使用靶向结缔组织生长因子(ctgf)的反义化合物治疗疤痕疙瘩或肥大性疤痕的方法
【专利摘要】本发明提供了预防纤维性病变形成或者治疗其的方法，所述纤维性病变包括皮肤伤痕如疤痕疙瘩和肥大性疤痕，所述方法包括通过一或多次注射给予对象一种化合物，所述化合物包含修饰的寡核苷酸如修饰的反义寡核苷酸、siRNA或寡脱氧核糖核苷酸，所述化合物抑制参与纤维化的蛋白质的表达。本发明还描述了使用皮内穿线状注射技术给予所述反义寡核苷酸。
【专利说明】使用靶向结缔组织生长因子(CTGF)的反义化合物治疗疤痕疙瘩或肥大性疤痕的方法
[0001]本申请要求2011年8月26日提交的美国临时申请号61/527，821、2011年5月20日提交的美国临时申请号61/488，666及2011年2月2日申请的美国临时申请号61/438，879的优先权，所述申请并入本文。
[0002]本申请援引加入名为“120202_5056_81583_A_PCT_Sequence_Listing_B1.txt”的文件中的核苷酸和/或氨基酸序列，该文件大小为62千字节，且以IBM-PC机器格式创建于2012年2月1日，与MS-Windows操作系统兼容，包含于作为本申请一部分的于2012年2月2日提交的文本文件中。
[0003]在本发明申请文中，引用了许多不同的专利和出版物。这些专利和出版物的揭示内容全部通过引用并入本文，以更充分描述本发明涉及的技术水平。
发明领域
[0004]本发明涉及预防纤维性病变形成或者治疗纤维性病变的方法，所述纤维性病变包括皮肤症痕如症痕挖瘡(keloid)和肥大性症痕(hypertrophic scar)。
[0005]发明背景
[0006]反义化合物是降低特异性基因产物表达的有效方式，可特别用于许多治疗性应用中，例如用于调节参与纤维化的蛋 白质的表达，如结缔组织生长因子(CTGF)。(见Gaarde等的美国专利号6，965，025B2)。
[0007]反义化合物是寡聚化合物，其能与靶核酸(如靶mRNA分子)杂交并抑制所述靶核酸的表达。
[0008]在美国专利号6，965，025B2中揭示了调节CTGF表达及治疗与CTGF表达相关的疾病的反义化合物、组合物和方法。然而，仍需要另外的化合物如能提供增强的CTGF表达抑制作用以及其它有利性质的化合物。
[0009]结缔组织生长因子(CTGF，也称作ctgrofact，成纤维细胞可诱导的分泌蛋白，fisp-12，N0V2，胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白2，IGFBP-rP2, IGFBP-8, HBGF-0.8，Hcs24和ecogenin)是调节蛋白CCN(CTGF/CYR61/N0V)家族的一个成员，该家族以其鉴别的最初的家族成员，结缔组织生长因子，半胱氨酸富集的(CYR61)，及肾母细胞瘤过表达的(N0V)命名，但是该家族还包括蛋白质ELM-1(在低转移细胞中表达)，WISP-3(Wnt-l-诱导的分泌蛋白)，及C0P-1 (WISP-2)。已经发现CCN蛋白是分泌的、胞外的基质相关蛋白，其调节细胞过程如粘附、迁移、有丝分裂发生、分化、存活、血管发生、动脉粥样硬化、软骨发生、伤口愈合、肿瘤发生及血管和纤维化疾病如硬皮病(Lau and Lam, Exp.CellRes.，1999，248，44-57)。结缔组织生长因子蛋白示出刺激DNA合成及促进成纤维细胞趋化性(Bradham 等.，J.Cell Biol.，1991，114，1285-1294)。
[0010]结缔组织生长因子在正常分化过程中在成纤维细胞中表达，所述过程包括胞外基质(ECM)产生和重塑。结缔组织生长因子也经常在纤维化皮肤疾病中过表达，所述纤维化皮肤疾病如系统性硬化病、局部皮肤硬化症、疤痕疙瘩、疤痕组织、嗜酸细胞性筋膜炎、结节性筋膜炎及掌腱膜挛缩。结缔组织生长因子mRNA或蛋白质水平在主要器官和组织包括肝脏、肾脏、肺、心血管系统、胰腺、肠道、眼和齿龈的纤维性病变中升高。在特征在于明显结缔组织参与的乳腺、胰腺和纤维组织细胞的肿瘤中，结缔组织生长因子在间质部分(stromalcompartment)中过表达。
[0011]CTGF在疤痕疙瘩疾病中的作用
[0012]疤痕疙瘩疾病(KD)是一种良性的皮肤纤维增生性肿瘤，特征在于胞外基质蛋白过度堆积，导致胶原蛋白形成过多。异常皮肤疤痕可在遗传易感个体的损伤后发生。KD也可以是家族性状况，更通常发生在深色皮肤的种族中。疤痕疙瘩的最高发生率在黑人种群中发现，在非洲黑人的随机样品中估计为大约4% - 6%直至16%。关于KD已经提出不同的遗传方式，从常染色体隐性至常染色体显性及不完全的临床外显及可变的表达。多数疤痕疙瘩可导致相当大的妆容瑕疵，但是也可以生长为足够大而变得出现症状，导致畸形或受限的关节活动性。
[0013]尽管CTGF在正常皮肤中低水平表达，但是CTGF在皮肤损伤后被上调，当伤痕严重时如在疤痕疙瘩或系统性硬化病中变成一直过表达。从肥大性疤痕、疤痕疙瘩和硬皮症中培养的成纤维细胞表达增加的本底CTGF(Exp.Cell Res.2000，259:213-224)，从肥大性疤痕和疤痕疙瘩中培养的细胞示出表达更多的本底CTGF，也应答TGF-β刺激而加工更多的 CTGF(Plast.Reconstr.Surg.2005，116:1387-90)。相似地，在细胞培养中，在血清刺激后CTGF在疤痕疙瘩中的转录显著高于在正常成纤维细胞中的转录(Ann.Surg.2007, 246(5):886-95)。
[0014]在疤痕疙瘩组织中，发现表达CTGF mRNA的成纤维细胞遍及损害分布，特别是在周围区域中(J.1nvest.Derm.1996，106:729-733)。已经对比了在正常皮肤、疤痕疙瘩疤痕、肥大性疤痕和成熟疤痕中的CTGF mRNA表达水平。CTGF mRNA在所有疤痕疙瘩病例中均明显检测到，但是在成熟疤痕中未检测到。在疤痕疙瘩与在正常皮肤中发现的水平显著不同(J.Japan Soc.Plastic Reconstr.Surg.2002，22:560-565)。最近的资料也提不相对于正常的成纤维细胞，疤痕疙瘩疤痕成纤维细胞与正常成纤维细胞相比应答外源TGF-β 1合成多 100-150 倍的 CTGF (Plast.Reconstr.Surg.2005，116:1387-1390)。当与正常皮肤对比时，在疤痕疙瘩表皮基底层可见CTGF定位增加，以及在疤痕疙瘩组织提取物中观测到CTGF较高的表达水平(J.Cell Physiol.2006, 208(2):336-43)。先前没有产生通过抑制CTGF表达而抑制疤痕疙瘩生长的数据确认CTGF在疤痕疙瘩疾病中的作用。
[0015]目前，治疗疤痕疙瘩或者预防手术后疤痕疙瘩生长还未确立有效的单一治疗方案。现有的治疗方法包括封闭敷裹，加压疗法，损害内部类固醇注射，冷冻疗法，手术切除，激光治疗，放射治疗，康宁乐(曲安西龙)，干扰素疗法，博来霉素，5-氟尿嘧啶，维拉帕米，咪喹莫特乳膏，及其组合。近30年来，基于硅酮和非硅酮的封闭敷裹均是疤痕疙瘩的广泛使用的临床选项，但是所有这些方法均获得非常有限的效力，因此急切需要疤痕疙瘩的一种新疗法。
[0016]已经尝试了各种形式的放射疗法作为疤痕疙瘩的单一治疗方法，但是这种方法由于在治疗后无对照的致癌作用报道而是非常有争议的疗法。在近40年已经重复尝试使用氩、CO2和脉冲染料的激光疗法，但是无一证实是有效的。根据多项研究，所有这三种形式的激光疗法的复发率超过90%，示出益处很小。冷冻疗法用作单一治疗。然而，与这种方法相关的副作用包括治疗部位疼痛及色素脱失或色素沉着。损害内部注射曲安西龙丙酮通常用作疤痕疙瘩的一线治疗方法，但是同样实际报道的临床效力变化很大。此外，需要多次注射，以及注射疼痛、皮肤萎缩、毛细管扩张和改变的色素沉着等副作用使得临床医生和研究者持续探寻其它治疗方式。
[0017]因此，仍长期需要另外的方法和制剂以有效地防止疤痕疙瘩、肥大性疤痕及其它类型纤维性病变形成，以及治疗疤痕疙瘩、肥大性疤痕和纤维性病变的方法和制剂，以消除或减少所述病症和/或防止其重新出现。本发明描述的临床结果首次清晰证实靶向CTGF的反义寡核苷酸降低手术后疤痕疙瘩的生长和严重性的能力。
[0018]给予皮肤反义寡核苷酸
[0019]也已经首次证实反义寡核苷酸在给予皮肤后不会侧向扩散非常远(见实施例2)，如果给药是以单一推注给予类型进行的话，这可导致这种类型药物对于线性切口 /愈合疤痕或疤痕疙瘩的不规则作用，导致反义寡核苷酸沿着产生的疤痕的长度而出现不同的浓度。为了克服这个缺点，已经开发了通过皮内穿线状注射(threading)技术输送反义寡核苷酸的方法。这种技术有效地沿着疤痕全长输送恒定量的反义药物，使得沿着疤痕或疤痕疙瘩全长有效及一致地减少疤痕。
[0020]皮内穿线状注射包括将针头尽可能与皮肤平行倾斜一定角度导入真皮，并将针头穿入并沿着真皮前进一般为l-5cm的距离。在这个点，撤回针头，并随着针头撤回沿着针头轨迹全长将药物注射进入真皮，使得沿着针头轨迹全长放置等量和等体积的药物。
[0021]发明概沭
[0022]本发明提供了一种在有需要的对象中治疗疤痕疙瘩或者预防皮肤损伤后疤痕疙瘡形成、再形成(reformation)或生长的方法,所述方法包括通过在症痕挖瘡部位或皮肤损伤部位进行一或多次注射而给予所述对象一种组合物，所述组合物包含由12-30个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸或其盐或酯，其中所述修饰的寡核苷酸至少一 12个核碱基序列的部分存在于选自 SEQ ID N0:9 的核苷酸 553-611、718-751、1388-1423、1457-1689、2040-2069、2120-2147、2728-2797、2267-2301、1394-1423、1469-1508、1559-1605、1659-1689,2100-2129和1399-1423的区域内，给予的量能有效治疗疤痕疙瘩或预防其形成、再形成或生长，其中有效量是每线性厘米疤痕疙瘩或皮肤损伤每次注射0.l-50mg修饰的寡核苷酸。
[0023]本发明还提供了一种在有需要的对象中治疗肥大性疤痕或者预防皮肤手术之后肥大性症痕形成、再形成(reformation)或生长的方法,所述方法包括通过在肥大性症痕部位或皮肤损伤部位进行一或多次注射而给予所述对象一种组合物，所述组合物包含由12-30个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸或其盐或酯，其中所述修饰的寡核苷酸至少一12个核碱基序列的部分存在于选自SEQ ID N0:9的核苷酸553-611、718-751、1388-1423、1457-1689、2040-2069、2120-2147、2728-2797、2267-2301、1394-1423、1469-1508、1559-1605,1659-1689,2100-2129和1399-1423的区域内，给予的量能有效治疗肥大性疤痕或预防其形成、再形成或生长，其中有效量是每线性厘米肥大性疤痕或皮肤损伤每次注射0.l-25mg修饰的寡核苷酸。
[0024]本发明进一步提供了一种在有需要的对象中降低皮肤损伤部位疤痕或疤痕疙瘩形成、再形成或生长或者治疗先前存在的疤痕或疤痕疙瘩的方法，所述方法包括通过在损伤部位或预先存在的疤痕或疤痕疙瘩的部位穿线状注射一或多次而给予对象一种组合物，所述组合物包含修饰的寡核苷酸或其盐或酯，靶向编码参与纤维化的蛋白质的核酸，给予的量能有效抑制所述蛋白质的表达并从而降低损伤部位疤痕或疤痕疙瘩形成、再形成或生长，或者治疗先前存在的疤痕或疤痕疙瘩。
[0025]本发明进一步提供了一种在有需要的对象中降低损伤部位纤维性病变形成、再形成或生长或者治疗先前存在的纤维性病变的方法，包括通过在损伤部位或者先前存在的纤维性病变部位一或多次穿线状注射而给予所述对象一种组合物，所述组合物包含修饰的寡核苷酸或其盐或酯，靶向编码参与纤维化的蛋白质的核酸，给予的量能有效抑制所述蛋白质的表达并从而降低在损伤部位的纤维性病变的形成、再形成或生长，或者治疗先前存在的纤维性病变。
[0026]附图简沭
[0027]图1示出当通过皮内注射给予时含有反义寡核苷酸的2’M0E在兔皮肤中扩散相对短距离(~0.5 - 1.0cm)(在实施例2中描述)。
[0028]图2示出在动物模型中用CTGF反义寡核苷酸治疗疤痕疙瘩，导致在移植进小鼠的完整人疤痕疙瘩组织中CTGF (图2A)和Col3al (图2B)mRNA表达均降低(在实施例3中描述)。
[0029]图3示出用反义寡核苷酸(EXC001或SEQ ID NO:39)治疗，在人体疤痕修复手术后24周抑制肥大性疤痕和疤痕疙瘩生长。在每组图片下方的得分表示安慰剂和EXC001治疗组疤痕疙瘩的改善程度。负分表示得自EXC001治疗的疤痕改善。图3A示出在疤痕修复术后24周经安慰剂和EXC001治疗的肥大性疤痕。图3B示出疤痕修复术后24周经安慰剂和EXC001治疗的疤痕疙瘩疤痕(在实施例4中描述)。
[0030]图4示出用CTGF反 义寡核苷酸(EXC001或SEQ ID NO: 39)治疗，在腹壁成形术后12周抑制肥大性疤痕形成和生长。在图片下方的得分表示安慰剂和EXC001治疗的疤痕的改善程度。负分表示得自EXC001治疗的疤痕改善(在实施例5中描述)。
[0031]图5示出当在疤痕附近给予时EXC001的有限扩散(在实施例5中描述)。将腹壁成形术疤痕右侧的疤痕部分(至垂直线右侧)用EXC001处理，而垂直线左侧的疤痕不接受任何处理。显然，右侧疤痕严重性低于左侧。这个实施例证实EXC001治疗益处限于与通过皮内穿线状注射给药部位直接相邻的疤痕区域。因此，所述药物看起来距离给予部位扩散范围有限，需要直接在临近潜在的疤痕部位及沿着其给药，例如通过皮内穿线状注射给药。
[0032]图6示出EXC001降低肥大性疤痕生长和形成的能力(在实施例6中描述)。在这个实施例中，示出两个匹配的2cm腹部症痕,一个用5mg/cm EXC001处理,一个用安慰剂处理。EXC001处理的疤痕的严重度低于安慰剂处理组。对这两个疤痕进行组织学分析也表明EXC001介导的CTGF蛋白表达降低(通过免疫组织化学分析)，清晰证实EXC001具有降低其指定靶(CTGF)表达的功能。
[0033]图7示出EXC001在治疗后不同时间对腹部疤痕中各种基因mRNA表达的作用(在实施例6中描述)。图7A示出EXC001在抑制CTGF mRNA表达中的作用。图7B示出EXC001在抑制胶原蛋白II1-al(Col3Al)mRNA表达中的作用。图7C示出EXC001在抑制弹性蛋白(ELASF)mRNA表达中的作用。图7D和E示出与安慰剂组相比EXC001对SMAD3或TGF-β ImRNA的表达无显著抑制作用。[0034]发明详沭
[0035]本发明提供了一种在有需要的对象中治疗疤痕疙瘩或者预防皮肤损伤后疤痕疙瘩形成、再形成或生长的方法，所述方法包括通过在疤痕疙瘩部位或皮肤损伤部位进行一或多次注射而给予所述对象一种组合物，所述组合物包含由12-30个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸或其盐或酯，其中所述修饰的寡核苷酸一至少12个核碱基序列的部分存在于选自 SEQ ID N0:9 的核苷酸 553-611、718-751、1388-1423、1457-1689、2040-2069、2120-2147、2728-2797、2267-2301、1394-1423、1469-1508、1559-1605、1659-1689、2100-2129和1399-1423的区域内，给予的量能有效治疗疤痕疙瘩或预防其形成、再形成或生长，其中有效量是每线性厘米疤痕疙瘩或皮肤损伤每次注射0.l-50mg修饰的寡核苷酸。
[0036]本发明还提供了一种在有需要的对象中治疗肥大性疤痕或者预防皮肤手术之后肥大性症痕形成、再形成(reformation)或生长的方法,所述方法包括通过在肥大性症痕部位或皮肤损伤部位进行一或多次注射而给予所述对象一种组合物，所述组合物包含由12-30个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸或其盐或酯，其中所述修饰的寡核苷酸一至少12个核碱基序列的部分存在于选自SEQ ID N0:9的核苷酸553-611、718-751、1388-1423、1457-1689、2040-2069、2120-2147、2728-2797、2267-2301、1394-1423、1469-1508、1559-1605,1659-1689,2100-2129和1399-1423的区域内，给予的量能有效治疗肥大性疤痕或预防其形成、再形成或生长，其中有效量是每线性厘米肥大性疤痕或皮肤损伤每次注射0.l-25mg修饰的寡核苷酸。
[0037]本发明进一步提供了一种在有需要的对象中降低皮肤损伤部位疤痕或疤痕疙瘩形成、再形成或生长或者治疗先前存在的疤痕或疤痕疙瘩的方法，所述方法包括通过在损伤部位或预先存在的疤痕或疤痕疙瘩的部位穿线状注射一或多次而给予对象一种组合物，所述组合物包含修饰的寡核苷酸或其盐或酯，靶向编码参与纤维化的蛋白质的核酸，给予的量能有效抑制所述蛋白质的表达及从而降低损伤部位疤痕或疤痕疙瘩形成、再形成或生长，或者治疗先前存在的疤痕或疤痕疙瘩。本发明进一步提供了一种在有需要的对象中降低损伤部位纤维性病变形成、再形成或生长或者治疗先前存在的纤维性病变的方法，包括通过在损伤部位或者先前存在的纤维性病变部位一或多次穿线状注射给予所述对象一种组合物，所述组合物包含修饰的寡核苷酸或其盐或酯，靶向编码参与纤维化的蛋白质的核酸，给予的量能有效抑制所述蛋白质的表达及从而降低在损伤部位的纤维性病变的形成、再形成或生长，或者治疗先前存在的纤维性病变。
[0038]在前述方法的一个实施方案中，一或多次穿线状注射包括每个疤痕多次皮内穿线状注射。
[0039]在前述的方法中，参与纤维化的蛋白质可以是结缔组织生长因子、转化生长因子 β -1、Mothers Against Decapentaplegic Homolog-3、早期生长应答蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-1、胶原蛋白、或者弹性蛋白。举例的合适的胶原蛋白是胶原蛋白3A1 (Collagen3Al),胶原蛋白 1A2 (CollagenlA2)和胶原蛋白 IAl (CollagenlAl)。
[0040]在本发明方法的某些实施方案中，有效量是每线性厘米的皮肤损害或先前存在的症痕部位每次注射0.l-50mg如0.l-25mg的修饰的寡核苷酸。
[0041]在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸每两周给予至少一次，给予至少四周，即至少两次。[0042]在其它实施方案中，修饰的寡核苷酸每三周给予至少一次，给予至少六周，即至少两次。
[0043]在其它的实施方案中，修饰的寡核苷酸每四周给予至少一次，给予至少八周。在再其它的实施方案中，修饰的寡核苷酸每八周给予至少一次，给予至少十六周。
[0044]目前考虑可优选修饰的寡核苷酸给予至少9周，例如给予26周。
[0045]在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸由12-30个连接的核苷组成，其所述修饰的寡核苷酸一至少12个核碱基序列的部分存在于选自SEQ ID N0:9的核苷酸553-611、718-751、1388-1423、1457-1689、2040-2069、2120-2147、2728-2797、2267-2301、1394-1423、1469-1508、1559-1605、1659-1689、2100-2129、和 1399-1423 的区域内。
[0046]在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸一至少12个核碱基序列的部分存在于SEQ IDN0:28、30、39、40、43、44、45、50、51、52、56、78、125、或 166 所示任何序列的核碱基序列内。
[0047]在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸由至少14个、如20个连接的核苷组成。
[0048]在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸是单链寡核苷酸。在其它实施方案中，修饰的寡核苷酸是双链寡核苷酸。
[0049]在其它的实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少一个寡脱氧核糖核苷酸或者至少一个寡核糖核苷酸。
[0050]在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有在其长度上与SEQ ID N0:28、30、39、40、43、44、45、50、51、52、56、78、125或166所不任一序列的一部分100%相同的序列。
[0051]在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键，如硫代磷酸酯核苷间键，由此一些或 所有核苷间键可以是硫代磷酸酯核苷间键。
[0052]在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸中至少一个核苷包含修饰的糖，如双环糖。在一些这样的实施方案中，至少一个修饰的糖包含2’ -O-甲氧基乙基。
[0053]在其它实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少一个四氢吡喃修饰的核苷，其中四氢吡喃环置换呋喃糖环。
[0054]在一些这样的实施方案中，所述至少一个四氢吡喃修饰的核苷各自具有如下结构:
[0055]
【权利要求】
1.一种在有需要的对象中治疗疤痕疙瘩或者预防皮肤损伤后疤痕疙瘩形成、再形成或生长的方法，所述方法包括通过在疤痕疙瘩部位或皮肤损伤部位进行一或多次注射而给予所述对象一种组合物，所述组合物包含由12-30个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸或其盐或酯，所述修饰的寡核苷酸的至少一 12个核碱基序列的部分存在于选自SEQ ID NO:9的核苷酸 553-611、718-751、1388-1423、1457-1689、2040-2069、2120-2147、2728-2797、2267-2301、1394-1423、1469-1508、1559-1605、1659-1689、2100-2129 和 1399-1423 的区域内，给予的量能有效治疗疤痕疙瘩或预防疤痕疙瘩的形成、再形成或生长，其中所述有效量是每线性厘米症痕挖瘡或皮肤损伤每次注射0.lmg-50mg所述修饰的寡核苷酸。
2.一种在有需要的对象中治疗肥大性疤痕或者预防皮肤损伤后肥大性疤痕形成、再形成或生长的方法，所述方法包括通过在肥大性疤痕部位或皮肤损伤部位进行一或多次注射而给予所述对象一种组合物，所述组合物包含由12-30个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸或其盐或酯，所述修饰的寡核苷酸的至少一 12个核碱基序列的部分存在于选自SEQ ID NO:9 的核苷酸 553-611、718-751、1388-1423、1457-1689、2040-2069、2120-2147、2728-2797、2267-2301、1394-1423、1469-1508、1559-1605、1659-1689、2100-2129 和1399-1423的区域内，给予的量能有效治疗肥大性疤痕或预防其形成、再形成或生长，其中所述有效量是每线性厘米肥大性疤痕或皮肤损伤每次注射0.lmg-25mg所述修饰的寡核苷酸。
3.一种在有需要的对象中降低皮肤损伤部位疤痕或疤痕疙瘩形成、再形成或生长或者治疗先前存在的疤痕或疤痕疙瘩的方法，所述方法包括通过在损伤部位或预先存在的疤痕或疤痕疙瘩的部位穿线状注射一或多次而给予所述对象一种组合物，所述组合物包含靶向编码参与纤维化的蛋白质的核酸的修饰的寡核苷酸或其盐或酯，给予的量能有效抑制所述蛋白质的表达，从而降低损伤部位的疤痕或疤痕疙瘩形成、再形成或生长，或者治疗先前存在的疤痕或疤痕疙瘩。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述一或多次穿线状注射包括每个疤痕多次皮内穿线状注射。
5.一种在有需要的对象中降低`损伤部位纤维性病变形成、再形成或生长或者治疗先前存在的纤维性病变的方法，包括通过在损伤部位或者先前存在的纤维性病变部位一或多次穿线状注射而给予所述对象一种组合物，所述组合物包含靶向编码参与纤维化的蛋白质的核酸的修饰的寡核苷酸或其盐或酯，给予的量能有效抑制所述蛋白质的表达，从而降低损伤部位的纤维性病变的形成、再形成或生长，或者治疗先前存在的纤维性病变。
6.权利要求3、4或5的方法，其中所述参与纤维化的蛋白质是结缔组织生长因子。
7.权利要求3、4或5的方法，其中所述参与纤维化的蛋白质是转化生长因子β-1。
8.权利要求3、4或5的方法，其中所述参与纤维化的蛋白质是MothersAgainstDecapentaplegic Homolog-3。
9.权利要求3、4或5的方法，其中所述参与纤维化的蛋白质是早期生长应答因子-1。
10.权利要求3、4或5的方法，其中所述参与纤维化的蛋白质是单核细胞趋化蛋白-1。
11.权利要求3、4或5的方法，其中所述参与纤维化的蛋白质是胶原蛋白。
12.权利要求11的方法，其中所述胶原蛋白是胶原蛋白3A1、胶原蛋白1A2或者胶原蛋白 1A1。
13.权利要求3、4或5的方法，其中所述参与纤维化的蛋白质是弹性蛋白。
14.权利要求3、4或者6-13任一项的方法，其中所述有效量是每线性厘米皮肤损伤部位或先前存在的症痕每次注射0.lmg-25mg所述修饰的寡核苷酸。
15.权利要求1-14任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸每两周给予至少一次，给予至少四周。
16.权利要求1-14任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸每三周给予至少一次，给予至少六周。
17.权利要求1-14任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸每四周给予至少一次，给予至少八周。
18.权利要求1-14任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸每八周给予至少一次，给予至少十六周。
19.权利要求15-18任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸给予至少九周。
20.权利要求15-18任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸给予26周。
21.权利要求6的方法，其中所述修饰的寡核苷酸由12-30个连接的核苷组成，所述修饰的寡核苷酸的至少一 12个核碱基序列的部分存在于选自SEQ ID NO:9的核苷酸553-611、718-751、1388-1423、1457-1689、2040-2069、2120-2147、2728-2797、2267-2301、1394-1423、1469-1508、1559-1605、1659-1689、2100-2129 和 1399-1423 的区域内。
22.权利要求1、2或6任一项的方法,其中所述修饰的寡核苷酸的至少一12个核碱基序列的部分存在于 SEQ ID N0:28、30、39、40、43、44、45、50、51、52、56、78、125 或 166 所示任一序列的核碱基序列内。
23.权利要求1-22任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成。
24.权利要求1-23任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少14个连接的核苷。
25.权利要求1-24任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸是单链寡核苷酸。
26.权利要求1-24任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸是双链寡核苷酸。
27.权利要求1-24任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个寡脱氧核糖核苷酸。
28.权利要求1-24任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个寡核糖核苷酸。
29.权利要求22的方法，其中所述修饰的寡核苷酸具有这样的序列，其在整个长度与SEQ ID N0:28、30、39、40、43、44、45、50、51、52、56、78、125 或 166 所示任一序列的一部分具有100%相同性。
30.权利要求1-29任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键。
31.权利要求30的方法，其中至少一个修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
32.权利要求31的方法，其中所有核苷间键均是硫代磷酸酯核苷间键。
33.权利要求1-29任一项的方法，其中至少一个核苷包含修饰的糖。
34.权利要求33的方法，其中所述修饰的糖是双环糖。
35.权利要求34的方法，其中至少一个修饰的糖包含2’-0-甲氧乙基。
36.权利要求1-29任一项的方法，包含至少一个四氢吡喃修饰的核苷，其中四氢吡喃环置换呋喃糖环。
37.权利要求36的方法，其中所述至少一个四氢吡喃修饰的核苷具有如下结构:
38.权利要求1-29任一项的方法，其中至少一个核苷包含修饰的核碱基。
39.权利要求38的方法，其中所述修饰的核碱基是脱氧核苷。
40.权利要求38的方法，其中所述修饰的核碱基是核糖核苷。
41.权利要求38的方法，其中所述修饰的核碱基是5’-甲基胞嘧啶。
42.权利要求1-29任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸包含:(a)由连接的脱氧核苷组成的缺口节段；(b)由连接的修饰的核苷组成的5’翼节段；及(c)由连接的修饰的核苷组成的3’翼节段；其中所述缺口节段位于5’翼节段与3’翼节段之间，且其中每个翼节段内的每个修饰的核苷均包含修饰的糖。
43.权利要求42的方法，其中所述修饰的寡核苷酸包含:(a)由13个连接的脱氧核苷组成的缺口节段；(b)由2个连接的修饰的核苷组成的5’翼节段；及(c)由5个连接的修饰的核苷组成的3’翼节段；其中所述缺口节段位于5’翼节段与3’翼节段之间，其中每个翼节段内的每个修饰的核苷均包含2’ -0-甲氧基乙基糖；且其中每个核苷间键是硫代磷酸酯键。
44.权利要求22的方法，其中所述核碱基的序列是SEQID N0:39所示序列。
45.权利要求22的方法，其中所述核碱基的序列是SEQID N0:40所示序列。
46.权利要求22的方法，其中所述核碱基的序列是SEQID N0:45所示序列。
47.权利要求22的方法，其中所述核碱基的序列是SEQID N0:52所示序列。
48.权利要求22的方法，其中所述核碱基的序列是SEQID NO: 166所示序列。
49.权利要求1-48任一项的方法，其中所述组合物包含修饰的寡核苷酸或其盐，以及药物可接受的载体或稀释剂。
50.权利要求1-49任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸直接或间接抑制胶原蛋白或弹性蛋白或者这二者的表达，由此治疗疤痕疙瘩，预防疤痕疙瘩形成、再形成或生长，治疗肥大性疤痕，预防肥大性疤痕形成、再形成或生长，降低损伤部位疤痕形成，治疗先前存在的疤痕，降低损伤部位纤维性病变形成，或者治疗先前存在的纤维性病变。
51.权利要求1-50任一项的方法，进一步包括给予所述对象第二种化合物。
52.权利要求51的方法，其中所述第二种化合物是靶向相同或不同序列的反义化合物。
53.权利要求52的方法，其中所述修饰的寡核苷酸和所述第二种化合物是同时给予的。
54.权利要求52的方法，其中所述修饰的寡核苷酸和所述第二种化合物是相继给予的。
55.权利要求1-54任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸与增强化合物吸收进对象和/或增加化合物在所述对象内存留时间的部分以缀合物形式存在，其中所述存留时间优选为7天-60天。
56.权利要求55的方法，其中所述部分是聚乙二醇、透明质酸、胆固醇、金刚烷乙酸、1_花丁酸、二氢睾酮、1，3- 二 -0-(十六烷基)甘油、十六烷基甘油、十六烷基胺、香叶基氧己基、棕榈酸、豆蘧酸、精胺、亚精胺、叶酸、维生素E、碳水化合物簇、肽(包括触角足螺旋、HIV Tat片段、整联蛋白结合肽)、转运蛋白、或者卟啉。
57.权利要求1-56任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸在输送系统中给予，该输送系统增强化合物吸收进对象和/或增加化合物在对象内的存留时间，其中所述存留时间优选为7-60天。
58.权利要求57的方法，其中所述输送系统包含阳离子脂质，脂质体，微粒，纳米颗粒，具有在溶液中的有或无药物的悬浮颗粒的用于即释的液体配制物或者药物被置于颗粒(特别是PLGA和poly-Arg颗粒)中的液体配制物，在注射后凝胶化的液体配制物如热固性/反应性液体(如普流尼克凝胶)，在生物相容性溶剂中含有聚合物和药物且当所述溶剂被体液稀释时沉淀的液体(如Atrigel)，凝胶，半固体配制物如水凝胶(具有基质背衬或者作为喷雾溶液)，在手术期间撒布的粉末，可再吸收的缝线，或者快速溶解凝胶或聚合物条带。
59.权利要求1-58任一项的方法，其中在手术切除疤痕疙瘩、疤痕或纤维性病变之后给予所述对象所述修饰的寡核苷酸。
60.权利要求1-58任一项的方法`，其中所述皮肤损伤是手术切口、活组织检查、皮肤穿刺、皮肤移除、烧伤或创伤的结果。
61.权利要求1-60任一项的方法，其中所述有效量是每线性厘米疤痕疙瘩、肥大性疤痕、皮肤损伤、损伤部位、先前存在的疤痕或者先前存在的纤维性病变每次注射大约5mg所述修饰的寡核苷酸。
62.权利要求1-61任一项的方法，其中给予所述修饰的寡核苷酸达6个月。
63.权利要求1-61任一项的方法，其中给予所述修饰的寡核苷酸达1年。
64.权利要求1-63任一项的方法，进一步包括给予对象另一种治疗剂。
65.权利要求64的方法，其中所述另一种治疗剂是类固醇，硅酮包，TGF-133(即Juvista)，胶原酶(即 Xyflex), 17 β -雌二醇(即 Zesteem)，IL-10 (即 Prevascar)，6_ 憐酸甘露糖(即Juvidex)，平滑肌松弛剂(即AZX100，24个氨基酸的合成肽)，干细胞治疗(即GBT009)，血清淀粉样蛋白，靶向整联蛋白a V0 6、CTGF、TGF0的抗体，或者抑制ALK-4和/或ALK-5(TGFi3受体)活性的分子，设计为阻断TNF活性的任何抑制剂(例如依那西普)，封闭敷裹，加压疗法，冷冻手术，手术切除，激光治疗，放射治疗，干扰素治疗，博来霉素，5-氟尿喃唳，维拉帕米，咪喹莫特乳膏，能促进伤口愈合的制剂如Dermagraft, Apligraf,TOGFOtegranex)，电刺激，作为一类的“生长因子”，作为一类的敷料，小肠粘膜下层(SIS)，Promo gran,高压氧,或者其组合。
66.权利要求23的方法，其中所述修饰的寡核苷酸通过配制物、超声、电穿孔、离子透入法或者显微操作针给予。
67.权利要求1-66任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸在疤痕疙瘩、肥大性疤痕、皮肤损伤、损伤部位、先前存在的疤痕或者先前存在的纤维性病变的附近给予。
68.权利要求67的方法，其中所述修饰的寡核苷酸沿着疤痕疙瘩、肥大性疤痕、皮肤损伤、损伤部位、先前存在的疤痕或者先前存在的纤维性病变的全长给予。
69.权利要求67任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸沿着疤痕疙瘩、肥大性疤痕、皮肤损伤、损伤部位、先前存在的疤痕或者先前存在的纤维性病变的每一侧给予。
70.权利要求1-69任一项的方法，其中所述修饰的寡核苷酸直接给予至疤痕疙瘩、肥大性疤痕、皮肤损伤、损伤部位、先前存在的疤痕或者先前存在的纤维性病变内。
71.权利要求1-70任一项的方法，其中皮内给予所述修饰的寡核苷酸。
72.权利要求1-70任一项的方法，其中通过穿线状注射技术皮内给予所述修饰的寡核苷酸。
73.权利要求1-70任一项的方法，其中皮下给予所述修饰的寡核苷酸。
74.权利要求1-70任一项的方法，其中表面给予所述修饰的寡核苷酸。
75.权利要求1-74任一项的方法，其中所述对象具有形成疤痕疙瘩或肥大性疤痕或者这二者的遗传倾向。
76.实施权利要求1-75任一项的方法的试剂盒，其包含:a.预先充填包含所述修饰的`寡核苷酸的组合物的装置'及b.使用说明书。
【文档编号】A61K31/7088GK103635197SQ201280016887
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年2月2日 优先权日:2011年2月2日
【发明者】N·M·迪安, L·克罗赫马尔, G·哈迪, J·G·福克斯, N·奥唐奈, L·杨, M·朱厄尔 申请人:埃克斯利尔德生物制药公司