专利名称：尖吻蝮蛇血凝酶-c的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种丝氨酸蛋白酶，具体地说是一种蛇毒血凝酶-C，本发明还涉及其分离纯化方法。
背景技术：
据国内外文献的报导，在蝮亚科(Crotal inae )蛇毒中多存在一类与血液凝固相关的蛋白酶，通常称之为“类凝血酶”(thrombin-like enzyme,简称:TLC)。类凝血酶与凝血酶(thrombin)的作用相似，可以使血浆中纤维蛋白原转化为纤维蛋白而“凝固”。迄今已经发现现已在30多种蛇毒中含有类凝血酶成分，并有20余种得到分离纯化，其中有10余种类凝血酶的全部或部分氨基酸序列得到阐明。已发现的TLC分子量多在29 45kD之间，大多数为酸性糖蛋白。在以往已经发现的蛇毒TLC中，蛋白质一级结构多为单链。其代表产品“立芷雪”(Reptilase)是由巴西矛头蝮蛇(Bothrops atrox)蛇毒中分离出的凝血酶,该酶前体由255个氨基酸构成，N端有24个氨基酸形成的引导肽，活性酶含231氨基酸，相对分子量39 43kD，为单链糖蛋白。翟宁等(上海医药工业研究院&浙江海正药业)2005年报道:从皖南五步蛇(Agkistrodon acutus)中分离到一种“类凝血酶”,具有凝血作用。SDS — PAGE显示为单链，还原和非还原电泳分子量分别为59.25kD和52.58kD，显示存在链内二硫键，比活为41.5/u/mg，苯甲基磺酰氟(PMSF)可导致该酶不可逆失活。近十多年来的研究发现在蝮亚科蛇毒TLC中也存在双链分子结构，链间由二硫键连接。Xin Cheng等(中国科技大学)1999年报导:从五步蛇(Agkistrodon acutus)中分离到一种“类凝血酶”，命名为“Agkisacutacin”。该蛋白由两条肽链构成，α -亚基分子量15kD, β-亚基分子量 14kD。Agkisacutacin能够水解纤维蛋白原中的α链。肖昌华(中科院昆明动物研究所)2004年从五步蛇(Agkistrodon acutus)中分离到两种“类凝血酶”，均为双链分子结构。凝血酶I的A亚基含有132个氨基酸，分子量16kD ；B亚基含有123个氨基酸，分子量14kD，酶比活性为:160U/mg。凝血酶II的A亚基含有122个氨基酸，分子量15kD ；B亚基含有120个氨基酸，分子量13kD，酶比活性为:70U/mg。该两种TLC经药理实验证明:均具有止血功效。唐松山2004年从五步蛇(Agkistrodon acutus)中分离到一种“类凝血酶”，具有凝血作用。该酶由17kD和15kD两个亚基组成，等电点5.9。本发明阐述从我国的广西尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutu)蛇毒中分离得到一种新的蛇毒血凝酶——尖吻蝮蛇血凝酶-C。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛇毒血凝酶，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离得到的一种类凝血酶-C。本发明的另一个目的在于提供一种分离纯化上述血凝酶的方法。本发明血凝酶-C是从中国尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中分离得到的血凝酶。该酶具有如下特征:①酶蛋白含252个氨基酸，分子量为29213.4D，等电点pi为5.7。②由α、β两条链构成，链间由二硫键连接。③α链含129个氨基酸，分子量为14661.7D，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示；β链含123个氨基酸，分子量为14551.7D，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。④酶活性可被苯甲基磺酰氟(PMSF)完全抑制，表明其是一种丝氨酸蛋白酶。本发明还提供上述血凝酶的纯化方法，其包括如下步骤:1)、蛇毒经硫酸铵分级沉淀预处理；2)、将预处理后的蛇毒溶液上经预平衡的DEAE — Sephrose FF阴离子交换层析柱，用 0.0lM ρΗ7.0 7.5 的 PBS 洗柱，再用含 0.02 和 0.06Μ NaCl 的 0.0lM ρΗ7.0 7.5的PBS分段洗脱，收集0.06MNaCl第一个洗脱峰；3)、将上述洗脱液适当浓缩后透析或经多次稀释超滤去除NaCl ；4)、将透析后的溶液再次上经预平衡的DEAE — S印hrose FF层析柱，用0.01MρΗ7.0 7.5 的 PBS 洗柱，再用含 0.05Μ NaCl 的 0.01ΜρΗ7.0 7.5 的 PBS 洗脱，收集 0.05ΜNaCl洗脱的第二个洗脱峰；5)、将上述洗脱液适当浓缩后用蒸馏水透析或采用S印hadeX_G25柱脱盐。其中，步骤I)蛇毒预处理的方法是将蛇毒用适量预冷的0.01MpH7.0 7.5PBS溶解，离心收集上清液，硫酸铵分级沉淀，收集70%硫酸铵沉淀，沉淀经PBS悬浮溶解后进行透析(透析袋截留分子量为7，000D 10，000D)，或采用切向流超滤(膜截留分子量为5，000D 10，000D)方法，将悬浮溶解液反复多次稀释、超滤浓缩脱盐。通过预处理可以去除不溶的杂质以及部分杂蛋白，并降低溶液离子强度。具体地说，可通过如下步骤进行蛇毒的预处理:称取蛇毒若干克，用蛇毒重量5 10倍体积预冷的0.0lM pH7.0 7.5的PBS于4 8°C的层析柜中搅拌溶解30 60分钟，向溶解液中缓慢添加硫酸铵至50%饱和度，静置2 - 4小时，之后于4 8°C、5，000^10, OOOg离心1(Γ30分钟。收集离心上清液，再向离心上清液中缓慢加入硫酸铵至70%饱和度，静置过夜，次日于4 8。。、5，000 10，OOOg离心10 30分钟。取离心沉淀加适量0.0lM ρΗ7.0
7.5的PBS悬浮溶解得溶解液。将溶解液倾入透析袋(截留分子量为7，OOOD^IO, 000D)，在层析柜中4 8。。对0.0lM ρΗ7.0 7.5的PBS透析12 24小时，期间更换溶液2 4次；或将溶解液用分子截留值为5，000 10，000D的超滤膜经反复多次加入PBS进行稀释超滤浓缩脱盐。如上所述，透析步骤(取决于溶液体积)可采用切向流超滤(膜截留分子量为5，000 10000D)方法代替，通过PBS稀释、超滤浓缩，再稀释、再超滤浓缩的方式以去除小分子多肽和脱盐降低溶液离子强度。其中，步骤2)和步骤4)可采用0.0lM ρΗ7.0 7.5的PBS预平衡DEAE — S印hroseFF层析柱，然后上样。其中，步骤3)和步骤5)的目的均是去除溶液中存在的NaCl。小体积洗脱液可直接进行透析，大体积洗脱液可通过PBS稀释、超滤浓缩，再稀释、再超滤浓缩的方式以浓缩蛋白并脱去NaCl。最终被纯化的酶浓缩液可直接采用Sephadex_G25柱脱盐。除盐后的溶液直接冷冻干燥，或加入冻干保护剂冷冻干燥。所述冻干保护剂可以是低分子右旋糖酐、甘露醇、蔗糖、甘油、明胶等。不同冷冻保护剂的各自加入量为0.1% -2% (w/v)。经本发明方法纯化的血凝酶比活力不低于40U/mg蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)—条带，还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(还原SDS-PAGE)两条带；HPLC分析纯度95%以上。以蛇毒原料重量计，本法纯化收得率为0.4% - 0.5%。本发明血凝酶具有凝集活性，可制成各种止血药物，例如经适当稀释到规定酶活单位，再添加冻干保护剂(明胶或人血白蛋白等)，经病毒膜过滤，冷冻干燥制成医用注射冻干粉针，用于外科手术中止血，以及各种临床出血症状。也可制成创伤外用止血贴剂、粉剂或液体喷雾剂。本发明提供一种新的血凝酶，扩大血凝酶种类，提高蛇毒利用率。
图1显示纯化后的血凝酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)为一条带(箭头所示)。图2显示纯化后的血凝酶-C经还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(RD-SDS-PAGE )为两条带(箭头所示)，其中M为蛋白分子量标准，I为纯化后的血凝酶-C。图3显示纯化后的血凝酶-C的HPLC分析结果。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分t匕，除另有规定外，是指溶液IOOml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20°C时容量的比例。本发明中类似“用蛇毒重量10倍体积预冷的”表述，其中的重量和体积的单位分别是g和ml。实施例1蛇毒血凝酶-C的纯化取20g尖吻蝮蛇蛇毒干粉(批号:20061001，购自广西蛇毒研究所)，用蛇毒重量10倍体积预冷的0.0lM pH7.4的磷酸钠盐缓冲液(PBS)于4°C的层析柜中搅拌溶解60分钟，于40C、IOOOOg离心10分钟，收集上清液。离心沉淀再次加入蛇毒重量5倍体积预冷的0.0lMpH7.4的PBS搅拌洗涤，再次离心。合并两次离心上清液。在搅拌条件下向离心上清液中缓慢加入硫酸铵至50%饱和度，待硫酸铵完全溶解后再持续搅拌20分钟，4°C下静置4小时，使蛋白沉淀完全。之后将该溶液于4°C、IOOOOg离心20分钟，收集上清液。在搅拌条件下向该上清液中缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵饱和度升至70%。待硫酸铵彻底溶解完全，继续搅拌20分钟，4°C静置过夜。次日于4°C、10000g下离心20分钟。弃去上清液，收集沉淀蛋白。沉淀蛋白用80ml0.0lM pH7.4的PBS溶解后装入透析袋(分子量截至值为10000D)中，用0.0lM pH7.4的PBS进行缓慢搅拌透析，期间每6小时换液一次，共换液3次。透析完成后取出透析液(105ml)。将DEAE-S印hrose FF 填料装至 Φ3.5cmX30cm 柱中，用 0.0lM 的 PBS(pH7.4)平
衡柱，待用。将透析液上样到柱上，用0.0lM ρΗ7.4的PBS洗柱。用含0.02MNaCl的0.0lM pH7.4的PBS洗脱，再用含0.06M NaCl的0.0lM pH7.4的PBS洗脱，收集洗脱的第一个峰。用含IM NaCl的0.0lM pH7.4的PBS洗柱再生。用0.0lM pH7.4的PBS平衡柱，平衡后待用。经酶活测定(参照附录①或②方法)和电泳分析，目的物出现在0.06M NaCl溶液的洗脱峰中(176ml)。将该洗脱液倾入透析袋中，用0.0lM pH7.4的PBS于4°C透析，期间每6小时更换溶液一次，共换液3次。将透析液上样到柱上，用0.0lM pH7.4的PBS冲洗柱。用含0.05MNaCl的0.0lMpH7.4的PBS洗脱，收集洗脱的第二个峰(145ml)。用含IMNaCl的0.0lM pH7.4的PBS洗柱再生。用0.01MpH7.4的PBS平衡柱，平衡后待用。经酶活测定(参照附录①或②方法)和电泳分析，目的物出现在0.05M NaCl溶液的第二个洗脱峰中。测定溶液蛋白质浓度为0.64mg/ml。该溶液用无离子水进行透析16小时，期间换液3次。透析溶液中总蛋白质含量为93mg，直接冷冻干燥。冻干粉测定酶比活力为48U/mg蛋白，最终收率0.47%。PAGE为一条带(见图1)，还原SDS — PAGE为两条带(见图2)，其分子量分别大致为15kD和14.5kD。HPLC分析纯度97.3% (见图3及表I)。等电聚焦电泳测定该酶等电点Pl为5.7。表IHPLC定量结果
权利要求
1.尖吻蝮蛇血凝酶-C，该酶由α、β两个亚基构成，其中α亚基具有SEQID N0.1所示的氨基酸序列；β亚基具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
2.含有权利要求1所述尖吻蝮蛇血凝酶的药物。
3.如权利要求2所述的药物，其为冻干粉、止血贴剂或液体喷雾剂。
4.权利要求1所述血凝酶-C的纯化方法，其包括如下步骤: 1)、蛇毒经硫酸铵分级沉淀预处理； 2)、将预处理后的蛇毒溶液上经预平衡的DEAE— S^harose Fast Flow阴离子交换层析柱，用 0.0lM ρΗ7.0 7.5 的 PBS 洗柱，再用含 0.02Μ 和 0.06Μ NaCl 的 0.0lM ρΗ7.0 7.5的PBS分段洗脱，收集0.06Μ NaCl溶液的第一个洗脱峰； 3)、将上述洗脱液适当浓缩后透析或经反复稀释超滤浓缩去除NaCl； 4)、将透析后的溶液再次上经预平衡的DEAE— Sepharose Fast Flow层析柱,用0.0lMρΗ7.0 7.5 的 PBS 洗柱，再用含 0.05Μ NaCl 的 0.0lM ρΗ7.0 7.5 的 PBS 洗脱，收集 0.05ΜNaCl溶液的第二个洗脱峰； 5)、将上述收集洗脱液适当浓缩后用无离子水透析或经S印hdeX-G25柱去除NaCl。
5.如权利要求4所述的方法，其中，步骤I)蛇毒预处理的方法是将蛇毒适量预冷的0.0lM pH7.0 7.5的PBS溶解，50%硫酸铵沉淀，取上清再经70%硫酸铵沉淀，取沉淀，用无离子水透析除盐。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，其中步骤I)蛇毒预处理的方法是:称取蛇毒若干克，用蛇毒重量5 10倍体积预冷的0.0lM pH7.0 7.5的PBS于4 8°C的层析柜中搅拌溶解3(Γ60分钟，缓慢添加硫酸铵至50%饱和度，静置2 - 4小时，之后于4 8°C、5，000^10, OOOg离心1(Γ30分钟，取离心上清液，再缓慢添加硫酸铵至70%饱和度，静置过夜，次日于4 8。。、5，000 10，OOOg离心10 30分钟，取离心沉淀加适量0.0lM ρΗ7.0 7.5的PBS悬浮溶解得溶解液，将溶解液倾入截留分子量为7，OOOD^IO, 000D的透析袋，在层析柜中4 8°C对0.0lM pH7.0 7.5的PBS透析12 24小时，期间更换PBS溶液2 4次；或将溶解液用分子截留值为5，00(T10，000D的超滤膜经反复多次加入PBS进行稀释超滤浓缩脱盐。
7.如权利要求4所述的方法，其中，步骤2)和步骤4)采用0.0lM ρΗ7.0 7.5的PBS预平衡DEAE — Sepharose Fast Flow层析柱,然后上样。
8.如权利要求4所述的方法，其还包括将步骤5)除盐后的溶液直接冷冻干燥，或加入保护剂冷冻干燥。
9.如权利要求Γ8任一项所述的方法，其中，步骤3)和步骤5)采用分子截留值为5，000^10, 000D超滤膜的超滤浓缩方式降低目的蛋白洗脱溶液体积，然后进行透析脱盐；或采用分子截留值为5，000^10, 000D的超滤膜将洗脱液经反复稀释超滤脱盐并浓缩蛋白。
全文摘要
本发明提供了一种尖吻蝮蛇血凝酶-C，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离得到的一种血凝酶，分子量29213.4D，等电点5.7。该酶由α、β两条链构成，链间由二硫键连接，其中α链具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，β链具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明尖吻蝮蛇血凝酶为丝氨酸蛋白酶。本发明还提供了该酶的纯化方法，包括通过硫酸铵分级沉淀预处理去除不溶物及杂蛋白，再通过两次阴离子交换柱层析，收集活性洗脱峰，经透析、超滤浓缩及脱盐后即得高纯度蛇毒血凝酶，其比活力不低于40U/mg蛋白，HPLC分析纯度可达95%以上，以蛇毒原料重量计纯化收得率为0.4%－0.5%。
文档编号A61K38/48GK103160485SQ201310055128
公开日2013年6月19日 申请日期2013年2月21日 优先权日2012年12月28日
发明者孙狄, 王锡娟 申请人:北京康辰药业有限公司