外优选地，诊断剂是顺磁离子，例如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴
(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钦(III)和铒(III)，或不透射线的物质，例如钡、二乙酰氨基三碘苯甲酸盐、乙碘油、柠檬酸镓、碘卡明酸、碘酸胺酸、碘达酸、胆影酸、碘沙酸、碘谷胺、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘丝酸、碘砜葡胺、碘西美酸、碘酞硫、碘替酸、碘他拉酸、碘托西酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸、葡甲胺、甲泛葡胺、甲基泛影酸、丙碘酮和氯化亚铊。[0030]在其它实施方案中，诊断剂是选自异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红素、藻青素、别藻蓝素、邻苯二甲醛和胺荧的荧光标记化合物，选自鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯的化学发光标记化合物，或选自虫荧光素、荧光素酶和水母素的生物荧光化合物。在另一个实施方案中，诊断免疫偶联物用于术中、内镜或血管内肿瘤诊断。
[0031]另一个实施方案是癌症细胞靶向治疗免疫偶联物，其包含结合至少一种治疗剂的抗体或其片段或融合蛋白。优选地，治疗剂选自放射性核素、免疫调节剂、激素、激素拮抗齐U、酶、寡核苷酸例如反义寡核苷酸或siRNA、酶抑制剂、光敏治疗剂、细胞毒素剂例如药物或毒素、血管新生抑制剂和促凋亡剂。在其中使用多于一种治疗剂的实施方案中，治疗剂可包括多份相同的治疗剂或者不同治疗剂的组合。
[0032]在一个实施方案中，寡核苷酸例如美国专利号5，734，033(其实施例部分以引用的方式并入本文)中所描述抑制bcl-2表达的反义分子或SiRNA，可以偶联到或形成免疫偶联物或抗体融合蛋白的治疗剂部分。或者，寡核苷酸可与裸的或偶联的抗胰腺癌抗体或抗体片段，例如PAM4抗体同时或顺序施用。在优选的实施方案中，寡核苷酸是定向抗癌基因或癌基因产物，例如bcl-2、p53、ras或其它熟知癌基因的反义寡核苷酸。
[0033]在优选的实施方案中，治疗剂是细胞毒素剂，例如药物或毒素。另外优选地，药物选自氮芥、氮丙啶衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲、吉西他滨、三氮烯、叶酸类似物、蒽环、紫杉烷、C0X-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼白毒素、钼配位络合物、长春花生物碱、取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮抑素、紫杉酚、喜树碱、SN-38、多柔比星及其类似物、抗代谢物、烷基化剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成齐U、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、热激蛋白(HSP90)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、HDAC抑制齐U、促凋亡剂、甲氨蝶呤、CPT-1l以及它们的组合。
[0034]在另一个优选的实施方案中，治疗剂是选自蓖麻毒、相思子毒素、α毒素、肥皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶1、葡萄球菌肠毒素-Α、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假.单胞菌内毒素以及它们的组合的毒素。或选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、干细胞生长因子、促红细胞生成素、促血小板生成素以及它们的组合的免疫调节剂。
[0035]或者，治疗剂是选自苹果酸脱氢酶、金黃色葡萄球菌核酸酶、δ -V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α -甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β -半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶的酶。此类酶可以例如与前药组合使用，所述前药以相对无毒形式施用，并且在靶位点通过酶转化为细胞毒素剂。在其它供选择的替代方案中，药物可通过受试者中的内源性酶转化为毒性较小的形式，但可通过治疗酶再转化为细胞毒性形式。
[0036]其它治疗剂包括放射性核素，例如14C、13N、150、32P、33P、47Sc、51Cr、57Co、58Co、59Fe、62Cu、67Cu、67Ga、67Ga、75Br、75Se、75Se、76Br、77As、77Br、80mBr、89Sr、90Y、95Ru、97Ru、99Mo、99mTc、103mRh、103Ru, 105Rh, 105Ru,107Hg, 109Pd, 109Pt, 111Ag,111In,113mIn, 119Sb, 121mTe, 122mTe, 1251 , 125mTe, 1261,131I,1331 , 142Pr, 143Pr, 149Pm, 152Dy, 153Sm, 161Ho, 161Tb, 165Tm, 166Dy, 166Ho, 167Tm, 168Tm, 169Er, 169Yb, 177Lu,186Re,188Re,189mOs,189Re,192Ir,194Ir, 197Pt,198Au,199Au,199Au,201TU 203Hg,211At,211Bi,211Pb,212Bi,212Pb,213Bi,215Po,217At,219Rn,221Fr,223Ra^224Ac,225Ac 或 255Fm0[0037]还设想了多价、多特异性抗体或其片段，其包含至少一个对PAM4靶抗原具有亲和力的结合位点以及一个或多个对半抗原分子具有亲和力的半抗原结合位点。优选地，抗体或其片段是嵌合、人源化或完全人抗体或其片段。半抗原分子可偶联到可靶向构建体，用于递送一种或多种治疗和/或诊断剂。在某些优选的实施方案中，多价抗体或其片段可通过对接-锁定(DNL)技术制备，如下文实施例中所描述。包含hPAM4抗体片段的示例性DNL构建体指定为TF10,如下文所述。
[0038]还设想了双特异性抗体或其片段，其包含至少一个对PAM4靶抗原具有亲和力的结合位点，以及至少一个对选自如下的可靶向构建体/偶联物具有亲和力的结合位点:
[0039]DOTA-D-Asp-D-Lys (HSG)-D-Asp-D-Lys (HSG)-NH2 (MP271)；
[0040]DOTA-D-Glu-D-Lys (HSG)-D-Glu-D-Lys (HSG)-NH2 (MP277)；
[0041 ] DOTA-D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2 (IMP288)；
[0042]DOTA-D-Ala-D-Lys (HSG)-D-Glu-D-Lys (HSG)-NH2 (MP0281)；
[0043]NOTA-1TC 苄基-D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -NH2 (IMP449)；
[0044]NODA-Ga-D-Ala-D-Lys (HSG)-D-Tyr-D-Lys (HSG)-NH2 (MP460)；
[0045]NOTA-D-Ala-D-Lys (HSG)-D-Tyr-D-Lys (HSG)-NH2 (MP461)；
[0046]NOTA-D-Asp-D-Lys (HSG)-D-Tyr-D-Lys (HSG)-NH2 (MP462)；
[0047]NOTA-D-Ala-D-Lys (HSG)-D-Tyr-D-Lys (HSG)-NH2 (MP465)；
[0048]C-NETA-琥珀酰 _D_Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -NH2 (IMP467)；
[0049]S-NETA-D-Lys (HSG)-D-Tyr-D-Lys (HSG)-NH2 (MP469);以及
[0050]L-NETA-琥珀酰-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -NH2 (IMP470)
[0051]它们能够运送至少一种诊断和/或治疗剂。其它适用的可靶向构建体例如在美国专利号 6，576，746,6,962，702,7, 052，872,7, 138，103,7, 172，751,7, 405，320,7, 597，876、7，563，433,7, 993，626以及提交于2009年4月30日的美国专利申请序列第12/433，212号、提交于2009年6月17日的美国专利申请序列第12/485，998号、提交于2009年8月14日的美国专利申请序列第12/541，527号和提交于2010年12月I日的美国专利申请序列第12/958，889号中有所公开，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文。
[0052]其它实施方案涉及包含至少两种本文所述的抗胰腺癌抗体及其片段的融合蛋白。或者，融合蛋白或其片段可包含至少一个第一抗胰腺癌抗体或其片段以及至少一个第二 MAb或其片段。优选地，第二 MAb结合肿瘤相关抗原，例如选自CA19.9、DUPAN2、SPANUNd2、B72.3、CC49、CEA (CEACAM5)、CEACAM6、Lea、路易斯抗原 Le (y)、CSAp、胰岛素样生长因子(IGF)、上皮糖蛋白-1 (EGP-1)、上皮糖蛋白-2(EGP-2)、CD-80、胎盘生长因子(PlGF)J^酸酐酶IX、腱生蛋白、IL-6、HLA-DR、CD40、CD74 (如，米拉珠单抗)、CD138 (多配体蛋白聚糖-1)、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC16、MUC17、TAG-72, EGFR、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管生成因子(如，VEGF和P1GF)、癌基因(如，bcl-2, Kras、p53)的产物、cMET、HER2/neu以及胃癌和结肠直肠癌相关抗原。抗体融合蛋白或其片段还可包含至少一种诊断和/或治疗剂。
[0053]本文还描述了包含编码如本文所述的抗胰腺癌抗体、融合蛋白、多特异性抗体、双特异性抗体或其片段的核酸的DNA序列。其它实施方案涉及包含抗体编码DNA序列的表达载体和/或宿主细胞。在某些优选的实施方案中，宿主细胞可以是转化有突变Bcl-2基因，例如三突变Bcl-2基因(T69E、S70E、S87E)的Sp2/0细胞系，其适于在无血清培养基中进行细胞转化和生长。(参见如美国专利号7，531，327、7，537，930和7，608，425，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文。)
[0054]另一个实施方案涉及将诊断或治疗剂或它们的组合递送至靶标的方法，包括(i)提供组合物，该组合物包含抗胰腺癌抗体或片段，例如PAM4抗体或片段，所述抗体或片段偶联至少一种诊断和/或治疗剂，以及(ii)给需要其的受试者施用本文要求保护的任何一种抗体、抗体片段或融合蛋白的诊断或治疗偶联物。
[0055]还设想了将诊断剂、治疗剂或它们的组合递送至靶标的方法，包括:(a)给受试者施用任何一种对PAM4抗原具有亲和力，并且包含一个或多个半抗原结合位点的多价、多特异性或双特异性抗体或其片段；(b)等待足量的时间，使未结合PAM4抗原的抗体清洁受试者的血流；以及(c)给所述受试者施用包含诊断剂、治疗剂或它们的组合的载体分子，所述载体分子结合抗体的结合位点。优选地，载体分子结合多于一个抗体的结合位点。
[0056]本文描述了诊断或治疗癌症的方法，包括:(a)给受试者施用任何一种对PAM4抗原具有亲和力，并且包含一个或多个半抗原结合位点的本文要求保护的多价、多特异性抗体或其片段；(b)等待足量的时间，使大量未结合的抗体清洁受试者的血流；以及(c)给所述受试者施用包含诊断剂、治疗剂或它们的组合的载体分子，所述载体分子结合抗体的结合位点。在优选的实施方案中，癌症是胰腺癌。另外优选地，方法可用于病变组织的术中识别、病变组织的内镜识别或病变组织的血管内识别。
[0057]另一个实施方案是治疗受试者中恶性肿瘤的方法，包括给所述受试者施用治疗有效量的结合PAM4抗原，任选地偶联到至少一种治疗剂的抗体或其片段。或者，抗体或其片段可以是裸抗体或其片段。在更优选的实施方案中，抗体或片段在如上所述的另一种治疗剂的施用之前、同时或之后施用。
[0058]本文设想了诊断受试 者中恶性肿瘤，尤其是胰腺癌的方法，包括(a)给所述受试者施用包含结合PAM4抗原的抗体或其片段的诊断偶联物，其中所述MAb或其片段偶联至少一种诊断剂，以及(b)检测结合到胰腺癌细胞或其它恶性细胞的标记抗体的存在，其中抗体的结合作为胰腺癌或另一种恶性肿瘤的存在的诊断。在优选的实施方案中，抗体或片段结合胰腺癌，不结合正常胰腺组织、胰腺炎或其它非恶性病症。在次优选的实施方案中，与非恶性细胞相比，抗体或片段以显著较高的水平结合癌症细胞，以允许鉴别诊断癌症与非恶性病症。在最优选的实施方案中，诊断剂可以是通过PET成像检测的F-18标记分子。
[0059]在更优选的实施方案中，抗胰腺癌抗体，例如hPAM4抗体的使用允许在恶性疾病的最早期以高特异性和灵敏度检测和/或诊断胰腺癌。优选地，诊断抗体或片段能够标记至少70%、更优选地至少80%、更优选地至少90%、更优选地至少95%、最优选地约100%的高度分化、中度分化和低度分化的胰腺癌以及90%或更多的侵袭性胰腺癌。所用的抗胰腺癌抗体优选地能够检测85%或更多的？&11爪-认、？&11爪-18、？&11爪-2、1?丽和]\?^癌前病变。最优选地，使用抗胰腺癌抗体的免疫测定能够检测89%或更多的总PanIN、86%或更多的IPMN以及92%或更多的MCN。
[0060]一个替代实施方案是通过体外分析血液、血浆或血清样品检测PAM4抗原和/或诊断个体中胰腺癌的方法。优选地，样品经过使用有机溶剂例如丁醇进行有机相萃取，然后加工以供使用抗胰腺癌抗体，例如PAM4抗体进行免疫检测。在有机相萃取后，使用本领域已知的任何多种免疫测定技术，例如ELISA、夹心免疫测定、固相RIA和类似技术对萃取的水相分析样品中PAM4抗原的存在。出乎意料的是，有机相萃取导致结合其靶抗原的PAM4抑制剂的移除，允许检测新鲜血清样品中的PAM4靶抗原。更出乎意料的是，使用本文所述的体外分析技术，可分析血清样品以在胰腺癌的最早期检测和/或诊断受试者中的胰腺癌。这些意料不到的结果提供了基于血清的第一检测技术，以诊断早期胰腺癌的存在。
[0061]另一个实施方案是治疗受试者中癌症细胞的方法，包括给所述受试者施用包含结合PAM4抗原的裸抗体或其片段或裸抗体融合蛋白或其片段的组合物。优选地，所述方法还包括施用选自 CA19.9、DUPAN2、SPANl、Nd2、B72.3、CC49、抗 CEA、抗 CEACAM6、抗 EGP-1、抗EGP-2、抗 Lea、路易斯抗原 Le (y)限定的抗体，以及抗 CSAp、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC16、MUC17、TAG-72、EGFR、CD40、HLA-DR、CD74、CD138 抗体、血管生成因子(如，VEGF 和胎盘样生长因子(PlGF))、胰岛素样生长因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生长因子、IL-6、癌基因的产物、cMET和HER2/neu的第二裸抗体或其片段。
[0062]其它实施方案涉及诊断受试者中恶性肿瘤的方法，包括(i)使用包含结合PAM4抗原的抗体或其片段的组合物对来自所述受试者的样品进行体外诊断测定；以及(ii)检测结合到样品中的恶性细胞的抗体或片段的存在。优选地，恶性肿瘤是癌症。更优选地，癌症是胰腺癌。
[0063]附图简述
[0064]图1.鼠PAM4抗体的可变区cDNA序列和推导氨基酸序列。图1A示出了鼠PAM4Vk的 DNA(SEQ ID NO:9)和氨基酸(SEQ ID NO: 10)序列。图1B 示出了鼠 PAM4VH 的 DNA(SEQID NO: 11)和氨基酸(SEQ ID NO: 12)序列。对应DNA序列编码的氨基酸序列在如下核苷酸序列中以一字母编码给出。核苷酸序列的编号在右侧。CDR区域中的氨基酸残基以粗体和下划线示出。Kabat Ig分子编号用于上述氨基酸残基编号所示出的氨基酸残基。一字母编号的氨基酸残基为Kabat编号 方案定义的插入残基。插入残基具有前面的数字与前面的残基相同。例如，图1B中的残基82、82A、82B和82C分别以82、A、B和C表示。
[0065]图2.在Sp2/0细胞中表达的嵌合PAM4(cPAM4)重链和轻链可变区的氨基酸序列。图2A示出了 cPAM4Vk的氨基酸序列(SEQ ID NO: 13)。图2B示出了 cPAM4VH的氨基酸序列(SEQ ID N0:14)。序列以一字母编码给出。CDR区域中的氨基酸残基以粗体和下划线示出。氨基酸的编号与图1中相同。
[0066]图3.人抗体PAM4和hPAM4的重链和轻链可变区的氨基酸序列的比对。图3A示出了人抗体 Walker (SEQ ID NO: 15)与 PAM4(SEQ ID NO: 10)和 hPAM4(SEQ ID NO: 16)的 Vk氨基酸序列比对，图3B示出了人抗体Wil2(FRl-3) (SEQ ID NO: 17)和NEWM(FR4) (SEQ IDN0:18)与 PAM4(SEQ ID NO: 12)和 hPAM4 (SEQ ID NO: 19)的 Vh 氨基酸序列比对。点表示与人或人源化抗体的对应残基相同的PAM4残基。方块区域代表CDR区域。hPAM4的N-和C-末端残基二者(下划线)均通过所用的分期载体固定。与图1中相同，Kabat Ig分子编号方案用于对残基编号。
[0067]图4.在Sp2/0细胞中表达的人源化PAM4 (hPAM4)重链和轻链可变区的DNA和氨基酸序列。图4A示出了 hPAM4VK的DNA(SEQ ID NO:20)和氨基酸(SEQ ID NO: 16)序列，图4B示出了 hPAM4VH的DNA(SEQ ID N0:21)和氨基酸(SEQ ID NO: 19)序列。核苷酸序列的编号在右侧。对应DNA序列编码的氨基酸序列以一字母编码给出。CDR区域中的氨基酸残基以粗体和下划线示出。与图1A和图1B中相同，Kabat Ig分子编号方案用于氨基酸残基。
[0068]图5.人源化PAM4抗体、hPAM4与嵌合PAM4、cPAM4的结合活性比较。hPAM4以菱形示出，cPAM4以闭环示出。结果表明了与125I_cPAM4竞争结合CaPanl抗原时，hPAM4抗体和cPAM4的可比结合活性。
[0069]图6.用分次9°Y_hPAM4加上吉西他滨治疗患有不宜手术的转移性胰腺癌的患者的治疗前(左侧)和治疗后(右侧)PET/CT合并图像。圆圈表示原发病变部位，其示出治疗后PET/CT强度的显著降低。
[0070]图7.用分次9°Y_hPAM4加上吉西他滨治疗患有不宜手术的转移性胰腺癌的患者的治疗前(左侧)和治疗后(右侧)3D PET图像。箭头指出了原发病变(右侧)和转移(左侧)的部位，每个部位示出放射性标记hPAM4加上吉西他滨治疗后PET图像强度的显著降低。
[0071]图8.使用具有或不具有预靶向TFlO双特异性抗胰腺癌粘蛋白抗体的111In-标记diHSG肽(IMP288)进行的肿瘤体内成像。图8A-示出肿瘤部位(箭头)的小鼠。图8B示出了存在(上图)或不存在(下图)TF10双特异性抗体的情况下使用111In-标记MP288检测的肿瘤。
[0072]图9.TF10、PAM4-1gG、PAM4-F (ab，) 2 和一价 bsPAM4 化学偶联物(PAM4_Fab，X 抗DTPA-Fab')的示例性结合曲线。靶粘蛋白抗原的结合通过ELISA测定测量。
[0073]图10.CaPanl人胰腺癌异种移植物(?0.25g)的免疫闪烁成像。(A)注射双特异性 TFlO (80 μ g、5.07X 10_lclmol)16h 后施用 luIn-1MP-288 (30 μ Ci,5.07X l(Tnmol)的小鼠的图像。图像在3h后采集。增加图像背景的强度，以便与mIn-MP-288单独施用(30yC1、5.07X 10_nmol)时获得的图.像强度匹配。⑶单独给予mIn-MP_288的小鼠中未观察到靶向。(C)给予mIn-D0TA-PAM4-1gG (20 μ C1、50 μ g)，并且在24h后成像得到的小鼠图像。虽然肿瘤不可见，但该时间点仍然存在明显的背景活性。
[0074]图11.具有CaPanl人胰腺癌异种移植物(预靶向和IgG组动物的平均肿瘤重量+/_标准偏差分别为 0.28+/-0.21 和 0.10+/-0.06)的裸鼠中 mIn-D0TA-PAM4-1gG(20 μ C1、50 μ g)和 TFlO 预靶向 mIn-MP-288 (80 μ g、5.07X 10_lclmol TF10，16h 后为 30 μ C1、
5.07X 10_11molinIn-1MP-288)的延伸生物分布
[0075]图 12.0.15mCi90Y-hPAM4IgG 或 0.25 或 0.50mCi TFlO 预靶向 9ciY-MP-288 建立的(?0.4cm3)CaPanl肿瘤的单次治疗的治疗活性。
[0076]图13.PT-RAIT治疗的吉西他滨增强效应。
[0077]图14.西妥昔单抗与吉西他滨和PT-RAIT组合的效应。
[0078]图15.使用基于PAM4的免疫测定进行的胰腺癌鉴别诊断。水平线示出了基于ROC分析的选择阳性结果的截止水平。
[0079]图16.健康志愿者和不同期胰腺癌个体的患者血清中PAM4抗原的频率分布。
[0080]图17.PAM4血清免疫测定的ROC曲线，其示出检测灵敏度为81.6%，特异性为84.6%ο
[0081]图18.PAM4-免疫测定的准确度确定为在等于或大于2.40单位/mL的截止值下检测的标称浓度的10%内。线性趋势使用方程y=0.965X+0.174计算，适合度r2=0.999。
[0082]图19.疾病分期患者血清中PAM4-活性抗原的频率分布。截止值=2.4单位/mL(水平线)。其示出了每个研究组的中值(单位/mL)。
[0083]图20.基于PAM4的免疫测定表现的接收者操作特征(ROC)曲线；胰腺癌与健康成体。其提供了曲线下面积(AUC)值和95%置信界限。
[0084]图21.在使用9°Y-PAM4_IgG加上吉西他滨治疗后，肿瘤体积(CT)的发展/退化相关的循环PAM4抗原水平。(A)患者076-001响应治疗，血清PAM4抗原减少。(B)患者1810002显示出对治疗的初始响应，然后肿瘤复发。肿瘤体积相关的血清PAM4水平。
[0085]图22.在存在或不存在棕榈酸的情况下，PAM4与粘蛋白标准物的反应性。
[0086]详述
[0087]定义
[0088]除非另外指明，“一个(种)”意指一个(种)或多个(种)。
[0089]如本文所用，“约”意指加或减10%。例如，“约100”可包括90和110之间的任何数字。
[0090]如本文所述，术语“PAM4抗体”包括鼠、嵌合、人源化和人PAM4抗体。在优选的实施方案中，PAM4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的⑶R序列。
[0091]如本文所用，“PAM4抗原”是PAM4抗体结合的抗原。在优选的实施方案中，用DTT或高碘酸盐处理PAM4抗原抑制或防止了 PAM4抗体的结合。在更优选的实施方案中，PAM4抗原是胰腺癌细胞表达的粘蛋白，例如MUCl或MUC5的表位。
[0092]如本文所用，“抗胰腺`癌抗体”是表现出与PAM4抗体相同诊断、治疗和结合特性的抗体。在优选的实施方案中，“抗胰腺癌抗体”结合与PAM4抗体相同的表位。
[0093]“非内分泌性胰腺癌”通常是指外分泌胰腺产生的癌症。该术语排除了胰岛素瘤，包括胰腺恶性肿瘤、胰腺癌、腺鳞癌、鳞状上皮细胞癌和巨细胞癌和癌前病变，例如胰腺上皮内瘤(PanIN)、粘液性囊性肿瘤(MCN)和胰腺内粘液性肿瘤(IPMN)，它们是赘生性但不是恶性的。术语“胰腺癌”和“非内分泌性胰腺癌”在本文中可互换使用。
[0094]如本文所述，抗体是指全长(S卩，天然存在的或正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，如抗体片段。
[0095]抗体片段是抗体的部分，例如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、sFv等等。无论结构如何，抗体片段结合全长抗体识别的相同抗原。术语“抗体片段”还包括由抗体的可变区组成的分离片段，例如由重链和轻链可变区和重组单链多肽分子组成的"Fv"片段，其中轻链和重链可变区通过肽连接基连接(“ scFv蛋白”)。
[0096]裸抗体是未偶联治疗或诊断剂的抗体或其片段。一般来讲，抗体分子的Fe部分提供效应子功能，例如补体介导的细胞毒性(CDC)和ADCC (抗体依赖性细胞毒性)，其机制作用可导致细胞裂解。然而，Fe部分可以不需要治疗功能通过其它机制，例如信号转导诱导的细胞凋亡发挥作用。裸抗体包括多克隆和单克隆抗体二者，以及融合蛋白以及某些重组抗体，例如嵌合、人源化或人抗体。
[0097]嵌合抗体是包含可变区的重组蛋白，所述可变区包括来源于一个物种的抗体，优选地啮齿动物抗体的互补性决定区(CDR)，而抗体分子的恒定区来源于那些人抗体。对于兽医应用，嵌合抗体的恒定区可以来源于其它物种，例如猫或狗的恒定区。
[0098]人源化抗体是其中来自一个物种的抗体，如啮齿动物抗体的CDR从啮齿动物抗体的重链和轻链可变区转移到人重链和轻链可变区(如，框架区序列)的重组蛋白。抗体分子的恒定区来源于那些人抗体。在某些实施方案中，来源于亲本(啮齿动物)抗体的有限数量框架区氨基酸残基可以取代为人抗体框架区序列。
[0099]人抗体是例如转基因小鼠经过“工程化”改造，以响应抗原激发生成特定的人抗体而获得的抗体。在该技术中，人重链和轻链基因座的元件引入来源于包含内源性鼠重链和轻链基因座的靶向断裂的胚胎干细胞系的小鼠品系。转基因小鼠可合成对特定抗原具有特异性的人抗体，并且小鼠可用于生成人抗体分泌杂交瘤。从转基因小鼠获得人抗体的方法在 Green 等，Nature Genet.7:13 (1994)，Lonberg 等，Nature368:856 (1994)和 Taylor 等，Int.1mmun.6:579(1994)中有所描述。完全人抗体还可通过基因或染色体转染方法，以及噬菌体展示技术构建，所有方法均为本领域已知的。关于从未免疫供体的免疫球蛋白可变区基因谱系体外生成人抗体及其片段，参见例如McCafferty等，Nature348:552-553 (1990)。在该技术中，抗体可变区基因入框克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因，并且在噬菌体颗粒表面上显 示为功能抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以根据抗体功能性质的选择还致使编码表现那些性质的抗体的基因选择。这样，噬菌体模拟了 B细胞的一些性质。噬菌体展示可以多种形式进行，参见例如Johnson andChiswell,Current Opinion in Structural Biology3:5564-571 (1993)。人抗体也可通过体外活化B细胞来生成。参见美国专利号5，567，610和5，229，275，其实施例部分以引用的方式并入本文。
[0100]治疗剂是单独、与抗体部分同时或顺序施用，或偶联到抗体部分，即抗体或抗体片段或亚片段的化合物、分子或原子，可用于疾病的治疗。治疗剂的例子包括抗体、抗体片段、细胞毒素剂、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、促凋亡剂、抗血管生成剂、硼化合物、光敏剂或染料和放射性同位素。所用的治疗剂在下文更详细地描述。
[0101]诊断剂是可偶联到抗体部分或可靶向构建体施用的分子、原子或其它可检测部分，用于通过定位包含靶抗原的细胞检测或诊断疾病。可用的诊断剂包括但不限于:放射性同位素、染料、造影剂、荧光化合物或分子以及用于磁共振成像(MRI)或正电子发射断层显像(PET)扫描的增强剂(如，顺磁离子)。优选地，诊断剂选自放射性同位素、用于磁共振或PET成像的增强剂和荧光化合物。为了使放射性金属、顺磁离子或其它诊断阳离子加载到抗体组分，将其与具有长尾的试剂反应是必须的，用于结合离子的多配位螯合基团结合到所述长尾。此类尾巴可以是聚合物，例如聚赖氨酸、多糖或其它具有侧基的衍生或可衍生链，螯合基团例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、D0TA、ΝΟΤΑ、ΝΕΤΑ、卩卜啉、聚胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟以及已知可用于此目的的类似基团可结合到所述侧基。螯合物使用标准化学反应连接到抗体。螯合物通常通过基团连接到抗体，该基团能够与分子形成免疫反应性损失最小并且聚集和/或内部交联最小的键。将螯合物偶联到抗体的其它更为不同寻常的方法和试剂在美国专利号4，824，659中有所公开，该专利的实施例部分以引用的方式并入本文。特别有用的金属-螯合物组合包括2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物，可与60至4，OOOkeV的通用能量范围内的诊断同位素，例如1251、1311、1231、1241、62Cu、64Cu、18F、mIn、67Ga、68Ga、99mTC、94mTC、nC、13N、150、76Br —起用于放射性成像。当与本发明的抗体一起使用时，相同的螯合物与非放射性金属，例如锰、铁和钆络合用于MRI。大环螯合物例如NOTA (1，4，7-三氮杂环壬烷州，^，^’-三乙酸)、00丁八(1，4，7，10-四氮杂环十二烷四乙酸)和TETA (对溴乙酰胺基-苄基-四乙胺四乙酸)可与多种金属和放射性金属，最特别地分别与放射性核素镓、钇和铜一起使用。此类金属-螯合物络合物可通过定制环大小，使其适合所关注的金属来保持稳定。本发明还涵盖其它环型螯合物，例如大环聚醚，它是所关注的，可稳定地结合核素，例如223Ra以用于放射性免疫治疗(RAIT)。最近，通过PET成像使用的18F原子实际上标记任何分子的通用技术在美国专利号7，563，433,7, 597，876和7，993，626中有所描述，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文。
[0102]免疫偶联物是与至少一种治疗和/或诊断剂偶联的抗体、抗体片段或抗体融合蛋白。诊断剂和/或治疗剂如上文所定义。
[0103]表达载体是包含在宿主细胞中表达的基因的DNA分子。通常，基因表达在某些调控元件，包括组成型或诱导型启动子，组织特异性调控元件和增强子的控制下进行。此类基因被认为“操作性地连接至”调控元件。
[0104]重组宿主可以是包含克隆载体或表达载体的任何原核或真核细胞。该术语还包括那些原核或真核细胞，以及经遗传工程改造，宿主细胞的染色体或基因组中包含克隆基因的转基因动物。合适的哺乳动物宿主细胞包括骨髓瘤细胞，例如SP2/0细胞和NSO细胞，以及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、杂交瘤细胞系以及用于表达抗体的其它哺乳动物宿主细胞。转染有凋亡抑制剂，例如Bcl-EEE基因，适于生长并且在无血清条件下进一步转染的Sp2/0细胞也尤其可用于表达mAb和其它融合蛋白，如美国专利号7，531，327,7, 537，930和7，608，425中所描述，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文。
[0105]PAM4 抗体
[0106]本发明的各种实施方案涉及相对于正常或良性胰腺组织，与胰腺癌的反应具有非常高选择性的抗体。抗胰腺癌抗体及其片段优选地通过抗来自人胰腺肿瘤的粗制粘蛋白制剂生成，但可利用部分纯化或甚至纯化的粘蛋白。此类抗体的非限制性实例是PAM4抗体。
[0107]鼠PAM4 (mPAM4)抗体`利用来源于异种移植的RIP-1人胰腺癌的胰腺癌粘蛋白作为免疫原开发(Gold等，Int.J.Cancer, 57:204-210,1994)。如下文所讨论,抗体交叉反应和免疫组织化学染色研究表明PAM4抗体识别靶胰腺癌抗原上独特的新表位。免疫组织化学染色研究，例如实施例2中所描述的那些，显示PAM4MAb结合到乳腺、胰腺和其它癌症细胞表达的抗原，与正常人组织的结合有限。然而，最高表达通常由胰腺癌细胞实现。因此，PAM4抗体对胰腺癌具有相对特异性，并且优选地结合胰腺癌细胞。PAM4抗体对可内化的靶表位具有活性。该表位主要通过胰腺癌相关抗原表达，并且不在局灶性胰腺炎或正常胰腺组织中表达。PAM4抗体与PAM4表位的结合受到DTT或高碘酸盐处理抗原的抑制。使用动物模型中放射性标记PAM4MAb的定位和治疗研究展示了肿瘤靶向和治疗功效。
[0108]PAM4抗体结合PAM4抗原，该抗原通过多个器官和肿瘤类型表达，但优选地在胰腺癌细胞中表达。使用PAM4MAb的研究，例如在实施例3中，表明抗体表现出多种重要性质，使其成为临床诊断和治疗应用的良好候选物。PAM4抗原提供了胰腺和其它癌症诊断和治疗的有用靶标。PAM4抗体明显识别的胰腺癌抗原表位不同于非PAM4抗胰腺癌抗体(如，CA19.9、DUPAN2、SPANl、Nd2、CEACAM5、B72.3、抗Lea和其它抗路易斯抗原)识别的表位。
[0109]出乎意料的是，下面的实施例表明PAM4抗原以可检测的浓度存在于非常早期胰腺癌患者的血清中。还出乎意料的是，据显示结合PAM4抗原的PAM4抗体的内源性抑制剂存在于新鲜人血清中。抑制剂通过血清样品的长期冷冻储存，或通过新鲜血清的有机相萃取移除。这些意料不到的结果提供了相对非侵入式的使用血液、血清或血浆样品的早期胰腺癌检测测试的基础。在替代实施方案中，PAM4抗体可以单独，或者结合一种或多种其它抗体，例如CA19.9抗体使用，以检测血清中的胰腺癌标记物。
[0110]对于治疗使用，适于与PAM4抗体组合或联合使用的抗体包括例如抗体CA19.9、DUPAN2、SPANl、Nd2、B72.3、CC49、抗 CEA、抗 CEACAM6、抗 Lea、抗 HLA-DR、抗 CD40、抗 CD74、抗⑶138以及路易斯抗原Le (y)定义的抗体，或抗结肠特异性抗原_p (CSAp)、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC16、MUC17、EGP-1、EGP-2、HER2/neu、EGFR、血管生成因子(如，VEGF和P1GF)、胰岛素样生长因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生长因子和IL-6，以及癌基因(bcl-2,Kras,p53)的产物、cMET抗体和抗肿瘤坏死物质抗体,例如在Epstein等的专利(美国专利号6，071，491,6.017，514,5, 019，368和5，882，626)中有所描述。此类抗体可用于补充PAM4抗体免疫检测和免疫治疗方法。在PAM4抗体施用前、同时或施用后，这些和其它治疗剂可与抗胰腺癌抗体，例如PAM4抗体协同作用。
[0111]在治疗应用中，竞争或拮抗参与针对肿瘤细胞的效应子细胞功能的免疫调节剂的抗体也可结合单独的PAM4抗体或与其它肿瘤相关抗体组合使用，一个例子是抗CD40抗体。Todryk 等，J.Tmmunol Methods, 248:139-147 (2001) ；Turner 等，J.1mmunol,166:89-94(2001)。另外使用的是抗标记物或癌基因(如，bcl_2、Kras、p53、cMET)产物抗体，或抗血管生成因子，例如VEGFR和胎盘样生长因子(PlGF)抗体。
[0112]其它结合PAM4抗原的不同表位的PAM4样抗体的可用性对于开发双决定簇酶联免疫吸附测定(ELISA)，用于检测临床样品中的PAM4抗原是重要的。ELISA实验在实施例1和5中有所描述。
[0113]本文所述的鼠、嵌合、人源化和完全的人PAM4抗体及其片段是用于诊断和/或治疗方法的抗胰腺癌抗体的示例。下文的实施例公开了构建和使用人源化PMA4抗体的优选实施方案。因为非人单克隆抗体可被人宿主识别为外源蛋白质，并且重复注射可对过敏反应有害，所以鼠抗体序列的人.源化可减少患者经历的有害免疫应答。对于基于鼠的单克隆抗体，这通常称为人抗鼠抗体(HAMA)应答。优选地，人源化抗胰腺癌抗体或其片段框架区中一些人的残基被鼠的对应物取代。来自两个不同人抗体的框架序列组合用于Vh也是优选的。抗体分子的恒定区来源于那些人抗体。
[0114]抗体制备
[0115]特定抗原的单克隆抗体可通过本领域的技术人员已知的方法获得。参见例如Kohler and Milstein，Nature256:495 (1975)和 Coligan 等(编辑)，CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY,第 I 卷，第 2.5.1-2.6.7 页(John Wiley&Sonsl991)(下文称为"Coligan")。简而言之，抗胰腺癌MAb可通过如下步骤获得:用包含来自胰腺癌的粘蛋白的组合物，例如PAM4抗原注射小鼠，通过移除血清样品确认抗体产物的存在，移除脾脏以获得B-淋巴细胞，将B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合生成杂交瘤，克隆杂交瘤，选择生成抗PAM4抗原的抗体的阳性克隆，培养生成抗PAM4抗原的抗体的克隆，以及分离来自杂交瘤培养物的抗胰腺癌抗体。或者，可制备抗PAM4的抗ID抗体，并且用于诱导抗PAM4抗原的抗体，或筛选库，例如结合与PAM4相同的抗原决定簇的克隆的噬菌体展示抗体库。制备抗个体基因型抗体的方法是本领域熟知的(参见例如美国专利号4，624，846,4, 661，586,7, 115，715,7, 413，736、7，611，894)。[0116]在初始生成抗免疫原的抗体后，可对抗体测序，随后通过重组技术制备，以生成嵌合或人源化抗体。鼠抗体和抗体片段的嵌合是本领域的技术人员熟知的。来源于嵌合单克隆抗体的抗体组分的使用减少了鼠恒定区免疫原性相关的潜在问题。
[0117]克隆鼠免疫球蛋白可变区的通用技术在例如出版物Orlandi等，Proc Nat’IAcad.Sc1.USA86:3833 (1989)中有所描述，该文献以引用的方式并入本文。一般来讲，鼠抗体的\ (可变轻链)和Vh (可变重链)序列可通过多种分子克隆程序，例如RT-PCR、5’ -RACE和cDNA文库筛选获得。具体地讲，鼠PAM4MAb的Vh和Vk序列由PCR扩增从杂交瘤细胞通过RT-PCR克隆，其序列通过DNA测序确定。为了确认其可靠性，克隆的Vk和Vh基因可在细胞培养中作为嵌合 Ab 表达，如 Orlandi 等(Proc Natl.Acad.Sc1.，USA，86:3833，1989)所述。
[0118]在优选的实施方案中，嵌合PAM4抗体或抗体片段包含鼠PAM4MAb的互补性决定区(CDR)和框架区(FR)以及人抗体的轻链和重链恒定区，其中嵌合PAM4的轻链可变区CDR包含具有氨基酸序列SASSSVSSSYLY(SEQ ID NO:1)的CDR1、具有氨基酸序列STSNLAS (SEQID NO: 2)的 CDR2 和具有氨基酸序列 HQWNRYPYT(SEQ ID NO: 3)的 CDR3 ;并且嵌合 PAM4MAb的重链可变区⑶R包含具有氨基酸序列SYVLH(SEQ ID N0:4)的⑶R1、具有氨基酸序列YINPYNDGTQYNEKFKG(SEQ ID NO:5)的 CDR2 和具有氨基酸序列 GFGGSYGFAY(SEQ ID NO:6)的CDR3。来源于嵌合单克隆抗体的抗体组分的使用减少了鼠恒定区免疫原性相关的潜在问题。
[0119]鼠抗体和抗体片段的人源化也是本领域的技术人员熟知的。制备人源化MAb 的技术在例如 Carter 等，Proc Nat’ I Acad.Sc1.USA89:4285 (1992)、Singer 等，J.1mmun.150:2844 (1992)、Mountain 等 Biotechnol Genet Eng Rev.10:1 (1992)和Coligan，第10.19.1-10.19.11页中有所公开，每个文献以引用的方式并入本文。例如，人源化单克隆抗体可通过将来自小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区的鼠互补决定区转移到人可变区，然后将框架区中所选的人残基替代为它们的鼠FR对应物而制备。除人恒定区序列之外，人框架区序列的 使用还减小了诱导HAMA反应的几率。
[0120]根据如上所述获得的PAM4可变区序列，人源化PAM4抗体可以如Leung等(MolImmunol.32:1413 (1995))所述设计和构建，该文献以引用的方式并入本文。实施例1描述了用于构建hPAM4MAb的人源化方法。
[0121]用于制备hPAM4抗体的引物的核苷酸序列在如下实施例1中有所讨论。在优选的实施方案中，人源化PAM4抗体或抗体片段包含上文所公开的轻链和重链CDR序列(SEQ IDNO:1至SEQ ID N0:6)o另外优选地，人源化抗体的轻链和重链可变区的FR包含至少一个被鼠PAM4MAb的所述对应FR取代的氨基酸。
[0122]完全人抗体，如人PAM4可从转基因非人类动物获得。参见例如Mendez等,NatureGenetics, 15:146-156(1997);美国专利号5，633，425。例如，人抗体可从具有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠回收。小鼠体液免疫系统通过使内源性免疫球蛋白基因失活并且引入人免疫球蛋白基因座来人源化。人免疫球蛋白基因座非常复杂，包含大量离散片段，它们一起占据了几乎0.2%的人基因组。为了确保转基因小鼠能够生成足够的抗体谱系，大部分人重链和轻链基因座必须引入小鼠基因组。这通过逐步方法实现，所述方法始于在种系构造中形成包含人重链或轻链免疫球蛋白基因座的酵母人工染色体(YAC)。由于每个插入序列的大小为大约lMb，YAC构造需要免疫球蛋白基因座的重叠片段的同源重组。两种YAC，一种包含重链基因座，一种包含轻链基因座，通过含YAC酵母球芽与小鼠胚胎干细胞的融合分别引入小鼠。然后将胚胎干细胞克隆显微注射到小鼠胚泡。对所得的嵌合雄性筛选通过其种系传播YAC的能力，并且与鼠抗体生成缺陷的小鼠杂交。通过两种转基因品系，一种包含人重链基因座，另一种包含人轻链基因座的杂交，生成了响应免疫产生人抗体的子代。然而，这些技术是非限制性的，本领域已知的产生人抗体的其它方法，例如使用噬菌体展示，也可用于产生人抗胰腺癌抗体。
[0123]抗体可使用本领域已知的方法通过细胞培养技术生成。在一个例子中，转染瘤培养适于无血清培养基。对于人源化抗体的产生，细胞可使用HSFM以滚瓶中的500ml培养物生长。使培养物离心，上清液通过0.2 μ m膜过滤。使过滤的培养基以lml/min的流速通过蛋白-A柱(I X 3cm)。然后用约10倍柱体积的PBS洗涤树脂，蛋白A结合抗体通过含IOmMEDTA的0.1M甘氨酸缓冲液(pH3.5)从柱子上洗脱。将1.0ml级分收集于包含10μ 13MTris (ρΗ8.6)的管中，蛋白质浓度由280/260nm下的吸光度确定。收集峰值级分，对PBS渗析，并且例如使用C entricon30过滤器(Amicon, Beverly, MA)浓缩抗体。抗体浓度通过ELISA确定，并且其浓度使用PBS调整至约lmg/ml。0.01%(w/v)叠氮化钠可方便地作为防腐剂加入样品。
[0124]抗体可从杂交瘤培养物通过多种已建立的技术分离和纯化。此类分离技术包括使用蛋白-A琼脂糖凝胶的亲和色谱法、尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法。参见例如Coligan,第 2.7.1-2.7.12 页和第 2.9.1-2.9.3 页。还可参见 Baines 等，"Purificationof Immunoglobulin G (IgG)，"METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第 10 卷，第 79-104 页(TheHumana Press, Inc.1992)。
[0125]抗胰腺癌MAb可通过本领域技术人员熟知的多种技术表征。例如，抗体结合PAM4抗原的能力可使用间接酶免疫测定、流式细胞术分析、ELISA或蛋白质印迹分析确认。
[0126]抗体片段
[0127]抗体片段是抗体的抗原结合部分，例如F(ab’)2、Fab’、F(ab)2、Fab、Fv、sFv、scFv等等。识别特定表位的抗体片段可通过已知技术生成。F(ab’)2片段例如可通过抗体分子的胃蛋白酶消化生成。这些和其它方法在例如Goldenberg美国专利号4，036, 945和4，331，647及其包含的参考文献中有所描述。还可参见Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.89:230(1960) ；Porter, Biochem.J.73:119(1959) ；Edelman 等，in METHODS INENZYM0L0GY 第 I 卷，第 422 页(Academic Pressl967)以及 Coligan，第 2.8.1-2.8.10 页和第 2.10.-2.10.4 页。或者，可构建 Fab’ 表达库(Huse 等，1989，Science，246:1274-1281 )，以允许通过所需的特异性快速和轻松地识别单克隆Fab’片段。
[0128]单链Fv分子(scFv)包含Vlj域和Vh域。Vlj和Vh域关联形成祀结合位点。这两个域还通过肽连接基(L)共价连接。如果\域是scFv分子的N-末端部分,则scFv分子表示为'-L-Vh，如果Vh域是scFv分子的N-末端部分，则表示为Vh-L-'。制备scFv分子和设计合适的肽连接基的方法在美国专利号4，704, 692、美国专利号4，946，778、R.Raag andΜ.Whitlow，"Single Chain Fvs."FASEB Vol9:73-80(1995)和 R.E.Bird and B.ff.Walker,Single Chain Antibody Variable Regions，TIBTECH，Vol9:132-137 (1991)中有所描述。
[0129]其它抗体片段例如单域抗体片段是本领域已知的，可用于要求保护的构建体。单域抗体(VHH)可以例如从骆驼、羊驼或大羊驼通过标准免疫技术获得。(参见例如Muyldermans 等，TIBS26:230-235,2001 ；Yau 等，J Immunol Methods281:161-75，2003 ；Maass等，J Immunol Methods324:13-25，2007)。VHH可具有强大的抗原结合能力，并且可与不能进入常规Vh-V1j对的新表位相互作用(Muyldermans等,2001)。羊骑血清IgG仅包含约50%的羊驼重链IgG抗体(HCAb) (Maass等，2007)。羊驼可被已知抗原，例如TNF-α免疫，VHH可通过结合并且中和靶抗原而分离(Maass等，2007)。实际上扩增所有羊驼VHH编码序列的PCR引物已经识别，并且可用于构建羊驼VHH噬菌体展示库，该库可用于通过本领域熟知的标准生物淘洗技术进行抗体片段分离(Maass等，2007)。
[0130]抗体片段也可通过全长抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌(E.coli)或另外宿主中表达编码片段的DNA来制备。抗体片段可通过常规方法由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体获得。例如，抗体片段可通过胃蛋白酶裂解抗体而生成，以提供大约IOOKd以F(ab’)2表示的片段。该片段还可使用硫醇还原剂，以及任选地二硫键裂解得到的巯基的封端基团裂解，生成大约50Kd Fab’ 一价片段。或者，使用木瓜蛋白酶裂解直接生成两个一价Fab片段和Fe片段。
[0131]也可使用裂解抗体的其它方法，例如分离重链形成一价轻链-重链片段，进一步裂解片段或其它酶学、化学或基因技术，只要该片段结合完整抗体识别的抗原。
[0132]抗体融合蛋白和多价抗体
[0133]包含所关注的抗胰腺癌抗体的融合蛋白可通过多种常规程序制备，从戊二醛键到官能团之间特异性更高的连接。包含本文所述融合蛋白的抗体和/或抗体片段优选地直接或通过连接基部分，通过抗体或片段上的一个或多个官能团，如胺、羧基、苯基、硫醇或羟基彼此共价连接。除戊二醛之外，可使用各种常规连接基，如二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、双(羟基琥珀酰亚胺)酯、碳二亚胺、马来酰亚胺羟基琥珀酰亚胺酯等等。
[0134]制备融合蛋白的简单方法是在戊二醛的存在下混合抗体或片段。初始席夫碱连接可以例如通过硼氢化物还原为 仲胺而稳定。二异硫氰酸酯或碳二亚胺可代替戊二醛用作非位点特异性连接基。在一个实施方案中，抗体融合蛋白包含抗胰腺癌MAb或其片段，其中MAb结合PAM4抗原。该融合蛋白及其片段优选地结合胰腺癌细胞。该一价、单特异性MAb用于直接靶向抗原，其中MAb连接到治疗剂、诊断剂或它们的组合，蛋白质直接施用到患者。
[0135]相反，融合蛋白可包含至少两个结合PAM4抗原特定表位的抗胰腺癌MAb。例如，MAb可生成抗原特异性双价抗体、三价抗体和四价抗体，它们是多价的，但对PAM4抗原具有单特异性。两个或更多个scFv分子的非共价结合可形成官能化双价抗体、三价抗体和四价抗体。单特异性双价抗体是相同scFv的同源二聚体,其中每个scFv包含选择抗体的\^域，所述选择抗体通过短连接基连接到相同抗体的\域。双价抗体是两个scFv的非共价结合形成的二价二聚体，产生两个Fv结合位点。三个scFv的三价三聚体的形成得到三价抗体，产生三个结合位点，四价抗体是四个scFv的四价四聚体，产生四个结合位点。多个单特异性双价抗体使用包含重组基因构建体的表达载体制备，所述构建体包含Vh1-连接基-VlU参见 Holliger 等，Proc Natl.Acad.Sci USA90:6444-6448 (1993) ;Atwell 等，MolecularImmunology33:1301-1302(1996) ;HolIiger等，Nature Biotechnologyl5:632-631(1997)；Helfrich 等，Int J Cancer76:232-239 (I 998) ；Kipriyanov 等，Int JCancer77:763-772 (1998) ;Holiger 等，Cancer Research59:2909-2916 (1999)。构建 scFv的方法在美国专利号4，946，778 (1990年)和美国专利号5，132，405 (1992年)中有所公开，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文。制备基于scFv的多价、单特异性抗体的方法在美国专利号5，837，242 (1998年)、美国专利号5，844，094 (1998年)和W0-98/44001(1998年)中有所公开，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文。多价、单特异性抗体融合蛋白结合两个或更多个相同类型的表位，所述表位可位于相同抗原上或单独抗原上。化合价的升高允许附加相互作用、亲和力增加以及停留时间延长。这些抗体融合蛋白可用于直接靶向系统，其中抗体融合蛋白偶联治疗剂、诊断剂或它们的组合，并且直接施用给需要其的患者。
[0136]优选的实施方案是多价、多特异性抗体或其片段，其包含一个或多个对PAM4靶表位具有亲和力的抗原结合位点，以及一个或多个胰腺癌相关的其它表位的附加结合位点。该融合蛋白是多特异性的，因为其结合至少两个不同的表位，所述表位可驻留在相同或不同的抗原上。例如，融合蛋白可包含多于一个抗原结合位点，第一个对PAM4抗原表位具有亲和力，第二个对另一个靶抗原，例如TAG-72或CEA具有亲和力。另一个例子是双特异性抗体融合蛋白，其可以包含CA19.9MAb (或其片段)和PAM4MAb (或其片段)。此类融合蛋白将对CA19.9以及PAM4抗原具有亲和力。抗体融合蛋白及其片段可用于直接靶向系统，其中抗体融合蛋白偶联治疗剂、诊断剂或它们的组合，并且直接施用给需要其的患者。
[0137]另一个优选的实施方案是多价、多特异性抗体，其包含至少一个对PAM4靶表位具有亲和力的结合位点以及至少一个对半抗原分子具有亲和力的半抗原结合位点。例如，双特异性融合蛋白可包含679MAb (或其片段)和PAM4MAb (或其片段)。单克隆679抗体高亲和力结合包含组胺琥珀酰甘氨酰(HSG)三肽部分的分子。此类双特异性PAM4抗体融合蛋白可以例如从679获得F(ab’)2片段来制备，如上文所描述。679F(ab’)2片段的链间二硫桥用DTT温和还原，小心避免轻链-重链连接形成Fab’ -SH片段。SH基团通过过量的双马来酰亚胺连接基(1，I’-(亚甲基二-4，1-亚苯基)双马来酰亚胺)活化。PAM4MAb转化为Fab’ -SH，然后与活化的679Fab’ -SH片段反应得到双特异性抗体融合蛋白。双特异性抗体融合蛋白，例如所述双特异性抗体融合蛋白可用于亲和力增强系统，其中靶抗原预靶向至融合蛋白，随后靶向至诊断或治疗剂，所述诊断或治疗剂连接到包含一个或多个HSG半抗原的载体部分(可靶向构建体)。`在替代优选实施方案中，基于DNL的hPAM4-679构建体例如TFlO可如下文实施例中所述制备和使用。
[0138]双特异性抗体可通过多种常规方法，如二硫化物裂解和全部IgG或优选地F (ab’) 2片段的混合物的重新形成，多于一种的杂交瘤融合形成产生具有多于一种特异性的抗体的多瘤，以及通过基因工程制备。双特异性抗体融合蛋白通过不同抗体的还原裂解得到的Fab’片段的氧化裂解制备。这可通过如下步骤有利地进行:胃蛋白酶消化两种不同抗体生成的两种不同F(ab’)2片段，还原裂解形成Fab’片段的混合物，然后氧化重新形成二硫键以生成包括双特异性抗体融合蛋白的F(ab’)2片段的混合物，所述融合蛋白包含对每个原表位具有特异性的Fab’部分。制备抗体融合蛋白的通用技术可见于例如Nisonoff等,ArchBiochem Biophys.93:470 (1961)、Hammerling 等，J Exp Med.128:1461 (1968)和美国专利号 4，331，647。
[0139]更具选择性的连接可使用杂双官能化连接基，例如马来酰亚胺羟基琥珀酰亚胺酯实现。酯与抗体或片段的反应将衍生化抗体或片段上的胺基，然后衍生物可与例如具有游离巯基的抗体Fab片段(或巯基通过例如Traut试剂连接到其上的大片段或完整抗体)反应。此类连接基不太可能交联相同抗体中的基团，以及提高连接的选择性。
[0140]在远离抗原结合位点的位点连接抗体或片段是有利的。这可通过例如上述裂解链间巯基的连接实现。另一种方法涉及具有氧化碳水化合物部分的抗体与具有至少一个游离胺官能团的另一个抗体的反应。这产生初始席夫碱连接，其优选地通过还原为仲胺，如通过硼氢化物还原，以形成最终复合物来稳定。对于小分子，此类位点特异性连接在美国专利号4，671，958中有所公开，对于大附加物，在美国专利号4，699，784中有所公开，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文。
[0141]具有长度大于12个氨基酸残基的连接基(例如，15或18个残基的连接基)的ScFv允许相同链上Vh和\域之间的相互作用，并且通常形成单体、二聚体(称为双价抗体)和少量高质量多聚体的混合物(Kortt等，Eur J Biochem.(1994)221:151-157)。然而，具有5个或更少氨基酸残基的连接基的ScFv，阻止了相同链上Vh和\域的分子内配对，迫使不同链上％和Vlj域的配对。3和12个残基之间的连接基主要形成二聚体(Atwell等,ProteinEngineering(1999) 12:597-604)。通过O和2个残基之间的连接基，形成scFv的三聚体(称为三价抗体)、四聚体(称为四价抗体)或高级低聚结构；然而，除连接基长度之外，寡聚化的确切方式似乎取决于V-域的组成以及取向。
[0142]最近，实际上任何组合的构建抗体、抗体片段和/或其它效应子部分的混合物的新技术在美国专利号 7, 550，143,7, 521，056,7, 534，866,7, 527，787 和 7，666，400 中有所描述，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文。通常称为对接-锁定(DNL)的技术涉及生成在其N-或C-末端包含两条互补肽序列之一的融合蛋白，所述互补肽序列称为二聚化和对接域(DDD)和锚固域(AD)序列。在优选的实施方案中，DDD序列来源于cAMP-依赖性蛋白激酶的调节亚基，AD序列来源于A-激酶锚固蛋白(AKAP)的序列。DDD序列形成结合AD序列的二聚体，所述AD序列允许三聚体、四聚体、六聚体或任何多种其它复合物的形成。通过将效应子部分，例如抗体或抗体片段，连接到DDD和AD序列，复合物可由抗体或抗体片段的任何选择组合形成。.DNL复合物可通过形成二硫键或其它连接而共价稳定。
[0143]预靶向
[0144]双特异性或多特异性抗体可用于预靶向技术。预靶向是多步骤方法，原来开发用于解决直接靶向抗体的缓慢血液清除，其有助于正常组织，例如骨髓的不期望毒性。通过预靶向，放射性核素或其它治疗剂可连接到在数分钟内从血液清除的小递送分子(可靶向构建体或可靶向偶联物)。首先施用具有可靶向构建体以及靶抗原的结合位点的预靶向双特异性或多特异性抗体，使游离抗体从循环系统清除，然后施用可靶向构建体。
[0145]预靶向方法是本领域熟知的，例如在Goodwin等，美国专利号4，863，713 ；Goodwin 等，J.Nucl.Med.29: 226,1988 ；Hnatowich 等，J.Nucl.Med.28:1294,1987 ；0ehr等，J.Nucl.Med.29: 728,1988 ;Klibanov 等，J.Nucl.Med.29:1951,1988 ;Sinitsyn 等，J.Nucl.Med.30:66,1989 ；Kalofonos 等，J.Nucl.Med.31:1791,1990 ;Schechter 等，Int.J.Cancer48:167,1991 ；Paganelli 等，Cancer Res.51:5960,1991 ；Paganelli 等，Nucl.Med.Commun.12:211，1991 ;美国专利号 5，256，395 ；Stickney 等，Cancer Res.51:6650，1991 ;Yuan 等，Cancer Res.51:3119，1991 ;美国专利号 6，077，499、美国专利号 6，090，381、美国专利号6，472，511和美国专利号6，962，702中有所公开。[0146]治疗或诊断受试者疾病或病症的预靶向方法可通过如下提供:(I)给受试者施用双特异性抗体或抗原结合抗体片段；(2)任选地给受试者施用清除组合物，允许该组合物从循环系统清除抗体；以及(3)给受试者施用包含一种或多种螯合或化学结合治疗或诊断剂的可靶向构建体。该技术也可通过施用偶联到可靶向构建体的酶，然后通过酶转化为活性形式的前药而用于抗体依赖性酶前药治疗(ADEPT)。
[0147]已知抗体
[0148]在各种实施方案中，PAM4或其它抗粘蛋白抗体可与一种或多种抗相同或不同抗原，例如另一种肿瘤相关抗原的抗体组合使用。抗体或其片段可单独、顺序或同时施用，或者可作为双特异性或多特异性抗体复合物，例如DNL复合物施用。可使用任何已知的抗TAA抗体，包括但不限于:hPAM4 (美国专利号7，282，567)、hA20 (美国专利号7，251，164)、hA19 (美国专利号7，109,304)、hIMMU31 (美国专利号7，300，655)、hLLl (美国专利号7，312，318)、hLL2 (美国专利号 7，074，403)、hMu_9 (美国专利号 7，387，773)、hL243 (美国专利号 7, 612，180)、hMN-14 (美国专利号 6，676，924)、hRS7 (美国专利号 7，238，785)、hMN-3 (美国专利号7，541，440)、hMN-15 (提交于2010年7月29日的美国专利申请序列第12/846,062号)和hRl (提交于2010年3月12日的美国专利申请序列第12/772，645号)，每个引用专利或专利申请的实施例部分以引用的方式并入本文。
[0149]其它所用抗体可从多种已知来源商购获得。例如，多种抗体分泌杂交瘤系可从弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC, Manassas, VA)获得。大量抗多种疾病祀标,包括但不限于肿瘤相关抗原的抗体保存在ATCC和/或已公布可变区序列，可用于要求保护的方法和组合物。参见例如美国专利号 7，312，318,7, 282，567,7, 151，164,7, 074，403,7, 060，802,7, 056，509,7, 049，060、7，045，132、7，041，803、7，041，802、7，041，293、7，038，018、7，037，498、7，012，133、7，001，598,6, 998，468,6, 994，976,6, 994，852,6, 989，241,6, 974，863,6, 965，018、6，964，854,6, 962，981,6, 962，813,6, 956，107,6, 951，924,6, 949，244,6, 946，129、6，943，020、6，939，5 47、6，921，645、6，921，645、6，921，533、6，919，433、6，919，078、6，916，475,6, 905，681,6, 899，879,6, 893，625,6, 887，468,6, 887，466,6, 884，594、6，881，405、6，878，812、6，875，580、6，872，568、6，867，006、6，864，062、6，861，511、6，861，227,6, 861，226,6, 838，282,6, 835，549,6, 835，370,6, 824，780,6, 824，778、6，812，206,6, 793，924,6, 783，758,6, 770，450,6, 767，711,6, 764，688,6, 764，681、6，764，679,6, 743，898,6, 733，981,6, 730，307,6, 720，155,6, 716，966,6, 709，653、6，693，176,6,692,908,6, 689,607,6,689,362,6, 689, 355,6, 682, 737,6, 682, 736、6，682，734,6, 673，344,6, 653，104,6, 652，852,6, 635，482,6, 630, 144,6, 610, 833、6，610, 294,6, 605, 441,6, 605, 279,6, 596，852,6, 592, 868,6, 576, 745,6, 572;856、6，566，076,6, 562，618,6, 545，130,6, 544，749,6, 534，058,6, 528，625,6, 528，269、6，521，227,6, 518，404、6，511，665、6，491，915、6，488，930、6，482，598、6，482，408、6，479，247,6, 468，531,6, 468，529,6, 465，173,6, 461，823,6, 458，356,6, 455，044、6，455，040，6，451，310,6, 444，206,6, 441，143,6, 432，404,6, 432，402,6, 419，928、6，413，726,6,406，694,6,403，770,6,403，091,6, 395，276,6, 395，274,6, 387，350、6，383，759,6, 383，484,6, 376，654,6, 372，215,6, 359，126,6, 355，481,6, 355，444、6，355，245,6, 355，244,6, 346，246,6, 344，198,6, 340，571,6, 340，459,6, 331，175、6，306，393,6,254，868,6, 187，287,6, 183，744,6, 129，914,6, 120，767,6,096，289、6，077，499,5, 922，302,5, 874，540,5, 814，440,5, 798，229,5, 789，554,5, 776，456、5，736，119,5, 716，595,5, 677，136,5, 587，459,5, 443，953,5, 525，338，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文。这些仅仅是示例性的，并且多种其它抗体及其杂交瘤是本领域已知的。技术人员将认识到，抗几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或抗体分泌杂交瘤可通过在ATCC、NCBI和/或USPTO数据库中简单搜索所关注的抗选择性疾病相关靶标的抗体而获得。克隆抗体的抗原结合域可使用本领域熟知的标准技术扩增、切除、连接到表达载体、转染到改造的宿主细胞，并且用于蛋白质制备。
[0150]例如，每个以下公开的抗特异性肿瘤相关标记物的抗体，以及它们对应的ATCC保藏号是已知的。
[0151]
【权利要求】
1.一种检测或诊断胰腺癌的方法，所述方法包括: a)从个体获得血液、血清、血浆或组织样品；以及 b)使用抗粘蛋白抗体或其抗原结合片段进行免疫测定以检测胰腺癌粘蛋白在所述样品中的存在，其中所述抗体或其片段与以下抗体结合相同的表位或竞争结合胰腺癌粘蛋白，所述抗体包含轻链可变区 CDR 序列 CDRl (SASSSVSSSYLY, SEQ ID NO:1)、CDR2 (STSNLAS,SEQ ID NO: 2)和 CDR3(HQWNRYPYT，SEQ ID NO: 3);以及重链可变区 CDR 序列 CDRl (SYVLH，SEQ ID N0:4)、CDR2(YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO:5)和 CDR3 (GFGGSYGFAY，SEQ IDNO:6)； 其中所述胰腺癌粘蛋白的存在指示所述个体中存在胰腺癌，并且所述免疫测定可检测早期胰腺癌。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括使用一种或多种结合所述样品中胰腺癌细胞的附加抗体进行免疫测定。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述附加抗体结合选自以下的抗原:CA19.9、DUPAN2、SPANl、Nd2、B72.3、CC49、CEACAM5、CEACAM6、Le\ Le (y)、CSAp、胰岛素样生长因子(IGF)、上皮糖蛋白-1 (EGP-1)、上皮糖蛋白-2(EGP-2)、TR0P2、CD80、胎盘生长因子(PlGF)、碳酸酐酶 IX、腱生蛋白、IL-6、HLA-DR、CD40、CD74、CD 138、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC16、MUC17、TAG-72, EGFR、血小板衍生生长因子(I3DGF)、VEGF, PlGF, bcl_2、Kras、p53、cMET 和 HER2/neu。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述附加抗体结合CA19.9。
5.根据权利要求4所述的方法，其中使用抗粘蛋白和抗CA19.9抗体的所述免疫测定对于胰腺癌的检测具有84%的灵敏度和83%的特异性。`
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫测定可辨别良性非粘液性胰腺囊性病变的个体和IA期、IB期和2期胰腺癌个体。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫测定对良性胰腺病变个体具有6%或更小的假阳性率。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述血清免疫测定可检测无症状个体中的胰腺癌。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是血清样品，并且所述方法还包括在所述免疫测定进行之前对所述血清样品进行有机相萃取。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述有机相是丁醇。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫测定检测PanIN-lA、PanIN_lB、PanIN-2、侵袭性胰腺癌、胰腺癌、粘液性囊性肿瘤(MCN)、胰腺内粘液性肿瘤(IPMN)和导管内乳头状粘液瘤的存在。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗粘蛋白抗体包含所述轻链可变区 CDR 序列 CDRl (SASSSVSSSYLY, SEQ ID NO:1)、CDR2 (STSNLAS，SEQ ID NO: 2)和CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO: 3);以及所述重链可变区CDR序列 CDRl (SYVLH，SEQ ID N0:4)、CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO:5)和 CDR3(GFGGSYGFAY，SEQ ID NO:6)。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗粘蛋白抗体或其片段能够结合包含所述氨基酸序列WTWNITKAYPLP(SEQ ID NO:7)的直链肽或包含所述氨基酸序列ACPEffffGTTC(SEQID NO:8)的环状肽。
14.根据权利要求1所述的方法，还包括通过监测胰腺癌粘蛋白的血清水平来确定胰腺癌对治疗的响应性。
15.一种检测或诊断胰腺癌的方法，所述方法包括: a)给个体施用抗胰腺癌粘蛋白抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与以下抗体结合相同的表位或竞争结合胰腺癌粘蛋白，所述抗体包含所述轻链可变区 CDR 序列 CDRl (SASSSVSSSYLY, SEQ ID NO:1)、CDR2 (STSNLAS，SEQ ID NO: 2)和CDR3 (HQWNRYPYT，SEQ ID NO: 3);以及所述重链可变区 CDR序列 CDRl (SYVLH，SEQ ID NO: 4)、CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO: 5)和 CDR3 (GFGGSYGFAY，SEQ ID NO: 6);以及 b)检测结合到胰腺癌细胞的所述抗体或其片段。 其中所述抗粘蛋白抗体用至少一种诊断剂标记。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗粘蛋白抗体连接到结合可靶向构建体上的半抗原的抗体或抗原结合抗体片段；并且所述方法还包括施用连接到至少一种诊断剂的可靶向构建体。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗粘蛋白抗体或其抗原结合片段偶联到至少一种诊断剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述诊断剂选自放射性核素、造影剂、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁离子、酶和光敏诊断剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述诊断剂是选自n°In、mIn、mLU、18F、52Fe、62Cu,64Cu,67Cu,67Ga,68Ga,86Y,90Y,89Zr,94mTc,94Tc,99mTc, 1201 , 1231 , 1241 , 1251 , 131 1 , 154^158Gd, 32P,11C, 13N, 150,186Re, 188Re,51Mn,52mMn,55Co,72As,75Br,76Br,82mRb,83Sr 的放射性核素，或其它 Y->β _或正电子发射体。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述放射性核素是18F,并且所述方法还包括PET成像。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述顺磁离子选自铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钦(III)和铒(III)。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述诊断剂是选自异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红素、藻青素、别藻蓝素、邻苯二甲醛和胺荧的荧光标记化合物，或选自鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯的化学发光标记化合物，或选自虫荧光素、荧光素酶和水母素的生物荧光化合物。
23.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法用于术中、内镜或血管内程序。
24.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗体是DNL(对接-锁定)构建体。
25.根据权利要求16所述的方法，其中所述半抗原结合抗体结合到HSG或In-DTPA。
26.根据权利要求15所述的方法，还包括通过监测胰腺癌粘蛋白的所述血清水平确定胰腺癌对治疗的响应性。
【文档编号】A61K39/395GK103429263SQ201280013831
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2012年2月13日 优先权日:2011年2月15日
【发明者】D·V·戈德, D·M·戈德堡 申请人:免疫医疗公司