皇冠提取物、提取方法和它作为胆固醇酯转移酶蛋白质（cetp）抑制剂的用途

皇冠提取物、提取方法和它作为胆固醇酯转移酶蛋白质（cetp）抑制剂的用途
【专利摘要】本发明公开了用于本发明的目的的被称为DLBS1449的皇冠提取物和/或包括所述皇冠提取物的草药馏分和药物制剂。根据本发明教导的草药提取物有效用于抑制胆固醇酯转移酶蛋白质（CETP）的表达和活性，增加HDL胆固醇水平，降低LDL胆固醇水平，而不升高血压，因此所述提取物被进一步用于动脉粥样硬化的治疗中。
【专利说明】皇冠提取物、提取方法和它作为胆固醇酯转移酶蛋白质(CETP)抑制剂的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于本发明的目的的被称为DLBS1449的皇冠的提取物，包含提取方法及该提取物的生物活性，所述提取物显示出针对胆固醇酯转移酶蛋白质(CETP)表达和活性的抑制活性。
【背景技术】
[0002]胆固醇酯转移酶蛋白质(CETP)为74-kDa的糖蛋白，并具有疏水特性、该蛋白主要在肝脏中合成，并分泌到血浆中。此外，CETP还在淋巴、脂肪组织、心、肾和小肠中以较低浓度表达2。CETP在胆固醇逆转运(RCT)过程中起作用，其中，该蛋白介导高密度脂蛋白(HDL)颗粒中的胆固醇酯向低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)颗粒中的甘油三酯的转换许多先前的研究显示CETP促进胆固醇酯在LDL颗粒中积聚的过程，这造成了抑制对来自血液循环的胆固醇的去除过程4。在流行病学研究中报道了，具有遗传性CETP缺陷的主体具有更高量的HDL胆固醇和更低量的LDL胆固醇。因此，CETP在用于血脂异常和动脉粥样硬化治疗的药物研究中成为潜在的治疗目标。
[0003]目前，关于CETP的研究旨在研究CETP活性及它对人类血浆中HDL胆固醇和甘油三酯水平的变化的影响5’6。由CETP表达的下降而引起的高含量的HDL胆固醇非常重要，其中报道HDL胆固醇水平与动脉粥样硬化风险因子存在反向联系7。HDL的防动脉粥样硬化的性质在RCT过程发挥作用，所述RCT过程中，在周围细胞中的过量的胆固醇被分配到肝脏中，以被分泌6。已经生产并研究了一些CETP抑制剂，例如胆固醇酯转移酶蛋白质抑制肽和CETP反义寡脱氧核苷 酸(ODN) 8’9。然而，这两种抑制剂仍在研究中。此外，已经有被开发到临床试验阶段的作为CETP抑制剂的药物，即torcetrapib。然而，考虑到在服用该药物的患者中高数目的死亡率，该产品在临床试验中未提供正面结果 ' 进一步研究发现，torcetrapib造成患者血压升高,这导致死亡。
[0004]在本发明中教导了一种草本植物皇冠的提取方法和用途。本地已知为神冠果(Mahkota Dewa)的皇冠为印度尼西亚原生植物，通常作为观赏植物存在于庭院中，或作为耐阴植物存在于花园中。令人惊奇地，通过利用它的茎、果肉或叶子，这种植物能够被用作CETP抑制剂。在本发明前，没有任何研究说明如本发明中所要求保护的皇冠提取物作为CETP抑制剂的使用或益处。

【发明内容】

[0005]将在优选的实施方式中说明本发明所提供的目标和/或方案。说明的实施方式用于理解本发明的目的，并不限制能够从本发明的实践中所了解到的变化和/或组合和/或修改的其它实施方式的可能性。将从此处权利要求中详细描述的元素和组合中实现本发明所教导的目标和/或方案。
[0006]如在实施方式中所解释并在本申请中被广泛描述的那样，为实现所述方案并与本发明的目的一致，本发明的第一个方面涉及通过在有机溶剂中提取而制备的皇冠提取物，所述皇冠提取物有效作用为胆固醇酯转移酶蛋白质(CETP )抑制剂。
[0007] 本发明的第二个方面涉及有效增加HDL胆固醇水平并降低LDL胆固醇水平的有效量或剂量的皇冠提取物和/或它的馏分或它的化合物组，所述提取物和/或馏分或化合物组作为单独活性成分或以组合使用。
[0008]本发明的第三个方面涉及药物组合物，包括(I)作为单独活性成分或以组合使用的有效量或有效剂量的皇冠的提取物或它的馏分，(2)药学可接受且生理学适合的载剂、赋形剂或添加剂，所述载剂、赋形剂或添加剂作用为CETP抑制剂，但不限于此。
【专利附图】

【附图说明】
[0009]这里将描述本发明中的【专利附图】

【附图说明】。
[0010]图1为显示0~100 i! g/ml浓度的DLBS1449对CETP基因表达水平的影响的图。
[0011]图2为显示DLBS1449在蛋白水平上对CETP的活性的影响的图。
[0012]图3为显示了 DLBS1449在蛋白水平上对CETP和ApoA-1的影响的作为免疫印迹结果的蛋白带。
[0013]图4为显示DLBS1449处理对CETP转录调节过程中涉及的LXR- a和SREBP-1基因表达的影响的图。
[0014]图5为显示DLBS1449处理对胆固醇逆转运(RCT)过程中涉及的LDL-R、SR-Bl和ApoB基因表达的影响的图。
[0015]图6为显示DLBS1449对CYP11B2基因表达影响的图。
[0016]图7为显示DLBS1449对CYP11B1基因表达影响的图。
[0017]图8为显示不饱和脂肪酸花生四烯酸和亚油酸以及它们与DLBS1449的组合对CETP基因表达的影响的图。
【具体实施方式】
[0018]将通过提供实施例详细地说明本发明，本发明的范围并未被限制为所提供的实施例。
[0019]从皇冠中获得根据本发明的教导的提取物和/或馏分。因此，将说明提取过程和DLBS1449作为CETP抑制剂的影响。
[0020]A.阜.冠的提取过程
[0021]本发明教导了皇冠的提取过程，其中可获得具有作为CETP抑制剂活性的提取物。本发明教导的皇冠的提取过程使用具有有机溶剂的浸化和/或渗透系统。在10-60°C、优选25-500C的温度，用8至12倍于原料重量的有机溶剂提取皇冠的干切片，优选它的果肉，和/或将所述干切片在萃取器中渗透。用于该过程中的有机溶剂包括但不限于纯态(96%)或具有各种含量的水作为稀释剂的醇类，包括但不限于甲醇和乙醇，有机溶剂的浓度优选为70%至96%。提取过程持续2到6个小时，伴随在60rpm搅拌，或者可调整搅拌速度。通过过滤从浆状物分离液体提取物。为了获得干的提取物，在40至80°C的温度和70至550mbar范围的压力下通过旋转蒸发仪液体蒸发液体提取物，或者可调整所述温度和压力。此外，使用真空炉干燥所述浓缩物2至4个小时，以获得干燥的提取物。用于本发明的目的的干燥的提取物被称为DLBS1449。
[0022]已经进一步表征通过本发明中教导的方法获得的DLBS1449，并且结果显示获得的DLBS1449至少包含，例如脂肪酸、皂苷和酚的化合物组，及其它能够起到特定生物效应的次级代谢产物或它们的组合。此外，还使用薄层色谱(TLC)法定量地鉴定DLBS1449。该TLC法使用硅胶板作为固定相，以及氯仿:甲醇(10: I)作为移动相。TLC结果显示包含具有Rf0.16~0.35的化合物组的DLBS1449起到特定的生物活性，这在说明书中将进一步说明。
[0023]B.DLBS1449对CETP表汰和活件的影响
[0024]用于本发明的细胞培养物为人类肝癌细胞H印G2，其中CETP主要在肝脏细胞中合成。在添加10%的血清、100 u g/ml的青霉素-链霉素抗生素和ImM丙酮酸钠的极限必需a培养基中培养。然后，将这些细胞在37°C、5%C02中培养24个小时。 [0025]方法
[0026]对CETP某闵表汰的体外影响
[0027]在六孔板中培养H印G2细胞，直到达到70%的细胞密度。然后进行培养基的改变，使用不含血清的培养基，然后培养24个小时。然后，用0(对照)、25、50、75和100 y g/ml浓度的DLBS1449处理这些细胞24个小时。
[0028]RNA分离和实时PCR
[0029]使用Trizol溶液，根据该溶液所带步骤，分离用DLBS1449处理的IfepG2细胞的总RNA。然后用NanoDrop仪器测量总RNA，并用电泳法显示。此外，使用PCR温度循环仪器在已优化的特定条件下通过RT-PCR过程使用具有良好的质量的RNA合成cDNA。
[0030]测量CETP活件
[0031]使用CETP抑制剂药筛选试剂盒(美国BioVision)，根据获自所述试剂盒的手册进行测量。使用的DLBS1449的浓度为0、25、50、75和100 y g/ml，重复三次，并且将未加入CETP的DLBS1449的相同的样品用作对照。
[0032]结果和讨论
[0033]使用PCR的研究显示DLBS1449能够在mRNA水平降低CETP基因表达。当提高DLBS1449的给药水平时，CETP基因表达的降低更大(图1)。如图2显示，除了在mRNA水平降低CETP基因表达，DLBS1449还具有在蛋白水平作为CETP活性抑制剂的能力。该抑制活性为与剂量有关的方式。以前的研究主张CETP抑制是提高HDL胆固醇水平的策略之一 5’6。CETP的缺乏使得从HDL到VLDL及LDL胆固醇的胆固醇酯转移过程被抑制，因而减少了 VLDL和LDL颗粒的形成，并且提高了 HDL水平。其中HDL胆固醇的量提高的这种条件造成了与抑制在动脉壁上的斑或粉瘤的形成有关的抗动脉粥样硬化6。因此，通过如本发明所教导的抑制CETP表达和活性，认为DLBS1449能够提高血液中的HDL胆固醇水平，并且由于LDL胆固醇水平的降低，可防止动脉粥样硬化的可能性。进一步在体内分析了胆固醇水平的提高。
[0034]C.DLBS1449对CETP活件、HDL和LDL昍固醇及甘油三酯的体内影响
[0035]为了确保DLBS1449给药对CETP活性、HDL、LDL和甘油三酯水平的影响，对雄性新西兰白兔进行体内研究。
[0036]方法
[0037]将试验动物分成两组，对照组和用DLBS1449处理的处理组。对照组中的兔子未用DLBS1449处理，其它在处理组中的兔子以35mg/l，5kg体重的剂量口服给药DLBS1449。对兔子给药DLBS1449四周。在给药该提取物前后进行CETP活性、HDL和LDL胆固醇和甘油三酯水平的测量。使用的样品为取自每个兔子耳朵的血浆。对于每种影响参数使用特定的试剂盒进行测量。
[0038]结果和讨论
[0039]如表2显示，研究结果显示对兔子DLBS1449给药4周造成CETP活性降低0.3%，而在对照组中，CETP活性提高5.13%。还发现LDL胆固醇的降低，其中处理组中降低了 6.8%，高于对照组中3.2%的降低。从表2还可知，对照兔子中HDL胆固醇水平降低了 13.3%;另一方面，在处理的兔子中，HDL胆固醇水平提高了 15.9%。此外，发现每个试验动物组中甘油三酯水平提高，然而，处理组中的提高低于对照组，它们分别为3.5%和16.5%。
[0040]结果显示DLBS1449能够有效控制兔子血液中的胆固醇水平，其中，HDL水平提高，CETP活性及LDL和甘油三酯的水平降低。该体内研究结果与体内研究结果一致，显示DLBS1449能够被用作CETP抑制剂。
[0041]表1试验的兔子的各影响参数的特征和初始水平
【权利要求】
1.一种通过下述方法获得的皇冠提取物和/或所述提取物的馏分或源自所述皇冠提取物的化合物组，所述方法包括: Ca)使用有机溶剂以及在10至60°C的温度下搅拌来提取皇冠， (b)蒸发在步骤(a)中使用的所述有机溶剂。
2.根据权利要求1所述的提取物，其中提取过程使用有机溶剂，所述有机溶剂包括但不限于具有70%至96%的浓度的乙醇。
3.根据权利要求1所述的提取物，至少包括脂肪酸，以及皂苷和酚及其它次级代谢产物的化合物的组，或其用于特定生物效应的组合。
4.根据权利要求1所述的提取物，单独或以组合作为活性成分，所述提取物以有效量或剂量以抑制CETP基因表达和活性。
5.根据权利要求1所述的提取物，单独或以组合作为活性成分，所述提取物以有效量或剂量提高HDL胆固醇水平。
6.根据权利要求5所述的提取物，其中所述皇冠提取物提高ApoA-1蛋白水平并抑制SR-Bl基因表达。
7.根据权利要求1所述的提取物，单独或以组合作为活性成分，所述提取物以有效量或剂量降低LDL胆固醇水平。
8.根据权利要求7所 述的提取物，其中所述皇冠提取物提高LDL-R基因表达并抑制ApoB基因表达。
9.根据权利要求1所述的提取物，其中所述皇冠提取物不造成血压升高。
10.根据权利要求9所述的提取物，其中所述提取物抑制CYPl1B2和CYPl IBl的基因表达。
11.根据权利要求1所述的提取物作为与抑制动脉粥样硬化的形成相关的抗动脉粥样硬化剂在用于制备药物组合物、补充剂、食物或饮料中的用途，所述提取物以有效量存在，以单独形式或组合作为活性成分，其中包括药学可接受且生理学适合的载剂、赋形剂或添加剂。
12.—种药物组合物，所述药物组合物包括以单独形式或组合用作活性成分的根据权利要求I所述的提取物，并包括药学可接受且生理学适合的载剂、赋形剂或添加剂，其中所述药物组合物在无菌或未灭菌的产品中以固体、半固体或液体形式制造。
13.一种用于促进健康益处的食物或饮料产品，包括单独或以组合作为活性成分的根据权利要求1所述的提取物和/或馏分。
【文档编号】A61K36/53GK103619345SQ201280019093
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2012年4月19日 优先权日:2011年4月19日
【发明者】达维·安格贡·塞普蒂纳·苏吉普坦, 阿塞佩·阿勒平, 雷蒙德·R·钱德拉维纳塔 申请人:地塞医药有限公司