一种用于预防和治疗炎症性疾病或哮喘的含有五瓣子楝树提取物的药物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于预防和治疗炎症性疾病或哮喘的包含五瓣子楝树提取物作为活性成分的药物组合物。本发明的五瓣子楝树提取物能够抑制卵清蛋白诱导的哮喘动物模型的支气管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞的增加，有抑制支气管肺泡灌洗液和血液中免疫球蛋白和趋化因子（嗜酸性粒细胞趋化因子）分泌物的活性，并抑制巨噬细胞中的NO和TNF-α分泌物。因此，本发明的五瓣子楝树提取物可以被有效地用作预防和治疗炎症性疾病或哮喘的药物组合物的活性成分，以及预防和改善炎症性疾病或哮喘的保健功能食品的活性成分。
【专利说明】一种用于预防和治疗炎症性疾病或哮喘的含有五瓣子楝树提取物的药物组合物
【背景技术】
[0001]1.【技术领域】
[0002]本发明涉及一种用于预防和治疗炎症性疾病或哮喘的含有五瓣子楝树提取物作为活性组分的药物组合物。
[0003]2.【背景技术】
[0004]炎症被定义为由外来感染源入侵形成的脓肿的病理状态，外来感染源例如细菌、真菌、病毒以及其他过敏原。尤其是，当外来细菌侵入特定组织并在其中繁殖时，白细胞识别它们并主动攻击繁殖的细菌。在这个过程中，死亡的白细胞随同被白细胞攻击后死亡的细菌所产生的细胞溶解物一起在组织中累积，导致脓肿形成。对炎症导致的脓肿的治疗集中于抗炎作用。抗炎作用指的是使用抗菌剂抑制入侵细菌繁殖，或通过激活巨噬细胞或提高巨噬细胞吞噬脓肿中累积的外来物质的功能从而帮助分解和消除这些入侵物质。
[0005]通常，炎症反应是被入侵损坏的组织的恢复和再生的一种防御机制，导致了结构变化，其中有局部血管、各种组织细胞和免疫细胞的参与。由外来物质入侵诱发的炎症反应是保护生物的一种正常防御机制。然而，非正常或过度诱发的炎症反应能引起各种疾病，被称作炎症性疾病。炎症性疾病是通过用各种炎症介质放大或持续炎症而将人类置于危险之中的疾病，各种炎症介质是在被外部刺激激活的目标细胞内分泌的，炎症疾病的例子如急性炎症、风湿性关节炎等关节疾病、牛皮癣等皮肤疾病以及支气管哮喘等过敏性疾病，等
坐寸ο
[0006]哮喘是以支气管对各种刺激过度敏感反应为特征的疾病，其临床症状为气喘、呼吸困难、以及由呼吸道内广泛狭窄引起的咳嗽。通常，这些症状可自然改善或通过治疗改善。在大多数情况下，哮喘是过敏反应，其特征为慢性气道炎症和支气管过度反应(Minoguchi K and Adachi M.Pathophysiology of asthma.1n:Cherniack NS, AltoseMD, Homma I,editors.Rehabilitation of the patient with respiratory disease.NewYork: McGraw-Hi 11, 1999, pp97-104o BP:Minoguchi K 和 Adachi M,哮喘的病理生理学。在:Cherniack NS, Altose MD, Homma I编辑,呼吸系统疾病患者的康复,纽约:麦格劳_希尔，1999，第 97-104 页)。
[0007]哮喘主要分为两类，分别为外源性哮喘和内源性哮喘。外源性哮喘通过暴露于过敏原发展出症状。当皮肤测试或支气管激发测试对一定的过敏原呈阳性时可被诊断为外源性哮喘，并且常见于年轻人群。外源性哮喘的主要原因是室内灰尘和尘球，其他次要原因例如花粉、动物的上皮细胞和真菌。内源性哮喘是由上呼吸道道感染、运动、焦虑、寒冷气候和湿度变化诱发或加重的，常见于成年人中。还有其他哮喘的例子，如药物诱发的哮喘、运动诱发的哮喘、以及职业性哮喘等等。
[0008]哮喘通常被理解为由已经被TH2免疫细胞产生的白细胞介素_4、-5和-13增殖、分化并激活的炎症细胞在呼吸道内和呼吸道周围组织内迁移和浸润引起的慢性炎症疾病(Elias JA, et al.，J.Clin.1nvest.，111，pp291_297, 2003。即:Elias JA 等，临床研究杂志，111，第291-297页，2003年)。在那种情况下，被激活的炎症细胞例如被激活的中性粒细胞、肥大细胞以及肺泡巨噬细胞，分泌多种炎症介质(半胱氨酸、白三烯和前列腺素)，在强烈的支气管收缩反应中发挥重要作用(Maggi E.，Immunotechnology, 3，pp233_244,1998;Pawankar R., Curr.0pin.Allergy Clin.Tmmunol., I, pp3-6, 2001;Barnes PJ,etal., Pharmacol Rev.，50，pp515_596, 1998。即 Maggi E.，免疫学技术，3，第 233-244 页，1998年；Pawankar R.，免疫学新见，1，第3_6页，2001年；Barnes PJ等,药理学评论,50,第515-596 页，1998 年)。
[0009]细胞因子例如IL-4、IL-5和IL-13的生成，以及炎症细胞的激活和半胱氨酸白三烯的生物合成中涉及的在炎症细胞内分泌的免疫球蛋白E，包括由上述生成介导的嗜酸性粒细胞，是引发可导致哮喘的炎症和过敏反应的关键因素。因此，已经尝试开发新的药物以抑制细胞因子和免疫球蛋白E的生成。
[0010]如今已经采用了各种哮喘药，但是其中许多具有副作用，需要慎重考虑。吸入型糖皮质激素仍是最重要的具有优良效果的哮喘治疗药物。但是，当糖皮质激素被长期使用时，会产生严重的副反应，如肾上腺功能抑制、骨矿物质密度降低、影响生长发育、以及引发眼睛和皮肤的并发症。在以前的报告中，糖皮质激素据称能够增强胶原蛋白的合成(ffarshmana GS, et al., Am J Physiol274, 499-507，1998。SP:Warshmana GS 等，美国生理学杂志，274，第499-507页，1998年)。即使使用糖皮质激素治疗多年后，使慢性哮喘患者的支气管过度反应性正常化的机会也是非常小的。长期服用β-2激动剂也不能很有效地抑制气道重塑((Jeffery PK, et al., Am Rev Respir Disl45:890_0，1992。即:Jeffery PK等，美国呼吸系疾病评论145:890-0，1992年)。连续服用β_2激动剂如沙美特罗(Salmeterol)和福莫特罗(Formoterol)可以防止哮喘加剧，但同时也可能引起哮喘患者的死亡。尽管这种副作用已经被连续报道，但基于哮喘缓解作用大于副作用风险的信念，该药仍然被开出。对副作用比较敏感的儿童哮喘患者的成长速度进行了测量。结果，口服白三烯拮抗剂(孟鲁司特(montelukast))治疗的儿童哮喘患者的成长速度比吸入型糖皮质激素治疗的儿童哮喘患者的成长速度快I cm /年(Garcia Garcia ml, etal.，Pediatricsll6 (2):360-9, 2005。即=Garcia Garcia ml 等，儿科学 116 (2): 360-9，2005年)。如果在成长期间哮喘治疗`不当，可能抑制或损坏肺乃至整个身体的成长。因此，有必要以稳定的治疗维持正常健康的肺功能。已被确认的是，通过使用安全的药物进行长期的治疗以控制气道内的炎症是更重要的。因此，在选择哮喘治疗药物之前同时考虑哮喘的缓解效果和副作用也是很重要的。已知白三烯拮抗剂具有低的副作用风险，因此其一直被开出用于预防和长期治疗哮喘。然而，其哮喘治疗效果弱于其他药物，表明只有三分之一的哮喘患者得到改善。因此，仍然需要开发一种新的安全无毒并且不会引起耐药性的哮喘治疗剂。
[0011]五瓣子楝树是一种低矮灌木，叶片薄且彼此相对。它具有淡粉红色的花和紫色的果实，果实结有大量种子。这种灌木广泛分布于緬甸、澳大利亚和太平洋岛屿。其在火山土壤中生长茂盛。已经有报道指出，含有草药提取物和五瓣子楝树提取物的化妆品组合物能够改善干燥皮肤，使皮肤水润油滑(Ohara, Mitsuharu&Hori, Michimasa,日本2001220312)。还有报道指出，这种灌木的嫩叶和花耳提取物在使头发生长和变黑方面是有效的。但是，这种植物的抗炎作用和抗哮喘作用还没有被公开过。[0012]本发明的发明人已经尝试开发一种使用天然物质治疗炎症性疾病或哮喘的新型药物。结果，本发明人证实，五瓣子楝树的提取物减少了气道致敏小鼠模型的支气管肺泡灌洗液中的炎症细胞、免疫球蛋白和趋化因子，并抑制了体外脂多糖诱导的炎症反应。因此，通过进一步证实，五瓣子楝树的提取物可以被有效地用作炎症性疾病或哮喘的预防和治疗剂的有效成分，本发明人完成了本发明。
【发明内容】
[0013]本发明的目的是提供一种用于预防和治疗炎症性疾病或哮喘的组合物，以及含有五瓣子楝树提取物作为活性成分的保健功能食品。
[0014]为达到上述目的，本发明提供了一种用于预防和治疗炎症性疾病的药物组合物，含有五瓣子楝树提取物作为活性成分。
[0015]本发明还提供了一种用于预防和治疗哮喘的药物组合物，含有五瓣子楝树提取物作为活性成分。
[0016]本发明还提供了一种用于预防和改善炎症性疾病的保健功能食品，含有五瓣子楝树提取物作为活性成分。
[0017]本发明还提供了一种用于预防和改善哮喘的保健功能食品，含有五瓣子楝树提取物作为活性成分。
[0018]本发明还提供了一种治疗炎症性疾病的方法，包括向具有炎症性疾病的主体施用药学有效剂量的五瓣子楝树提取物的步骤。
[0019]本发明还提供了一 种预防炎症性疾病的方法，包括向主体施用药学有效剂量的五瓣子楝树提取物的步骤。
[0020]本发明还提供了一种治疗哮喘的方法，包括向具有哮喘的主体施用药学有效剂量的五瓣子楝树提取物的步骤。
[0021]本发明还提供了一种预防哮喘的方法，包括向主体施用药学有效剂量的五瓣子楝树提取物的步骤。
[0022]本发明还提供了用作预防和治疗炎症性疾病的组合物的五瓣子楝树提取物。
[0023]本发明还提供了用作预防和治疗哮喘的组合物的五瓣子楝树提取物。
[0024]本发明还提供了用作预防和改善炎症性疾病的保健功能食品组合物的五瓣子楝树提取物。
[0025]此外，本发明提供了用作预防和改善哮喘的保健功能食品组合物的五瓣子楝树提取物。
[0026]有益效果
[0027]如在上文中所阐明的，本发明的五瓣子楝树提取物不仅减少了气道被卵清蛋白敏化的小鼠的支气管肺泡灌洗液中的炎症细胞、免疫球蛋白和嗜酸性粒细胞趋化因子，还抑制了由这种炎症细胞的浸润诱发的哮喘，并减少了由这种炎症因子如脂多糖(LPS)诱发的NO和TNF-α分泌物。因此，本发明的五瓣子楝树提取物可以被有效地用作预防和治疗炎症性疾病或哮喘的药物组合物的活性成分，以及预防和改善炎症性疾病或哮喘的保健功能食品的活性成分。【专利附图】
【附图说明】
[0028]参照附图，可以最好地理解本发明的优选实施例的应用，其中:
[0029]图1是一个曲线图，示出了五瓣子楝树提取物对气道用卵清蛋白敏化的小鼠的支气管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的作用效果:
[0030]NC:气道未被敏化的组；
[0031]OVA:气道用卵清蛋白敏化的组；
[0032]Dex:用浓度为30mg/kg的地塞米松(dexamethason)处理的组；
[0033]DF-20:用浓度为20mg/kg的五瓣子楝树提取物处理的组；以及
[0034]DF-40:用浓度为40mg/kg的五瓣子楝树提取物处理的组。
[0035]图2是一组曲线图，示出了五瓣子楝树提取物对气道用卵清蛋白敏化的小鼠的血液中免疫球蛋白水平的作用效果:
[0036]图2a示出了五瓣子楝树提取物对气道用卵清蛋白敏化的小鼠的血液中免疫球蛋白E (IgE)水平的作用效果；
[0037]NC:气道未被敏化的组；
[0038]OVA:气道用卵清蛋白敏化的组；
[0039]Dex:用浓度为30mg/kg的地塞米松处理的组；
[0040]DF-20:用浓度为20mg/kg的五瓣子楝树提取物处理的组；以及
[0041]DF-40:用浓度为40mg/kg的五瓣子楝树提取物处理的组。
[0042]图2b示出了五瓣子楝树提取物对气道用卵清蛋白敏化的小鼠的血液中免疫球蛋白Gl (IgGl)水平的作用效果；
[0043]NC:气道未被敏化的组；
[0044]OVA:气道用卵清蛋白敏化的组；
[0045]Dex:用浓度为30mg/kg的地塞米松处理的组；
[0046]DF-20:用浓度为20mg/kg的五瓣子楝树提取物处理的组；以及
[0047]DF-40:用浓度为40mg/kg的五瓣子楝树提取物处理的组。
[0048]图3示出了五瓣子楝树提取物对气道用卵清蛋白敏化的小鼠的支气管肺泡灌洗液中趋化因子水平的作用效果；
[0049]NC:气道未被敏化的组；
[0050]OVA:气道用卵清蛋白敏化的组；
[0051]Dex:用浓度为30mg/kg的地塞米松处理的组；
[0052]DF-20:用浓度为20mg/kg的五瓣子楝树提取物处理的组；以及
[0053]DF-40:用浓度为40mg/kg的五瓣子楝树提取物处理的组。
[0054]图4示出了五瓣子楝树提取物对气道用卵清蛋白敏化的小鼠的气道粘膜中炎症细胞浸润的作用效果，由HE (苏木精-伊红(hematoxylin-eosin))染色证实:
[0055]NC:气道未被敏化的组；
[0056]OVA:气道用卵清蛋白敏化的组；
[0057]Dex:用浓度为30mg/kg的地塞米松处理的组；
[0058]DF-20:用浓度为20mg/kg的五瓣子楝树提取物处理的组；以及
[0059]DF-40:用浓度为40mg/kg的五瓣子楝树提取物处理的组。[0060]图5示出了五瓣子楝树提取物对RAW264.7细胞中由脂多糖(LPS)诱发的NO生成的抑制效果:
[0061]*:ρ〈0.05;以及
[0062]#:ρ<0.005.[0063]图6示出了五瓣子楝树提取物对RAW264.7细胞中由脂多糖(LPS)诱发的TNF-α生成的抑制效果:
[0064]*:ρ〈0.05;以及
[0065]#:ρ<0.005.【具体实施方式】[0066]下文详细描述本发明。
[0067]本发明提供一种用于预防和治疗炎症性疾病或哮喘的含有五瓣子楝树提取物作为活性组分的药物组合物。
[0068]该炎症性疾病优选选自但不限于皮炎、过敏症、特应症、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠炎、痔疮、痛风、强直性脊柱炎、风湿热、红斑狼疮、纤维肌痛症、银屑病关节炎、骨关节炎、类风湿关节炎、肩周炎、肌腱炎、腱鞘炎、腱周围炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、干燥综合征、多发性硬化症、以及急性和慢性炎症性疾病。
[0069]该五瓣子楝树提取物优选通过以下步骤制备，但不限于以下步骤:
[0070]I)使用提取溶剂对五瓣子楝树进行提取；
[0071]2)过滤步骤I)的提取物；
[0072]3)减压浓缩步骤2)中滤过的提取物；以及
[0073]4)冷冻干燥步骤3)中得到的浓缩物。
[0074]这里的五瓣子楝树可以从种植方式获得，或从市场上购买。
[0075]在上述方法中，步骤I)中的提取溶剂优选选自水、醇及它们的混合物，或更优选地选自Ci_C2的低级醇及它们的混合物，但并不限于此。此时，此处的低级醇优选是甲醇或乙醇，但并不限于此。提取溶剂的量优选为五瓣子楝树干重的5 —15倍，更优选为干重的7…10倍,但不限于此。
[0076]在上述方法中，提取方法选自热水提取法、脂吸法、回流提取、以及超声提取法，但不限于此。在上述方法中，优选的提取温度为10℃~100℃，更优选室温。提取时间优选为30分钟~3小时,更优选为1-2小时,但不限于此。该提取优选重复I~5ft,更优选为重复3次，但不限于此。
[0077]在上述方法中，步骤3)的减压浓缩优选使用旋转蒸发器进行，但并不局限于此。为了干燥提取物(步骤4 )，优选进行冷冻干燥，但并不局限于此。
[0078]在本发明的一个优选实施方式中，用卵清蛋白敏化小鼠的支气管，用本发明的五瓣子楝树提取物对该小鼠进行治疗。其结果是，支气管肺泡灌洗液中的炎症细胞如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞减少了(参见图1)。此外，通过剂量依赖性地施用五瓣子楝树提取物降低了血液中的免疫球蛋白水平(参见图2)。还证实，通过施用五瓣子楝树提取物，下调了气道用卵清蛋白敏化的小鼠的支气管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞趋化因子，嗜酸性粒细胞趋化因子是已知的导致过敏性疾病的趋化因子中的一种(见图3)。还观察了气道用卵清蛋白敏化的小鼠的肺组织。其结果是，在用卵清蛋白敏化的小鼠的肺组织中观察到了包括嗜酸性粒细胞的炎症细胞的浸润。然而，用本发明的五瓣子楝树提取物治疗的实验组中，肺组织中嗜酸性粒细胞数减少了(参见图4)。[0079]在本发明的一个优选实施方式中，观察到，通过使用本发明的五瓣子楝树提取物治疗，减少了 NO和TNF-α的生成，已知NO和TNF-α参与通过脂多糖(LPS)处理诱发的炎症，已知脂多糖在体外诱发炎症(参见图5和图6)。
[0080]因此，本发明的五瓣子楝树提取物可以被有效地用作预防和治疗炎症性疾病或哮喘的药物组合物的活性成分。
[0081 ] 本发明的组合物可以口服或肠道外给药(例如，敷用，静脉注射，皮下注射，或腹腔注射)，但优选口服给药。
[0082]对于肠道外给药的剂型，可以通过常规方法制备粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、灭菌悬浮液剂、液体剂、不溶于水的赋形剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、栓剂、外用如气雾剂和灭菌注射剂，并且优选地可制备皮肤外用药物组合物，例如霜剂、凝胶剂、贴片、喷雾剂、软膏剂、硬膏剂、洗剂、搽剂、糊剂或泥敷剂，但不限于此。局部给药的组合物根据临床的处方可以是无水的或含水的。不溶于水的赋形剂和混悬剂除了含有活性化合物或混合物外，可以含有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射酯如油酸乙酯等。栓剂除了含有活性化合物或混合物外，可以含有饱和脂肪酸混合物的甘油酯(wit印sol)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、三月桂酸甘油脂，甘油明胶等。
[0083]用于口服给药的固体制剂是粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂和丸剂。用于口服给药的液体制剂为混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂和气雾剂，上述制剂除了含有常用的简单稀释剂例如水和液体石蜡外，可以含有各种赋形剂，如润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。
[0084]本发明的组合物除了包含上述有效成分外，还可以包含一种或多种药学上可接受的载体用于给药。该药学上可接受的载体可以通过混合一个以上的成分来选择或制备，该成分选自生理盐水、无菌水、林格氏溶液(Ringer’ s solution)、缓冲盐水、葡萄糖溶液、右旋麦芽糖(maltodextrose)溶液、甘油和乙醇。可以添加其他普通的添加剂，如抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等等。为了制备如水溶液、悬浮液和乳状液等可注射溶液，可以添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂。
[0085]本发明的药物组合物中优选含有药学上可接受的添加剂，以该组合物的总重量计，该添加剂的含量为1 重量份，但并不局限于此。
[0086]本发明的药物组合物的有效剂量可由本领域技术人员根据活性成分的吸收率，以及患者的年龄、性别和肥胖情况来确定。在口服给药的情况下，对于成年人该药物组合物每天可以施用0.0001~100毫克/千克，更优选每天0.001~100毫克/千克。给药频率为一天一次或一天几次。该剂量不能以任何方式限制本发明的范围。
[0087]本发明的预防和治疗炎症性疾病的药物组合物除了包含五瓣子楝树提取物外，可以包含一种或多种与该五瓣子楝树提取物具有相同或类似功能的有效成分。
[0088]本发明的预防和治疗哮喘的药物组合物除了包含五瓣子楝树提取物外，可以包含一种或多种与该五瓣子楝树提取物具有相同或类似功能的有效成分。[0089]本发明还提供了一种用于预防和改善炎症性疾病或哮喘的包含五瓣子楝树提取物作为活性成分的保健功能食品。
[0090]在本发明的一个优选实施方式中，观察到，通过本发明的五瓣子楝树提取物的治疗，减少了 NO和TNF-α的生成，已知NO和TNF-α参与由脂多糖(LPS)处理诱发的炎症，已知脂多糖在体外诱发炎症。因此，本发明的五瓣子楝树提取物可以被有效地用作预防和改善炎症性疾病的保健功能食品的活性成分。
[0091]在本发明一个优选的实施方式中，用卵清蛋白敏化小鼠的气道，用本发明的五瓣子楝树提取物对该小鼠进行治疗。其结果是，与未用五瓣子楝树提取物治疗的对照组相比，支气管肺泡灌洗液中的炎症细胞水平、免疫球蛋白水平和嗜酸性粒细胞趋化因子的水平显著降低。因此，本发明的五瓣子楝树提取物可以被有效地用作预防和改善哮喘的保健功能食品的活性成分。
[0092]在此，五瓣子楝树提取物优选是用水、醇或它们的混合物为提取溶剂提取的。此时，醇优选是C1-C2的低级醇，但并不限于此。所述炎症性疾病优选地选自皮炎、过敏症、特应症、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃体炎、肺炎、胃肠溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠炎、痔疮、痛风、强直性脊柱炎、风湿热、红斑狼疮、纤维肌痛(纤维肌痛)、银屑病关节炎、骨关节炎、类风湿关节炎、肩周炎、肌腱炎、腱鞘炎、腱周围炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、干燥综合征、多发性硬化症、以及急性和慢性炎症性疾病，但并不限于此。
[0093]本发明的五瓣子楝树提取物，通过将该提取物与食品营养学上可接受的载体混合，可以作为食品组合物提供。
[0094]当本发明的五瓣子楝树提取物被用于食品或饮料时，按照常规方法，该五瓣子楝树提取物可以在与其它食品或成分混合时添加，或与其它食品或成分混合后添加。根据使用的目的(预防、保健增强或治疗)可以对五瓣子楝树提取物的混合比例进行调节。
[0095]如果出于健康卫生 或调节健康状况的目的需要长期给药，可以长期施用该五瓣子楝树提取物，因为本发明的提取物已被证明是非常安全的。
[0096]此处的食品没有限制。例如，本发明的五瓣子楝树提取物可以被添加到肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、小吃、饼干、比萨饼、拉面、面粉制品、树胶、包括冰淇淋的乳制品、汤、饮料、茶、酒水、酒精饮料和复合维生素等。
[0097]含有本发明的五瓣子楝树提取物的保健饮料可以另外包含各种香料或天然碳水化合物等，类似其他饮料。上述天然碳水化合物可以是单糖(例如:葡萄糖、果糖等)、双糖(例如:麦芽糖、蔗糖等)、多糖(例如:糊精、环糊精等)以及糖醇中的一种，糖醇例如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。天然碳水化合物的含量优选为I — 20克每100克本发明的组合物，更优选为5 — 12克每100克本发明的组合物。此外，还可以包含天然甜味剂(例如:索马甜，甜叶菊提取物，例如莱鲍迪甙Α、甘草酸等)和合成甜味剂(例如:糖精、阿斯巴甜等)作为甜味剂。
[0098]除了上述成分外，本发明的食品组合物可以包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、包括天然香料和合成香料的香料、着色剂和填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增粘剂、PH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、以及过去被添加到苏打中的碳酸化剂等。本发明的食品组合物还可以包含天然果汁、水果饮料和/或可添加到蔬菜饮料中的果肉。所有上述成分可以单独加入或一起加入。这些成分的混合比例实际上并不重要，但在一般情况下，以本发明的组合物的总重量计每个成分可以添加0.001—5 O重量份ο
[0099]本发明还提供了一种治疗炎症性疾病的方法，包含向具有炎症性疾病的主体施用药学有效剂量的五瓣子楝树提取物的步骤。
[0100]本发明还提供了一种预防炎症性疾病的方法，包含向主体施用药学有效剂量的五瓣子楝树提取物的步骤。
[0101]本发明还提供了一种治疗哮喘的方法，包含向具有哮喘病的主体施用药学有效剂量的五瓣子楝树提取物的步骤。
[0102]本发明还提供了一种预防哮喘病的方法，包含向主体施用药学有效剂量的五瓣子楝树提取物的步骤。
[0103]在本发明的一个优选实施方式中，用卵清蛋白敏化小鼠的支气管，用本发明的五瓣子楝树提取物对该小鼠进行治疗。其结果是，支气管肺泡灌洗液中的炎症细胞如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞减少了(参见图1)。此外，通过剂量依赖性地施用五瓣子楝树提取物降低了血液中的免疫球蛋白水平(参见图2)。还证实，通过施用五瓣子楝树提取物，下调了气道用卵清蛋白敏化的小鼠的支气管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞趋化因子，已知嗜酸性粒细胞趋化因子是导致过敏性疾病的趋化因子中的一种(见图3)。还观察了气道用卵清蛋白敏化的小鼠的肺组织。其结果是，在用卵清蛋白敏化的小鼠的肺组织中观察到包括嗜酸性粒细胞的的炎症细胞浸润。然而，在用本发明的五瓣子楝树提取物治疗的实验组的肺组织中，嗜酸性粒细胞数减少了(参见图4)。
[0104]在本发明的一个优选实施方式中，观察到，通过本发明的五瓣子楝树提取物的治疗，减少了 NO和TNF-α的生成，已知NO和TNF-α参与由脂多糖(LPS)处理诱发的炎症，已知脂多糖在体外诱发炎症(参见图5 和图6)。
[0105]因此，本发明的五瓣子楝树提取物可以被有效地用于预防或治疗炎症性疾病或哮喘的方法。
[0106]本发明还提供了用作预防和治疗炎症性疾病的组合物的五瓣子楝树提取物。
[0107]本发明还提供了用作预防和治疗哮喘的组合物的五瓣子楝树提取物。
[0108]本发明还提供了用作预防和改善炎症性疾病的保健功能食品组合物的五瓣子楝树提取物。
[0109]此外，本发明提供了用作预防和改善哮喘的保健功能食品组合物的五瓣子楝树提取物。
[0110]本发明的五瓣子楝树提取物不仅减少了气道被卵清蛋白敏化的小鼠的支气管肺泡灌洗液中的炎症细胞、免疫球蛋白和嗜酸性粒细胞趋化因子，还抑制了由这种炎症细胞的浸润诱发的哮喘，并减少了由这种炎症因子以及脂多糖(LPS)诱发的NO和TNF-α分泌物。因此，本发明的五瓣子楝树提取物可以被有效地用作预防和治疗炎症性疾病或哮喘的药物组合物的活性成分，或预防和改善炎症性疾病或哮喘的保健功能食品的活性成分。
[0111]如下面的实施例、实验例和制造例，本发明的实际实施方式和目前优选的实施方式中进行了说明性的描述。
[0112]然而，应该明白，本领域技术人员在参考本公开后，可以在本发明的精神和范围内作出修改和改进。
[0113]实施例1:五瓣子楝树提取物
[0114]本发明的发明人从韩国生物科学与技术研究所的国际生物材料研究中心购买了五瓣子楝树。为了获得五瓣子楝树提取物，取五瓣子楝树的地上部分(叶和茎)并干燥。然后取100克干燥的样品进行粉碎，向粉碎的样品中加入800ml95%的乙醇，随后在室温下回流提取24小时。收集滤过的上清液。该过程重复两次，以收集上清液。将所得到的上清液在减压条件下浓缩，得到2克五瓣子楝树提取物。
[0115]实验例1:五瓣子楝树提取物的抗炎作用
[0116]8周龄无特定病原体的雌性Balb/c小鼠(体重:约20克)均购自韩国的东方有限公司。2mg氢氧化招(西格玛公司Sigma A8222)和20 μ g卵清蛋白(西格玛公司A5503)被悬浮于200 μ I的磷酸盐缓冲液PBS (ρΗ7.4)中，通过腹腔注射将其施用给每只小鼠，间隔2周给药两次,用于敏化。在第28天、第29天和第30天,用超声波喷雾器将含1%卵清蛋白的PBS缓冲液喷洒于小鼠所居住的密封笼，喷洒20分钟。阴性对照组由6只气道未被敏化的小鼠组成。阳性对照组由6只气道用卵清蛋白敏化的小鼠组成。对比组由6只用浓度为30mg/kg的地塞米松治疗的小鼠组成。实验组由6只小鼠组成，该6只小鼠在给予抗原之前一小时口服含20mg/kg或40mg/kg五瓣子楝树甲醇提取物的PBS缓冲液。
[0117]在最后给予抗原48小时后，施用过度剂量的戊巴比妥(西格玛公司P3761)以杀死动物，然后切开其气管。通过套管插入法从气管中收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，一次
0.6ml，收集三次，然后通过下面的方法对炎性细胞和嗜酸性粒细胞进行计数。
[0118]将100 μ I从各组获得的支气管肺泡灌洗液担载在载玻片上，然后使用细胞离心涂片器(哈尼尔有限公司Hanil C0.，韩国)进行离心，从而将细胞固定在载玻片上。用台盼蓝对细胞染色，用血细胞计数器对死细胞以外的细胞计数，重复三次(戴格尔艾等人，2001年)。
[0119]用Diff-Quick试剂(希森美康Sysmex,目录号38721,瑞士)染色后计算嗜酸性粒细胞的数目，采用与上述总细胞计数方式相同的方式进行计数。采用学生t检验法(Student’s t-test)进行统计分析，以P值代表显著性。
[0120]结果为，如图1所示，与未被敏化的阴性对照组的正常小鼠相比，用卵清蛋白敏化的并被施用PBS缓冲液的阳性对照组小鼠显示出炎症细胞数目迅速增加。但是，在用五瓣子楝树提取物处理的组中，通过用提取物进行剂量依赖性地治疗，炎症细胞如嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的增加数目均被减小了(图1)。
[0121]实验例2:五瓣子楝树提取物对免疫球蛋白生成的影响
[0122]<2-1>五瓣子楝树提取物对免疫球蛋白E (IrE)生成的抑制效果
[0123]为了测量动物血清中的免疫球蛋白E(IgE)的水平，将实验例I中得到的各实验组的血清在稀释溶液中稀释40倍。将100 μ I稀释后的溶液加载到96-孔板内，在该96-孔板内附有20 μ g用于诱发哮喘的卵清蛋白，然后在室温下诱发抗原-抗体反应2小时。
[0124]结果为，如图2a所示，其证实，在卵清蛋白致敏的小鼠组中免疫球蛋白E(IgE)的水平迅速增加。同时，在用五瓣子楝树提取物处理的组中免疫球蛋白E的产生被显著抑制。该结果与用已知具有抗炎作用的地塞米松处理的阳性对照组的结果一致。因此，可以确认，本发明的五瓣子楝树提取物有效地抑制了卵清蛋白特异性免疫球蛋白E的产生，免疫球蛋白E的产生在引起过敏性症状的机制中起着一定作用(图2a)。
[0125]<2-2>五瓣子楝树提取物对免疫球蛋白Gl (IrGI)生成的抑制效果
[0126]为了测量动物血清中的免疫球蛋白Gl的水平，将实验例I中得到的各实验组的血清在稀释溶液中稀释40倍。将100 μ I稀释后的溶液加载到96-孔板内，在该96-孔板内附有20 μ g用于诱发哮喘的卵清蛋白，然后在室温下诱发抗原-抗体反应2小时。
[0127]结果为，如图2b所示，其证实，在卵清蛋白致敏的小鼠组中卵清蛋白特异性免疫球蛋白Gl的水平迅速增加。同时，在用本发明的五瓣子楝树提取物处理的组中卵清蛋白特异性免疫球蛋白Gl的生成被显著抑制(图2b)。
[0128]实验例3:五瓣子楝树提取物对趋化因子的影响
[0129]众所周知，嗜酸性粒细胞趋化因子基因会补充和激活CCR3，CCR3含有在过敏性疾病中发挥重要作用的细胞，如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、以及Th2淋巴细胞(Lilly，C.M.etal., J.Allergy Clin.1mmunol, 108，946-53，2001。即 Lilly’C.M.等人，过敏与临床免疫学杂志，108，第946-53页，2001年)。在本发明中，用五瓣子楝树提取物处理卵清蛋白敏化的小鼠，然后测量支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞趋化因子(趋化因子中的一种)的含量。
[0130]为了测量嗜酸性粒细胞趋化因子的含量，进行了夹心式酶联免疫吸附测定(ELISA)0具体地，将100 μ I实验例I中得到的各实验组的支气管肺泡灌洗液加载到附着有细胞因子抗体的96-孔板中，然后在室温下诱导抗原-抗体反应2小时。为了测量嗜酸性粒细胞趋化因子的含量，使用专门针对每个细胞因子反应的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(生物资源国际公司，卡马里洛，加拿大)。根据生产商的方案测定趋化因子的含量。
[0131]结果是，如图3所示，其证实，在卵清蛋白致敏的小鼠组中嗜酸性粒细胞趋化因子的含量增加。同时,与卵清蛋白 处理的组相比,在五瓣子楝树提取物处理的组中嗜酸性粒细胞趋化因子的含量减少(图3)。也就是说，本发明的五瓣子楝树提取物可有效地用于过敏性疾病如哮喘(图3)。
[0132]实验例4:五瓣子楝树提取物对炎症细胞浸润的影响
[0133]将实施例1中的各实验组的肺组织固定在10%的中性福尔马林缓冲液中24小时，然后进行石蜡包埋。包埋组织被切成4_的段，用苏木精和伊红Y (eosin Y)(珊顿公司，匹兹堡，宾夕法尼亚州)对其进行染色，然后用Dako-封片剂(丹科公司，丹麦)安装在载玻片上。染色和安装完成后，在光学显微镜下检查载玻片。
[0134]结果是，如图4所示，与气道未被敏化的对照组小鼠相比，在气道被卵清蛋白敏化的小鼠的肺泡和细支气管中诱发了哮喘。另外，在敏化的小鼠中，上皮细胞受到伤害，炎症细胞包括嗜酸性粒细胞渗入到细支气管的周围。与此同时，在五瓣子楝树提取物治疗的小鼠中，炎症细胞包括嗜酸性粒细胞的数目显著减少，几乎没有观察到上皮细胞损伤。以上结果与实验例I中所示的通过五瓣子楝树提取物的治疗减少了炎症细胞和嗜酸性粒细胞的现象是一致的(图4)。
[0135]因此，可以确认，本发明的五瓣子楝树提取物通过减少包括嗜酸性粒细胞的炎症细胞的浸润抑制了哮喘，并防止上皮细胞被损坏，因此，它可以被有效地用于预防或治疗由炎症细胞浸润引起的过敏性疾病。
[0136]实验例5:五瓣子楝树提取物对巨噬细胞中NO分泌的抑制作用
[0137]本发明的发明人通过脂多糖(LPS)处理在Raw264.7细胞中诱发炎症，然后测量诱导型一氧化氮(NO)的生成以评估抗炎作用。具体地，将Raw264.7细胞悬浮在不含酚红的细胞培养基(DMEM)中(达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium),Gibco)中，该培养基补充有密度为5XlOVml的FBS (10%)。将细胞悬浮液注射到96孔板内。附着4小时后，用不同浓度的五瓣子楝树提取物处理，然后培养I小时。用lyg/ml的脂多糖(LPS，西格玛公司)处理，随后进一步培养24小时。培养完成后，得到ΙΟΟμ I上清液，将该上清液放置在一个新的96-孔板中。向其中加入等体积的格里斯试剂(西格玛公司)，随后在室温下反应10分钟。然后，用酶标仪(伯乐公司Bio-Rad)测定0D55Q。
[0138]用不同浓度的亚硝酸钠溶解在相同的介质中制备的亚硝酸钠标准曲线测定培养液中NO的产生。将LPS处理的组中产生的NO的量视为100%，基于此按百分比计算各样品的抑制率。采用学生t检验法进行统计分析，以P值(*;P〈0.05)代表显著性。
[0139]其结果，如图5所示，与用赋形剂处理的阴性对照组相比，用LPS处理的组中NO的生成显着增加。但是，与用LPS处理的组相比，用五瓣子楝树提取物处理的组中NO的生成显著减少(图5)。
[0140]实验例6:五瓣子楝树提取物对巨噬细胞中TNF-α生成的抑制作用
[0141]为了研究该提取物对炎症的抑制作用，该炎症是通过用LPS处理Raw264.7细胞有意增加的，本发明的发明人测量了 TNF-α的生成情况，TNF-α是炎症因子之一。具体地，使用TNF-α特异性酶联免疫吸附测定试剂盒ELISA kit(生物资源国际公司，卡马里洛，加拿大)，按照生产商的方案测定〈实验例5>中得到的上清液中的TNF-α水平。
[0142]其结果，如图6所示，用LPS处理的组中TNF-α的水平有所增加，表明诱发了炎症。然而，在用LPS和本发明的五瓣子楝树提取物剂量依赖性处理的组中，TNF-α的生成减少了(图6)。即，本发明的五瓣子楝树提取物减少了炎症因子的生成，证明其可以被有效地用于炎症性疾病。
[0143]下文描述本发明的组合物的制造实施例。
[0144]制造实施例1:药物制剂的制备
[0145]〈1-1>粉剂的制备
[0146]五瓣子楝树提取物2g
[0147]乳糖Ig
[0148]按照常规制备粉剂的方法，通过混合以上所有组分，将其装入气密包装中制备粉剂。
[0149]<1-2>片剂的制备
[0150]
IL鮮/-楝树提取物 IOOmg
'K米淀粉l_mg
乳糖請Omg
硬脂酸镁2mg
[0151]采用常规制备片剂的方法通过混合以上所有组分制备片剂。
[0152]〈1-3>胶囊剂的制备
[0153]
【权利要求】
1.一种预防和治疗炎症性疾病的药物组合物，含有五瓣子楝树提取物作为活性成分。
2.根据权利要求1所述的用于预防和治疗炎症性疾病的药物组合物，其中特征在于，所述提取物是用水、醇、或其混合物作为溶剂提取的。
3.根据权利要求2所述的用于预防和治疗炎症性疾病的药物组合物，其中所述醇是C1~C2的低级醇。
4.根据权利要求3所述的用于预防和治疗炎症性疾病的药物组合物，其中所述低级醇是乙醇或甲醇。
5.根据权利要求1所述的用于预防和治疗炎症性疾病的药物组合物，其中所述炎症性疾病选自皮炎、过敏症、特应症、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠炎、痔疮、痛风、强直性脊柱炎、风湿热、红斑狼疮、纤维肌痛症、银屑病性关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎、肌腱炎、腱鞘炎、腱周围炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、干燥综合征、多发性硬化症、以及急性和慢性炎症性疾病。
6.一种预防和治疗哮喘的药物组合物，含有五瓣子楝树提取物作为活性成分。
7.一种用于预防和改善炎症性疾病的保健功能食品，含有五瓣子楝树提取物作为活性成分。
8.根据权利要求7所述的用于预防和改善炎症性疾病的保健功能食品，其中特征在于，所述提取物是用水、醇、或其混合物作为溶剂提取的。
9.根据权利要求7所述的用于预防和改善炎症性疾病的保健功能食品，其中所述炎症性疾病选自皮炎、过敏症、特应症、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠炎、痔疮、痛风、强直性脊柱炎、风湿热、红斑狼疮、纤维肌痛症、银屑病性关节炎、骨关节炎、类风`湿性关节炎、肩周炎、肌腱炎、腱鞘炎、腱周围炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、干燥综合征、多发性硬化症、以及急性和慢性炎症性疾病。
10.一种用于预防和改善哮喘的保健功能食品，含有五瓣子楝树提取物作为活性成分。
11.一种治疗炎症性疾病的方法，包括向具有炎症性疾病的主体施用药学有效剂量的五瓣子楝树提取物的步骤。
12.一种预防炎症性疾病的方法，包括向主体施用药学有效剂量的五瓣子楝树提取物的步骤。
13.一种治疗哮喘的方法，包括向具有哮喘的主体施用药学有效剂量的五瓣子楝树提取物的步骤。
14.一种预防哮喘的方法，包括向主体施用药学有效剂量的五瓣子楝树提取物的步骤。
15.一种五瓣子楝树提取物，用作预防和治疗炎症性疾病的组合物。
16.一种五瓣子楝树提取物，用作预防和治疗哮喘的组合物。
17.—种五瓣子楝树提取物，用作预防和改善炎症性疾病的保健功能食品的组合物。
18.—种五瓣子楝树提取物，用作预防和改善哮喘的保健功能食品的组合物。
【文档编号】A61P29/00GK103501797SQ201280018275
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年2月7日 优先权日:2011年2月16日
【发明者】吴世湸, 安境燮, 权玉京, 李炯圭, 李重求, 郑革, 李美永, 孙和永, 李京烈, 李尙雨, 金航, 李晩宜 申请人:韩国生命工学研究院