专利名称：叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物及其制备方法和应用。
背景技术：
抗肿瘤化学药物因水溶性差、体内非特异性分布、毒副作用较大等，无法充分发挥其治疗功效。紫杉醇作为一线化疗药物，可促进微管装配并阻止微管蛋白解聚，从而有效抑制癌细胞的快速分裂和增殖。但紫杉醇难溶于水，临床使用的紫杉醇注射液是以聚氧乙烯蓖麻油/乙醇(1:1，v/v)作为溶媒，静脉注射后可引起过敏反应、心血管毒性等毒副作用。采用药物递送系统可克服上述缺陷，其中水溶性聚合物载体与紫杉醇化学连接形成的聚合物药物可改善紫杉醇溶解度，控制药物释放，提高肿瘤靶向性，减轻毒副作用。紫杉醇可直接与聚合物载体连接，但可能因空间位阻等因素药物释放速率过慢(Shahin M et al.，IntJ Pharm 2010，389:213-222)，可将紫杉醇先与二元羧酸或氨基酸等小分子连接后间接连接至聚合物载体，间接连接可提高药物的反应活性，增加药物水解位点。目前研究的基于紫杉醇的聚合物药物多经静脉注射给药，静脉注射后药物可直接进入血液循环；在癌症的长期治疗过程中，口服相对于静脉注射更加方便，可提高病人顺应性。紫杉醇的小肠渗透性差，易受到肠上皮细胞表面P-糖蛋白介导的药物外排及细胞色素P450依赖的药物代谢，口服生物利用度非常低。借助递送载体可提高药物的口服吸收，其中壳聚糖以优良的理化性质及易于进行结构与功能修饰而广泛用于口服递送载体的制备，但壳聚糖在生理环境下水溶性差，应用受到限制。壳聚糖可经水解或酶解为低分子量壳聚糖(Mw〈10 kDa)，水溶性增强，将紫杉醇经琥珀酰酯键与低分子量壳聚糖共价连接形成低分子量壳聚糖-紫杉醇聚合物药物，可改善紫杉醇溶解性，提高紫杉醇口服生物利用度(LeeE et al., J Med Chem 2008，51:6442_6449)，口服低分子量壳聚糖-紫杉醇的体内抑瘤率和静脉注射紫杉醇溶液相当。但一般认为分子量大于50 kDa的分子或与其相当的粒子(例如纳米粒)有明显的增强渗透滞留(EPR)效应，可被动靶向肿瘤组织。低分子量壳聚糖-紫杉醇聚合物药物的分子量较小且不能自组装形成纳米粒，无法利用EPR效应提高抗肿瘤功效。利用配体与细胞膜上受体特异性识别作用，对药物递送载体进行靶向配体修饰可增加细胞对药物递送载体的摄取，增强主动靶向功效。小肠上皮细胞表面叶酸受体高表达，叶酸修饰的纳米粒可显著提高药物的小肠转运能力(Roger E et al., Mol Pharmaceutics2012,9:2103-2110);叶酸受体在多种肿瘤细胞( 如卵巢癌、肝癌、乳腺癌等)表面高表达且活性显著高于正常细胞，叶酸修饰的纳米粒可在肿瘤组织中高度蓄积，具有良好的肿瘤细胞革巴向性(Wang J et al., Biomacromolecules 2011,12:228-234)
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种具有自组装性能、可用于多种给药途径的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物及其制备方法和应用。本发明的基本方案如下:
琥珀酸酐经吡啶催化开环，与紫杉醇连接合成琥珀酰紫杉醇；壳聚糖与碘甲烷反应合成壳聚糖季铵盐；壳聚糖季铵盐与琥珀酰紫杉醇经催化缩合，并将靶向配体叶酸连接至壳聚糖季铵盐，制得叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物。该聚合物药物因含有亲水性聚合物链和疏水性药物，在水中可自组装形成纳米粒。本发明依据壳聚糖季铵盐的亲水性、黏膜黏附和细胞黏附等作用，将紫杉醇通过琥珀酰酯键共价连接至壳聚糖季铵盐，提高药物水溶性，控制药物释放，增强药物肿瘤靶向性；依据叶酸对于多种肿瘤细胞的主动靶向性，将叶酸共价连接至壳聚糖季铵盐，实现聚合物药物的肿瘤组织主动靶向，减小药物对正常组织的毒副作用。本发明制备的叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物可通过口服和静脉注射等多种给药途径提高药物的抗肿瘤功效。具体说来，本发明提供的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物，是抗肿瘤药物紫杉醇经琥珀酰酯键共价连接至壳聚糖季铵盐，再将靶向配体叶酸连接至壳聚糖季铵盐形成的聚合物药物，该聚合物药物在水中可自组装形成纳米粒。其中壳聚糖分子量范围为10-500 kDa，紫杉醇载药量为3_25%。所述的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物，自组装形成的纳米粒平均粒径为 100-500 nm。本发明的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备方法如下:
(1)琥珀酸酐混悬于二氯甲烷，加入紫杉醇，搅拌，加入无水吡啶，搅拌反应24-72h ;减压蒸馏，加水洗涤，离心收集沉淀，真空干燥，得琥珀酰紫杉醇；
(2)按照文献报道方法(EurJ Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成壳聚糖季铵盐；
(3)琥珀酰紫杉醇溶于二甲基亚砜，加入催化剂，搅拌；将壳聚糖季铵盐溶于水，加至含有琥珀酰紫杉醇的二甲基亚砜中，反应6-24 h；
(4)将叶酸溶于二甲基亚砜，加入催化剂，搅拌，加至步骤(3)得到的反应体系中，避光反应6-24 h ;纯化，冷冻干燥，得叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物。步骤(I)中，琥珀酸酐与紫杉醇的质量比为1:1-1:10，吡啶用量为反应体系的0.25-2.0% (v/v)。步骤(2)中，合成壳聚糖季铵盐反应时间为45-150 min ;所得壳聚糖季铵盐以Cl—型阴离子交换树脂纯化、冷冻干燥；其中反应45、120和150 min所得的壳聚糖季铵盐的季铵化度分别为15%、30%和45%。步骤(3)中，反应所用催化剂为1- ( 3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，且琥珀酰紫杉醇与1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比均为1:1-1:10，琥珀酰紫杉醇与壳聚糖季铵盐的质量比为0.05:1-0.4:1，壳聚糖季铵盐水溶液浓度为10-30 mg/ml。步骤(4)中，叶酸与壳聚糖季铵盐的质量比为0.05:1-0.3:1，反应所用催化剂为1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，且叶酸与1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比均为1:1-1:10。本发明的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物，可通过口服和静脉二种给药途径用于肝癌等多种癌症的治疗。本发明的优点在于:
(I)依据壳聚糖季铵盐良好的水溶性、黏附性及促进渗透等优点，将紫杉醇经生理条件下可裂解的连接键共价连接至壳聚糖季铵盐，并将靶向配体叶酸连接至壳聚糖季铵盐，制备一种新型叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物。本发明的叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物可增强药物小肠渗透性，不仅可通过EPR效应富集于肿瘤组织，也可通过靶向配体叶酸与肿瘤细胞表面特异性受体的识别、结合，增加肿瘤组织中药物分布，提高药物的抗肿瘤功效，降低对其它脏器的毒性。(2)本发明的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物水中自组装形成纳米粒，粒径分布均匀，分散性较好，且在不同pH环境下粒径稳定。(3)本发明的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物可在体内缓慢释药，可防止药物到达靶点前对正常组织的毒性；酸性条件下聚合物药物较稳定，药物释放速率随释放介质PH的增大而增大，可防止药物在胃部损失，有利于聚合物药物的肠道吸收。(4)本发明的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的小肠黏膜黏附率高于壳聚糖季铵盐，可通过打开小肠上皮紧密连接和上皮细胞摄取显著提高紫杉醇的小肠转运效率。(5)本发明的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物可通过口服和静脉注射二种给药途径用于肝癌等多种癌症的治疗；H22肝癌模型小鼠抑瘤效果研究中，口服和静脉注射叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物`组的抑瘤率均显著高于静脉注射紫杉醇溶液组。(6)连接紫杉醇和叶酸可降低壳聚糖季铵盐的正电荷，增强血液相容性。(7)本发明各种原料廉价易得，引入靶向基团的方法简捷方便，连接键牢固，合成工艺简单，条件可控，重复性好。本文所用术语:
如本文所用，术语“PTX”指紫杉醇。如本文所用，术语“ TMC”指N，N, N-三甲基壳聚糖季铵盐。如本文所用，术语“EDC”指1- (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐。如本文所用，术语“NHS”指N-羟基琥珀酰亚胺。如本文所用，术语“FA”指叶酸。如本文所用，术语“ TMC-PTX”指壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物。如本文所用，术语“FA-TMC-PTX”指叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物。
图1为叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的扫描电镜图(实施例13)。图中标尺2 u rtio图2为叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物(实施例12、13、14)在不同PH环境下的粒径。图3为叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物(实施例13)在pH 7.4 PBS中10天内的释放情况(A);在不同pH释放介质中的释放情况(B)，其中，从下往上的曲线对应的 Ph 值依次为:1.2,4.5,5.0,5.3,5.7,6.0,6.5,7.0,7.4。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，浓度为质量体积百分数(w/V)。实施例1琥珀酰紫杉醇的制备
称取3 mg琥珀酸酐，加4 mL二氯甲烷，搅拌；加30 mg PTX，搅拌；加10 μ L无水吡啶，反应体系变澄清，搅拌24 h ；50 ° C减压蒸馏，加10 mL水，搅拌15 min，离心收集沉淀；力口30 mL水洗涤沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。实施例2琥珀酰紫杉醇的制备
称取6 mg琥珀酸酐，加4 mL二氯甲烷，搅拌；加30 mg PTX，搅拌；加20 μ L无水吡啶，反应体系变澄清，搅拌40 h ；50 ° C减压蒸馏，加10 mL水，搅拌15 min，离心收集沉淀；力口30 mL水洗涤沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。实施例3琥珀酰紫杉醇的制备
称取10 mg琥珀酸酐，加4 mL 二氯甲烧，搅拌；加30 mg PTX，搅拌；加30 μ L无水批啶，反应体系变澄清，搅拌55 h ；50 ° C减压蒸馏，加10 mL水，搅拌15 min，离心收集沉淀；加30 mL水洗涤沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。实施例4琥珀酰紫杉醇的制备
称取20 mg琥珀酸酐，加4 mL 二氯甲烧，搅拌；加30 mg PTX，搅拌；加50 μ L无水批啶，反应体系变澄清，搅拌65 h ；50 ° C减压蒸馏，加10 mL水，搅拌15 min，离心收集沉淀；加30 mL水洗涤沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。实施例5琥珀酰紫杉醇的制备
称取30 mg琥珀酸酐，加4 mL 二氯甲烧，搅拌；加30 mg PTX，搅拌；加80 μ L无水批啶，反应体系变澄清，搅拌72 h ；50 ° C减压蒸馏，加10 mL水，搅拌15 min，离心收集沉淀；加30 mL水洗涤沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。实施例6叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为10 kDa，反应时间为45 min，所得TMC的季铵化度为15% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于40 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:1:1，搅拌；力口入TMC溶液，反应6 h制备TMC-PTX ;称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h ;以水透析3天(MWC0 3,500 Da)，冷冻干燥。实施例7叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为30 kDa,反应时间为120 min,所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于40 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:3:3，搅拌；力口入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h ;以水透析3天(MWCO 3,500 Da)，冷冻干燥。实施例8叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa,反应时间为150 min，所得TMC的季铵化度为45% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于40 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应24 h制备TMC-PTX ;称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光搅拌反应12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷冻干燥。实施例9叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa,反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于40 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:7:7，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷冻干燥。实施例10叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为500 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于40 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:10:10，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷冻干燥。实施例11叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa,反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取10 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于40 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷冻干燥。实施例12叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa,反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取20 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于40 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h ;以水透析3天(MWCO 3, 500 Da)，冷冻干燥。实施例13叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa,反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于40 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷冻干燥。实施例14叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa,反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取60 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于40 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷冻干燥。实施例15叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa,反应时间为1 20 min，所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取80 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于40 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷冻干燥。实施例16叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为10 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于10 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；力口入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h;以水透析3天(MWCO 3,500 Da)，冷冻干燥。实施例17叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为30 kDa,反应时间为120 min,所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于10 mL水；称取40 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于10 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；力口入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h ;以水透析3天(MWCO 3,500 Da)，冷冻干燥。实施例18叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa,反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于6.7 mL水；称取40 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于13.3 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC, FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷冻干燥。实施例19叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫 杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa,反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于60 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷冻干燥。实施例20叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为500 kDa,反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于80 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷冻干燥。实施例21叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa,反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于40 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取12 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1: 1: 1，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应6 h;以水透析3 天(MWCO 3,500 Da)，冷冻干燥。实施例22叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa,反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于40 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:2: 2，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h ;以水透析3天(MWCO 3, 500 Da)，冷冻干燥。实施例23叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照 文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa,反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于40 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取40 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应24 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷冻干燥。实施例24叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa,反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于40 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取50 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:6: 6，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷冻干燥。实施例25叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa,反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30% ;C1_型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg琥珀酰紫杉醇(实施例3)溶于40 mL 二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX ;称取60 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:10:10，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷冻干燥。实施例26扫描电镜表征叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的形态
将实施例13的FA-TMC-PTX用适量水分散后滴加至云母片上，室温自然干燥，黏于铜台，喷金，扫描电镜(SEM)观察其形貌，见附图1。由图可见FA-TMC-PTX可自组装形成纳米粒，纳米粒近似球形，表面光滑，粒径为100-200 nm，粒径分布均匀且分散性较好。实施例27叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的粒径、电势
将实施例12、13和14的FA-TMC-PTX用适量水分散，Zetasizer Nano电势及粒度测定仪测定粒径和Zeta电势。粒径测定参数=He-Ne激光(波长635 nm)，折光率和粘度分别为n=1.333和η =0.933 cp，测定温度25。C。电势测定参数:He_Ne激光(波长635 nm)，散射角θ=14°，测定温度25 ° C。每份样品平行测定3次。测定结果见表I。如表I所示，水中FA-TMC-PTX形成的纳米粒粒径随琥珀酰紫杉醇投料量的增大而先减小后增大，纳米粒电势均大于30 mV,表明纳米粒较稳定。实施例28不同pH环境下叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的粒径 将实施例 12、13 和 14 的 FA-TMC-PTX 分别分散于 pH 1.2 HCl.pH 5.0 PBS,pH 6.8 PBS
和pH 7.4 PBS中，粒度测定仪测定粒径。粒径测定参数=He-Ne激光(波长635 nm)，折光率和粘度分别为n=l.333和η =0.933 cp，测定温度25 ° C。每份样品平行测定3次。测定结果见附图2。由附图2可见pH 1.2-7.4环境下FA-TMC-PTX形成的纳米粒粒径无显著变化；FA-TMC-PTX 口服后经过胃肠道进入血液并最终到达肿瘤组织，经历了不同的pH环境，而在不同PH环境下FA-TMC-PTX可保持稳定的纳米形态。实施例29叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的载药量
精密配制I mg/mL FA-TMC-PTX (实施例12、13、14)，精密量取200 μ L，加水稀释至2mL，测定227 nm处吸光值，计算聚合物药物的载药量(％)。如表I所示，FA-TMC-PTX的载药量随琥珀酰紫杉醇投料量的增大而增大。表I叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的粒径、电势和载药量(n=3)
权利要求
1.种叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物，其特征在于由下述过程制备获得:壳聚糖经季铵化修饰制得亲水性壳聚糖季铵盐，琥珀酸酐开环与紫杉醇化学连接制得疏水性琥珀酰紫杉醇，壳聚糖季铵盐和琥珀酰紫杉醇共价连接，壳聚糖季铵盐共价连接叶酸；其中琥珀酰紫杉醇与壳聚糖季铵盐的质量比为0.05:1-0.4:1，叶酸与壳聚糖季铵盐的质量比为0.05:1-0.3:1。
2.据权利要求1所述的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物，其特征在于壳聚糖分子量范围为10-500 kDa。
3.据权利要求1所述的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物，其特征在于紫杉醇载药量为3-25%。
4.据权利要求1-3之一所述的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物，其特征在于由该药物自组装形成的纳米粒，粒径为100-500 nm。
5.种如权利要求1-4之一所述的叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备方法，其特征在于具体步骤如下: (1)琥珀酸酐混悬于二氯甲烷，加入紫杉醇，搅拌，加入无水吡啶，搅拌反应24-72小时；减压蒸馏，加水洗涤，离心收集沉淀，真空干燥，得琥珀酰紫杉醇； (2)合成壳聚糖季铵盐； (3)琥珀酰紫杉醇溶于二甲基亚砜，加入催化剂，搅拌；壳聚糖季铵盐溶于水，加至含有琥珀酰紫杉醇的二甲基亚砜中，反应6-24小时； (4)叶酸溶于二甲基亚砜，加入催化剂，搅拌，加至(3)的反应体系中，避光反应6-24小时；纯化，冷冻干燥，得叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物。
6.据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(I)中琥珀酸酐与紫杉醇的质量比为1:1-1:10，吡啶用量为反应体系的0.25-2.0%，v/v。
7.据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中反应时间为45-150min ；所得壳聚糖季铵盐以Cl—型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；其中反应45、120和150 min所得的壳聚糖季铵盐的季铵化度分别为15%、30%和45%。
8.据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中琥珀酰紫杉醇与壳聚糖季铵盐的质量比为0.05:1-0.4:1，壳聚糖季铵盐水溶液浓度为10-30 mg/mL，反应所用催化剂为1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，且琥珀酰紫杉醇与1- (3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比均为1:1-1:10。
9.据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中叶酸与壳聚糖季铵盐的质量比为0.05:1-0.3:1，反应所用催化剂为1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，且叶酸与1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比均为1:1-1:10。
10.利要求1-4之一所述的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物在制备癌症治疗药物中应用。
全文摘要
本发明属于医药物技术领域，具体为一种叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物及其制备方法和应用。本发明的聚合物药物由紫杉醇经琥珀酰酯键共价连接至壳聚糖季铵盐并连接肿瘤靶向配体叶酸而成。其制备方法为琥珀酸酐开环与紫杉醇化学连接合成琥珀酰紫杉醇，壳聚糖经季铵化修饰制得壳聚糖季铵盐，在催化剂作用下，琥珀酰紫杉醇共价连接至壳聚糖季铵盐，并引入靶向配体叶酸；该聚合物药物在水中可自组装形成纳米粒，其中以疏水性药物为内核，以壳聚糖季铵盐为亲水外壳。该聚合物药物制备方法简单、重复性和安全性良好，可通过口服和静脉注射二种给药途径增强紫杉醇的靶向性和抑瘤功效。
文档编号A61K31/337GK103083682SQ201310029010
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者印春华, 贺睿 申请人:复旦大学