专利名称：一种仙灵骨葆的提取方法、分离提取物及制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种仙灵骨葆的提取方法，具体涉及一种仙灵骨葆的提取方法、分离提取物及制剂。
背景技术：
骨质疏松症是一个世界范围的、越来越引起人们重视的健康问题，目前全世界约2亿人患有骨质疏松症，其发病率已跃居常见病、多发病的第七位。最新研究表明，在我国一直被认为是老年人特有疾病的骨质疏松症，实际上在儿童时期就已存在。特别需要强调的是，目前医学上还未有安全而有效的根治方法，帮助已疏松的骨骼恢复原状，因此，正确认识、早期预防显得尤为重要。随着人口老龄化日趋明显，作为中老年多发的退行性疾病一骨质疏松症及其并发症，已成为一个社会性的健康问题而备受老年病学者的关注，并引起了各国政府的高度重视。骨质疏松症的主要危险结果是易致骨折，像高血压病控制不好易致中风一样，骨质疏松症在西方发展国家的妇女中发生率高，在美国约有2500万患者，每年约有150万患者并发骨折，约20%的骨折患者在I年内因并发肺栓塞、肺炎而死亡，在妇女骨质疏松性骨折而致的死亡率超过乳房癌、宫颈癌和子宫体癌的总和，半数髋部骨折的存活者失去独立生活的能力，约20%的患者只能生活在护理院中。骨质疏松性骨折医疗费用耗资巨大，1984年美国估计61亿美元，最近估计达100亿美元，随着人口的不断老龄化和平均期望寿命增长，如果不采取有效的干预，未来的25年，此项医疗引导可能还要成倍增长。迈入21世纪，我国人口已近13亿，60岁以上的人群达10%，这标志着我国开始进入老龄社会，骨质疏松症病人势必迅猛增加。在我国已经构成一个严重的公众健康问题。仙灵骨葆制剂是用于治疗骨质疏松的一种成熟制剂，现有技术也公开了各种仙灵骨葆制剂及其制备方法。 中国申请N0.201110317157.3公开了一种仙灵骨葆复方的提取物、含其制剂及其制备方法，仙灵骨葆提取物是由以下重量份的中药制成:淫羊藿600-1500份、丹参50-150份、补骨脂50-150份、续断80-200份、知母50-150份和地黄50-150份，其活性成分为:丹参和补骨脂的醇提物，淫羊藿、续断、知母和地黄的水提物。制备时取淫羊藿的水提物，丹参、补骨脂的醇提物，知母、续断和地黄的水提物，混合均匀，即得仙灵骨葆提取物。中国申请N0.200410051606.4公开了仙灵骨葆新制剂及其制备方法和用途，制剂的有效成分中包括淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄，所用药材配比为:淫羊藿1167、续断167、丹参83、知母83、补骨脂83、地黄83 ；以上六味，续断、丹参、补骨脂粉碎成细粉，其余淫羊藿等三味加水煎煮三次，每次I小时，合并煎液，浓缩至相对密度为1.35 1.38(30°C)的稠膏，加入上述药材细粉，混匀，干燥，粉碎；即得制备分散片或软胶囊的提取物；上述组份的药材提取物配合采用适当种类的药学上所称的辅料或基质制成仙灵骨葆软胶囊、分散片、包衣分散片，如与分散介质、助悬剂、防腐剂制成软胶囊，或与填充剂、崩解剂、润湿剂、润滑剂制成分散片。上述技术方案均采用将处方中6味原料分别或部分混合提取，再将所得提取物混合即得仙灵骨葆提取物，向其中加入药学上可用的辅料，制备成仙灵骨葆的相关制剂。此夕卜，现有技术还公开了其他仙灵骨葆制剂的技术方案，均是从个别原料的提取或者制剂辅料的选择及制剂方法的角度展开的。发明人在实际深入研究中发现，长期服用仙灵骨葆制剂对人体产生一定的副作用，而现有技术公开的各种改进技术方案对此改善并不显著，因此，时下急待找到一种理想的仙灵骨葆提取物及其制剂，在减少副作用的前提下，还能明显提闻制剂的疗效。
发明内容
本发明的第一目的是在现有处方的基础上，通过对仙灵骨葆原料粉末进一步提取，得到一种全新的仙灵骨葆分离提取物，以提高活性成分的稳定性，显著改善制剂的疗效。为实现本发明的第一目的，采用如下技术方案:一种仙灵骨葆提取物，所述的提取物经由以下方法提取得到:(I)按重量份计称取淫羊藿600-1500份、丹参50-150份、补骨脂50-150份、续断80-200份、知母50-150份和地黄50-150份；(2)将断续、丹参、补骨脂粉碎成细粉；淫羊藿、知母和地黄混合后经水提得到水提物，浓缩至稠膏，加入上述细粉，混匀，干燥，得到仙灵骨葆原料粉；(3)取和/或称量所述仙灵骨葆原料粉，以10-95%的乙醇水溶液浸溃过夜，回流提取1-3次，每次1-3小时；提取液过滤，滤液减压回收溶剂至无醇味，加入蒸馏水定容，混合均匀，得到仙灵骨葆原料粉提取物；
`0013](4)将仙灵骨葆原料粉提取物混悬于蒸馏水中，离心，抽滤，取滤液上大孔吸附树脂色谱柱，分别以水、25-40%乙醇水溶液、75-98%乙醇水溶液梯度洗脱，分别收集水、25-40%乙醇水溶液、75-98%乙醇水溶液的洗脱物，减压回收溶剂至无醇味，加入蒸馏水定容，混合均匀，得到仙灵骨葆分离提取物。这里的仙灵骨葆分离提取物为流程图中所示的XLGB-A, XLGB-B 和 XLGB-C。其中，优选所述步骤I中各原料药分别为:淫羊藿1000-1200份、丹参70-100份、补骨脂70-100份、续断150-180份、知母70-100份和地黄70-100份。更优选所述步骤I中各原料药分别为:淫羊藿1167份、丹参83份、补骨脂83份、续断167份、知母83份和地黄83份。本发明的第二目的在于提供一种仙灵骨葆的提取方法，为实现第二目的，采用如下技术方案:(I)按重量份计称取淫羊藿600-1500份、丹参50-150份、补骨脂50-150份、续断80-200份、知母50-150份和地黄50-150份，优选地淫羊藿1167份、丹参83份、补骨脂83份、续断167份、知母83份和地黄83份；(2)将断续、丹参、补骨脂粉碎成细粉；淫羊藿、知母和地黄混合后经水提得到水提物，浓缩至稠膏，加入上述细粉，混匀，干燥，得到仙灵骨葆原料粉；(3)取和/或称量所述仙灵骨葆原料粉，以乙醇水溶液浸溃过夜，回流提取；提取液过滤，滤液减压回收溶剂至无醇味，加入蒸馏水定容，混合均匀，得到仙灵骨葆原料粉提取物；
(4)将仙灵骨葆原料粉提取物混悬于蒸馏水中，离心，抽滤，取滤液上色谱柱，分别以水和乙醇水溶液进行梯度洗脱，优选地以水、25-40%乙醇水溶液、75-98%乙醇水溶液梯度洗脱，分别收集水和乙醇水溶液的洗脱物，减压回收溶剂至无醇味，加入蒸馏水定容，混合均匀，得到仙灵骨葆分离提取物。这里的仙灵骨葆分离提取物为流程图中所示的XLGB-A, XLGB-B 和 XLGB-C。本发明的核心在于，沿用传统处方，将采用现有提取工艺所得的仙灵骨葆原料粉进一步提取和分离，得到全新的仙灵骨葆分离提取物，该全新的分离提取物能以显著低于现有仙灵骨葆制剂的剂量，获得更好的治疗效果，并有力控制药物可能带来的不良反应。本发明所述仙灵骨葆原料粉可经由现有技术公开的各种方法制备，如背景技术中所提及的中国申请CN201110317157.3和中国申请CN200410051606.4中公开的技术方案。作为本发明的一种更理想的实施方式，优选所述的步骤2为:将断续、丹参、补骨脂粉碎成细粉；淫羊藿、知母和地黄加水煎煮2-4次，每次0.5-4小时，优选地加水煎煮三次，时间分别为3、2、I小时，合并煎液，浓缩至30°C下相对密度为1.35-1.38的稠膏，加入上述细粉，混匀，干燥，得仙灵骨葆原料粉。此外，更优选地，本发明还可以采用如下方法对处方原料药进行处理:将断续、丹参、补骨脂粉碎成2-4目的细粉；淫羊藿、知母和地黄加水煎煮2-4次，每次0.5-4小时，合并煎液，高速离心，上清液用聚砜中空纤维膜(3000道尔顿)滤过，滤液浓缩至30°C下相对密度为1.35-1.38的稠膏，加入上述细粉，混匀，干燥，得仙灵骨葆原料粉。采用这种提取方式，能够更大程度地将原料药中的活性成分提取出来，有助于后续的进一步提取分离。本发明对仙灵骨葆原料粉的处理优选通过如下步骤来实现:取和/或称量仙灵骨葆原料粉，以8-12倍50-75%的乙醇水溶液浸溃过夜、优选10倍60%的乙醇水溶液浸溃过夜，优选在加热条件下回流提取1-3次，每次1-3小时；提取液过滤，滤液减压回收溶剂至无醇味，加入10-20倍量蒸馏水 定容，混合均匀，得到所述仙灵骨葆原料粉提取物；其中，在一个优选的方式中，取仙灵骨葆原料粉，以10倍60%的乙醇水溶液浸溃过夜，加热回流提取2次，每次2小时；提取液过滤，滤液减压回收溶剂至无醇味，加入15倍量蒸馏水，混合均匀，得到仙灵骨葆原料粉提取物。本发明的提取方法还包括计算所述仙灵骨葆原料粉提取物中干物质收率的步骤，该步骤具体包括称取一小部分所述仙灵骨葆原料粉提取液，用水稀释，冷冻干燥，得到干物质，计算收率。在步骤(3)中，通过将含有6味原材料或其提取物的仙灵骨葆原料粉进一步提取，选择适宜的提取条件，能够初步有效去除其中对人体会产生不良反应的物质，提高制剂整体的疗效。在所述步骤(4)中，将所述仙灵骨葆原料粉提取物混悬于按重量计10-15倍量蒸馏水中，对所得溶液进行第一次离心，抽滤，取滤液上大孔吸附树脂色谱柱，分别以水、25-40%乙醇水溶液、75-98%乙醇水溶液洗脱、优选地以水、30%乙醇水溶液、95%乙醇水溶液梯度洗脱，分别收集各自的洗脱物，减压回收溶剂至无醇味，加入10-20倍蒸馏水定容，混合均匀，得到仙灵骨葆分离提取物。所述步骤4中所述大孔吸附树脂为大孔吸附树脂HP-20色谱柱；水、30%乙醇水溶液、95%乙醇水溶液用作洗脱液。在所述步骤4中，色谱柱体积按体积计为上样量的0.8-1.2倍，作为洗脱液的水的用量为4倍的柱体积，25-40%的乙醇水溶液用量为4倍的柱体积，75-98%的乙醇水溶液用量为4倍的柱体积。本发明方法还包括将第一次离心后的滤渣以25-40%乙醇混旋，进行第二次离心，将所得的上清液上大孔吸附树脂 色谱柱，以25-40%乙醇水溶液洗脱，得到洗脱物，合并入步骤4中得到的25-40%乙醇水溶液的洗脱物；将第二次离心后的滤渣合并入步骤4中得到的75-98%乙醇水溶液的洗脱物。本发明方法还包括计算水、25-40%乙醇水溶液、75-98%乙醇水溶液的洗脱物中的干物质收率的步骤，其包括在对水、25-40%乙醇水溶液、75-98%乙醇水溶液的洗脱物减压回收溶剂至无醇味后，用蒸馏水进行定容，取一小部分用蒸馏水进行稀释，冷冻干燥，得到干物质，计算收率。冷冻干燥过程可以分三步进行:预冻结、低温真空升华干燥和高温干燥。由于本品为中药，粘性大不易成形而且冻干体积较大，预冻不易冻实等特点，在冻干程序升温中设计了三个平台期。具体方法为将冷冻箱预冻至温度为_25°C后，再将冻干原液置冷冻箱中，待样品冷至预冻温度后，保持冷冻5h，然后抽真空(20Pa)，以2°C /hr程序升温，在_15°C时保温10h，最后以5°C /hr降温至_25°C干燥，保持5h，封口即得。冻干后产品成型性、复溶性良好，含水量低。确定以此为最终冻干条件。本领域技术人员知道，中药的提取是一个复杂的过程，期间不仅发生有效活性成分的溶出，也有不同组分间相互转化、结合或影响。因此，采用不同的提取方法，得到的提取物组成不尽相同。即使采用相同的提取方法，改变提取条件，如溶剂、提取方式、提取时间、温度等，同样会使提取物发生变化。发明人长期致力于仙灵骨葆制剂的研究，结果表明，将处方中6味原料药提取物混合后经过二次提取能够集中将仙灵骨葆的活性成分提取出来，在明显提高药效的同时，副作用也得到相当显著的控制，究其原因，可能是混合二次提取的过程中，6种原材料中容易引起人体副作用的组分间发生了某些结合或者转化，在二次提取过程中被分离。此外，本发明要求保护的最终提取物稳定性较现有的仙灵骨葆提取物有显著提高。本发明还涉及仙灵骨葆分离提取物，通过上述的本发明的方法提取得到。本发明的第三目的在于提供一种含有上述仙灵骨葆分离提取物的仙灵骨葆制剂。所述仙灵骨葆分离提取物经过干燥优选冷冻干燥而制备仙灵骨葆制剂。在一个可替代的方案中，本发明所述的仙灵骨葆制剂由所述仙灵骨葆分离提取物(即XLGB-A，XLGB-B和XLGB-C)经干燥优选冷冻干燥后与药学上可接受的辅料制备而成。具体辅料的选择及其用量的确定为本领域技术人员所掌握。优选所述的仙灵骨葆制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液或粉针剂。上述仙灵骨葆片剂按重量份计，可包括如下组成:仙灵骨葆提取物30-99份和辅料1-70份。片剂的制备方法可采用现有技术公开的任一种来实现。上仙灵骨葆胶囊剂，按重量份计，可包括如下组成:仙灵骨葆提取物50-99份和辅料1-50份。胶囊剂的制备方法可采用现有技术公开的任一种来实现。上仙灵骨葆口服剂，按重量份计，可包括如下组成:仙灵骨葆提取物40-90份和辅料10-60份。口服剂的制备方法可采用现有技术公开的任一种来实现。
上仙灵骨德粉针剂,按重量份计,可包括如下组成:仙灵骨德提取物35-99份和辅料1-65份。粉针剂的制备方法可采用现有技术公开的任一种来实现。上仙灵骨德颗粒剂,按重量份计,可包括如下组成:仙灵骨德提取物45-99份和辅料1-55份。颗粒剂的制备方法可采用现有技术公开的任一种来实现。采用上述技术方案，本发明所述的仙灵骨葆制剂在稳定性和疗效上较现有技术得到了显著改善。
图1是仙灵骨葆的提取流程图。
具体实施例方式实施例1按重量份计称取淫羊藿1167份、丹参83份、补骨脂83份、续断167份、知母83份和地黄83份；将断续、丹参、补骨脂粉碎成细粉；淫羊藿、知母和地黄混合后加水煎煮三次，时间分别是3、2、1小时，合并煎液，浓缩至30°C下相对密度为1.35-1.38的稠膏，加入上述断续、丹参、补骨脂的细粉，混匀，干燥，得到仙灵骨葆原料粉。称取仙灵骨葆原料粉800g，以按重量计10倍量的60%的乙醇水溶液浸溃过夜，加热回流提取2次，每次2小时；提取液用四层纱布过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味。加入蒸懼水定容至5000mL。混合均勻后,取450mL,稀释后冷冻干燥,得到干物质46.63g。以此推算，800g “仙灵骨葆 ”原料粉的提取物(XLGB)的干物质约有518.lg，收率约为64.8 %。称取仙灵骨葆原料粉的提取物(干物质)450g，混悬于5L蒸馏水中，3000rpm离心(称为第一次离心)30min，上清液抽滤后，取滤液上大孔吸附树脂HP-20色谱柱(Φ 9 X 70cm,事先用15L蒸馏水平衡)，分别以水、30%乙醇-水溶液、95% (v/v)乙醇-水溶液梯度洗脱。HP-20色谱柱的柱体积为上样溶液的0.8-1.2倍。离心后的滤渣分次以30%乙醇混旋，3000rpm进行第二次离心持续半小时，30%乙醇用量不超过I个柱体积。第二次离心所得的滤液上样至经水洗脱后的HP-20色谱柱，滤渣与95%的乙醇-水洗脱物混合。作为洗脱液的水的用量为4倍的柱体积，25-40%的乙醇水溶液用量为4倍的柱体积，75-98%的乙醇水溶液用量为4倍的柱体积。分别收集各洗脱物，减压回收溶剂至无醇味后，用蒸馏水定容，混合均匀。取少量进一步用蒸馏水稀释，冷冻干燥。以此推算，各部分干物质分别为水洗脱物 227.2g (XLGB-A, 58.9% ),30% (v/v)乙醇-水洗脱物 61.3g (XLGB-B，13.0% )和 95%(v/v)乙醇-水洗脱物109.3g(XLGB-C，23.2%)。计算总收率为95.1%。参见图1，图1为仙灵骨葆原料粉提取及分离的流程图。将所得的水洗脱物、30%乙醇-水洗脱物、95% (v/V)乙醇-水洗脱物合并，冷冻干燥，制备得到仙灵骨葆的分离提取物。得到用于制备仙灵骨葆制剂的提取物，即以下实验组I中的提取物。实施例2按重量份计称取淫羊藿1167份、丹参83份、补骨脂83份、续断167份、知母83份和地黄83份；将断续、丹参、补骨脂粉碎成细粉；淫羊藿、知母和地黄混合后加水煎煮三次，时间分别是2、2、1.5小时，合并煎液，浓缩至30°C下相对密度为1.35-1.38的稠膏，加入上述断续、丹参、补骨脂的细粉，混匀，干燥，得到仙灵骨葆原料粉。
称取仙灵骨葆原料粉800g，以按重量计15倍量的60%的乙醇水溶液浸溃过夜，加热回流提取2次，分别为2和I小时；提取液用四层纱布过滤，合并滤液，减压回收溶剂至无醇味。加入蒸懼水定容至5000mL。混合均勻后,取450mL,稀释后冷冻干燥,得到干物质47gg。以此推算，800g “仙灵骨葆”原料粉的提取物(XLGB)的干物质约有520gg，收率约为65%。称取仙灵骨葆原料粉的提取物450g，混悬于5L蒸馏水中，3000rpm离心30min，上清液抽滤后，取滤液上大孔吸附树脂HP-20色谱柱(Φ9Χ70(:πι，事先用15L蒸馏水平衡)，分别以水、30%乙醇-水溶液、95% (v/v)乙醇-水溶液梯度洗脱。HP-20色谱柱的柱体积为上样溶液的0.8-1.2倍。离心后的滤渣分次以30%乙醇混旋，3000rpm进行第二次离心持续半小时，30%乙醇用量不超过I个柱体积。第二次离心所得的滤液上样至经水洗脱后的HP-20色谱柱，滤渣与95%的乙醇-水洗脱物混合。作为洗脱液的水的用量为4倍的柱体积，30%的乙醇水溶液用量为4倍的柱体积，95%的乙醇水溶液用量为4倍的柱体积。分别收集各洗脱物，减压回收溶剂至无醇味后，用蒸馏水定容，混合均匀。取少量进一步用蒸馏水稀释，冷冻干燥。以此推算，各部分干物质分别为水洗脱物231.3g (XLGB-A, 58.9%),30% (v/v)乙醇-水洗脱物63g (XLGB-B，13.0%)和95% (v/v)乙醇-水洗脱物112g(XLGB-C, 23.2% )0计算总收率为95.8%。制备流程图参见图1。将所得的水洗脱物、30%乙醇-水洗脱物、95% (v/v)乙醇-水洗脱物合并，冷冻干燥，得到用于制备仙灵骨葆制剂的提取物，即以下实验组2中的提取物。实施例3按重量份计称取淫羊藿600份、丹参50份、补骨脂50份、续断80份、知母50份和地黄50份；将断续、丹参、补骨脂粉碎成细粉；淫羊藿、知母和地黄混合后加水煎煮三次，时间分别是3、2、1小时，合并煎液，浓缩至3`0°C下相对密度为1.35-1.38的稠膏，加入上述断续、丹参、补骨脂的细粉，混匀，干燥，得到仙灵骨葆原料粉。称取仙灵骨葆原料粉800g，以按重量计10倍量的50%的乙醇水溶液浸溃过夜，加热回流提取2次，每次2小时；提取液用四层纱布过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味。加入蒸懼水定容至5000mL。混合均勻后,取450mL,稀释后冷冻干燥,得到干物质47.lg。称取仙灵骨葆原料粉的提取物450g，混悬于5L蒸馏水中，3000rpm离心30min，上清液抽滤后，取滤液上大孔吸附树脂HP-20色谱柱(Φ 9 X 70cm,事先用15L蒸馏水平衡)，分别以水、25%乙醇-水溶液、75% (v/v)乙醇-水溶液梯度洗脱。HP-20色谱柱的柱体积为上样溶液的0.8-1.2倍。离心后的滤渣分次以30%乙醇混旋，3000rpm进行第二次离心持续半小时，30%乙醇用量不超过I个柱体积。第二次离心所得的滤液上样至经水洗脱后的HP-20色谱柱，滤渣与75%的乙醇-水洗脱物混合。作为洗脱液的水的用量为4倍的柱体积，25%的乙醇水溶液用量为4倍的柱体积，75%的乙醇水溶液用量为4倍的柱体积。分别收集各洗脱物，减压回收溶剂至无醇味后，用蒸馏水定容，混合均匀。取少量进一步用蒸馏水稀释，冷冻干燥。以此推算，各部分干物质分别为水洗脱物231g (XLGB-A, 58.9% ),25% (v/V)乙醇-水洗脱物 60.2g (XLGB-B, 13.0%)和 75% (v/v)乙醇-水洗脱物 113g (XLGB-C,23.2%)0将所得的水洗脱物、25%乙醇-水洗脱物、75% (v/v)乙醇-水洗脱物合并，冷冻干燥，制备得到仙灵骨葆的分离提取物。得到用于制备仙灵骨葆制剂的提取物。实施例4
按重量份计称取淫羊藿1500份、丹参150份、补骨脂150份、续断200份、知母150份和地黄150份；将断续、丹参、补骨脂粉碎成细粉；淫羊藿、知母和地黄混合后加水煎煮三次，时间分别是3、2、1小时，合并煎液，浓缩至30°C下相对密度为1.35-1.38的稠膏，加入上述断续、丹参、补骨脂的细粉，混匀，干燥，得到仙灵骨葆原料粉。称取仙灵骨葆原料粉800g，以按重量计10倍量的75%的乙醇水溶液浸溃过夜，加热回流提取2次，每次2小时；提取液用四层纱布过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味。加入蒸懼水定容至5000mL。混合均勻后,取450mL,稀释后冷冻干燥,得到干物质46.8g。称取仙灵骨葆原料粉的提取物450g，混悬于5L蒸馏水中，3000rpm离心30min，上清液抽滤后，取滤液上大孔吸附树脂HP-20色谱柱(Φ 9 X 70cm,事先用15L蒸馏水平衡)，分别以水、40 %乙醇-水溶液、98 % (v/v)乙醇-水溶液梯度洗脱。HP-20色谱柱的柱体积为上样溶液的0.8-1.2倍。离心后的滤渣分次以30%乙醇混旋，3000rpm进行第二次离心持续半小时，30%乙醇用量不超过I个柱体积。第二次离心所得的滤液上样至经水洗脱后的HP-20色谱柱，滤渣与98%的乙醇-水洗脱物混合。作为洗脱液的水的用量为4倍的柱体积，40%的乙醇水溶液用量为4倍的柱体积，98%的乙醇水溶液用量为4倍的柱体积。分别收集各洗脱物，减压回收溶剂至无醇味后，用蒸馏水定容，混合均匀。取少量进一步用蒸馏水稀释，冷冻干燥。以此推算，各部分干物质分别为水洗脱物225g (XLGB-A, 58.9% ),40% (v/v)乙醇-水洗脱物 60.6g (XLGB-B, 13.0%)和 98% (v/v)乙醇-水洗脱物 102.3g (XLGB-C,23.2%)0将所得的水洗脱物、40%乙醇-水洗脱物、98% (v/v)乙醇-水洗脱物合并，冷冻干燥，制备得到仙灵骨葆的分离提取物。得到用于制备仙灵骨葆制剂的提取物。实施例5将实施例1中获得的分离提取物按重量计80份与辅料20份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆片剂。将实施例1中获得的分离提取物按重量计85份与辅料15份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆片剂。 将实施例1中获得的分离提取物按重量计90份与辅料10份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆片剂。将实施例1中获得的分离提取物按重量计75份与辅料25份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆片剂。将实施例1中获得的分离提取物按重量计60份与辅料40份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆片剂。将实施例1中获得的分离提取物按重量计82份与辅料18份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆胶囊剂。将实施例1中获得的分离提取物按重量计65份与辅料35份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆胶囊剂。将实施例1中获得的分离提取物按重量计72份与辅料28份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆胶囊剂。将实施例1中获得的分离提取物按重量计88份与辅料12份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆胶囊剂。将实施例1中获得的分离提取物按重量计92份与辅料8份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆胶囊剂或者，将实施例1中获得的分离提取物按重量计80份与辅料20份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆胶囊剂。或者，将实施例1中获得的分离提取物按重量计90份与辅料10份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆口服剂。或者，将实施例1中获得的分离提取物按重量计55份与辅料45份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆口服剂。或者，将实施例1中获得的分离提取物按重量计40份与辅料60份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆口服剂。或者，将实施例1中获得的分离提取物按重量计45份与辅料55份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆粉针剂。或者，将实施例1中获得的分离提取物按重量计50份与辅料50份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆粉针剂。或者，将实施例1中获得的分离提取物按重量计95份与辅料5份混合，按照常规工艺制备仙灵骨葆粉针剂。为了进一步介绍本发明所述仙灵骨葆提取物，发明人还做了一系列对比实验。试验方法:1.试验材料1.1药物及试剂1.1.1试验组别及药物:实验组1:本发明实施例1所制备的仙灵骨葆提取物实验组2:本发明实施例2所制备的仙灵骨葆提取物对照组1:申请号N0.201110317157.3的中国申请(公开号为CN102343027A，
公开日为2012年2月8日)公开的实施例1对照组2:申请号N0.200410051606.4的中国申请公开的实施例1。具体如下:续断、丹参、补骨脂粉碎成80目细粉，其余淫羊藿等三味加水煎煮三次，每次I小时，合并煎液，浓缩至相对密度为1.35 (30° C)的稠膏，加入上述药材细粉，混匀；干燥，粉碎至80目的细粉，即得制备分散片或软胶囊的药材提取物。对照组3:市售的贵州同济堂制药有限公司生产的仙灵骨葆胶囊空白对照组:给等容积生理盐水1.2试验动物兔:日本大耳白兔种，2.0 2.6kg，雌雄兼用。由贵阳医学院试验动物中心提供。大鼠:SD种，180 250g，雌雄兼用。由贵阳医学院试验动物中心提供。小鼠:昆明种，18 22g，雌雄兼用。由贵阳医学院试验动物中心提供。动物合格证号:SCXK-(黔)2002-0001ο饲料:辐射灭菌颗粒饲料，苏州双狮实验动物饲料科技有限公司生产。饲养条件:动物室环境光照充足，通风良好，室温18 25°C，湿度5(Γ70%。兔、大鼠置不锈钢饲养笼饲养，小鼠置塑料笼饲养， 均雌雄分笼，自由饮水及食料。1.3主要仪器
图像分析系统:HPIAS —1000型，同济医科大学千屏影像工程公司。全自动生化分析仪:Abbott Aeroset2000型，美国雅培公司。多探头放免仪:中国科大中佳公司。2.试验设计2.1给药途径:动物试验给药途径与临床用药途径相一致，采用灌胃给药方法。2.2试验周期:试验周期见各试验具体方法。2.3数据处理:试验数据用NDST软件进行t检验或X2检验。3.试验方法及结果3.1骨折治疗试验3.1.1对兔骨折愈合的影响:取日本大耳白兔，戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉，仰卧位固定，左前肢去毛，皮肤常规消毒，于左前肢桡侧屈面纵行切开皮肤2 3cm，分离肌肉，避开血管神经，暴露桡骨中远段交界处，以特制钢锯横向锯断桡骨，形成3_切损的完全性骨折。将错开的骨折端复位，逐层缝合(术后7天伤口拆线)，伤口包扎，但不固定。术后次日拆除敷料，将54只骨折动物随机分为6组(每组动物9只，雌雄兼用，体重2.31±0.18kg):实验组I (2g/kg，临床成人日用量的10倍)、实验组2 (2g/kg，临床成人日用量的10倍)、对照组I (2g/kg，临床成人日用量的10倍)、对照组2 (2g/kg，临床成人日用量的10倍)、对照组3 (2g/kg，临床成人日用量的10倍)。空白对照组(给等容量生理盐水)。动物均灌胃给药，每日I次，连续28天。试验期间进行下述项目的观察:
3.1.1.1骨折肢支撑着地时间的比较:骨折后，动物为避痛，患肢不敢着地，空抬患肢。经过恢复，当患肢敢于放在地上并支撑躯体。经过恢复后患肢支撑躯体的时间即为支撑着地时间(单位:小时)。支撑着地时间越长说明恢复效果越好。结果:实验组1、实验组2明显延长动物骨折肢支撑着地时间，与空白对照组比较，P〈0.05。见表 I。表I对兔骨折肢支撑着地时间的影响(X土S)
权利要求
1.一种仙灵骨葆的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括如下步骤: (1)按重量份计称取淫羊藿600-1500份、丹参50-150份、补骨脂50-150份、续断80-200份、知母50-150份和地黄50-150份，优选地淫羊藿1167份、丹参83份、补骨脂83份、续断167份、知母83份和地黄83份； (2)将断续、丹参、补骨脂粉碎成细粉；淫羊藿、知母和地黄混合后经水提得到水提物，浓缩至稠膏，加入上述细粉，混匀，干燥，得到仙灵骨葆原料粉； (3)取和/或称量所述仙灵骨葆原料粉，以10-95%乙醇水溶液浸溃过夜，回流提取；提取液过滤，滤液减压 回收溶剂至无醇味，加入蒸馏水定容，混合均匀，得到仙灵骨葆原料粉提取物； (4)将仙灵骨葆原料粉提取物混悬于蒸馏水中，离心，抽滤，取滤液上色谱柱，分别以水和乙醇水溶液进行梯度洗脱，优选地以水、25-40%乙醇水溶液、75-98%乙醇水溶液梯度洗脱，分别收集水和乙醇水溶液的洗脱物，减压回收溶剂至无醇味，加入蒸馏水定容，混合均匀，得到仙灵骨葆分离提取物。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在所述步骤2中，淫羊藿、知母和地黄加水煎煮2-4次，每次0.5-4小时，优选地加水煎煮三次，时间分别为3、2、I小时，合并煎液，浓缩至30°C下相对密度为1.35-1.38的稠膏，加入上述细粉，混匀，干燥，得到仙灵骨葆原料粉。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在所述步骤3中，取仙灵骨葆原料粉，以8-12倍的50-75%的乙醇水溶液、优选10倍60%的乙醇水溶液浸溃过夜，优选在加热条件下回流提取1-3次，每次1-3小时，优选地回流提取2次，每次2小时；提取液过滤，滤液减压回收溶剂至无醇味，加入10-20倍量蒸馏水定容，混合均匀，得到所述仙灵骨葆原料粉提取物。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述方法还包括计算所述仙灵骨葆原料粉提取物中干物质收率的步骤，其包括称取一小部分所述仙灵骨葆原料粉提取液，用水稀释，冷冻干燥，得到干物质，计算收率。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在所述步骤4中，将所述仙灵骨葆原料粉提取物混悬于按重量计10-15倍量蒸馏水中，对所得溶液进行第一次离心，抽滤，取滤液上大孔吸附树脂色谱柱，分别以水、25-40%乙醇水溶液、75-98%乙醇水溶液洗脱、优选地以水、30%乙醇水溶液、95%乙醇水溶液梯度洗脱，分别收集各自的洗脱物，减压回收溶剂至无醇味，加入10-20倍蒸馏水定容，混合均匀，得到仙灵骨葆分离提取物。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在所述步骤4中，色谱柱体积按体积计为上样量的0.8-1.2倍，作为洗脱液的水的用量为4倍的柱体积，25-40%的乙醇水溶液用量为4倍的柱体积，75-98%的乙醇水溶液用量为4倍的柱体积。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述方法还包括将第一次离心后的滤渣以25-40%乙醇混旋，进行第二次离心，将所得的上清液上大孔吸附树脂色谱柱，以25-40%乙醇水溶液洗脱，得到洗脱物，合并入步骤4中得到的25-40%乙醇水溶液的洗脱物；将第二次离心后的滤渣合并入步骤4中得到的75-98%乙醇水溶液的洗脱物。
8.根据权利要求3或7所述的提取方法，其特征在于，所述方法还包括计算水、25-40%乙醇水溶液、75-98%乙醇水溶液的洗脱物中的干物质收率的步骤，其包括在对水、25-40%乙醇水溶液、75-98%乙醇水溶液的洗脱物减压回收溶剂至无醇味后，用蒸馏水进行定容，取一小部分用蒸馏水进行稀释，冷冻干燥，得到干物质，计算收率。
9.一种仙灵骨葆分离提取物，其特征在于，所述分离提取物通过权利要求1-8中任一项所述的方法提取得到。
10.有权利要求9所 述仙灵骨葆分离提取物的仙灵骨葆制剂。
全文摘要
本发明提供一种仙灵骨葆的提取方法、分离提取物及制剂。本发明提供了一种仙灵骨葆的提取方法，包括(1)按重量份计称取淫羊藿600-1500份、丹参50-150份、补骨脂50-150份、续断80-200份、知母50-150份和地黄50-150份；(2)将断续、丹参、补骨脂粉碎成细粉；淫羊藿、知母和地黄混合后经水提得到水提物，浓缩至稠膏，加入上述细粉，混匀，干燥，得到仙灵骨葆原料粉；(3)取仙灵骨葆原料粉，以乙醇水溶液浸渍过夜，回流提取；提取液过滤，滤液减压回收至无醇味，定容，得到仙灵骨葆原料粉提取物；(4)将仙灵骨葆原料粉提取物混悬于蒸馏水中，离心，抽滤，取滤液上色谱柱进行梯度洗脱，分别收集洗脱物，减压回收至无醇味，定容，得到仙灵骨葆分离提取物。
文档编号A61K36/8964GK103083521SQ201310055079
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月20日 优先权日2013年2月20日
发明者周宁, 王晓春, 姚新生, 秦岭, 戴毅, 王新峦, 冯泽熹, 张志强, 孙宜春, 曾香兰, 庞媛媛, 王飞 申请人:贵州同济堂制药有限公司