减轻神经元细胞损害的方法

减轻神经元细胞损害的方法
【专利摘要】本发明涉及一种减轻由暂时性脑缺氧和/或缺血导致的神经元细胞损害包括死亡发生的方法。该方法包括下列步骤：诊断患暂时性脑缺氧和/或缺血病症的患者；和在病症发生后16小时内给该患者施用神经保护量的药剂。该药剂优选自：中枢神经系统兴奋剂(CNSS)、单胺神经递质、单胺氧化酶抑制剂(MAOI)、三环抗抑郁剂(TCA)或其组合。优选的药剂包括苯丙胺、甲基苯丙胺、哌甲酯、亚甲基二氧基甲基苯丙胺或其组合。
【专利说明】减轻神经元细胞损害的方法
[0001]本分案申请是基于申请号为200780035457.4，申请日为2007年8月15日，发明名称为“减轻神经元细胞损害的方法”的原始中国专利申请的分案申请。
[0002]相关申请的资料
[0003]本发明要求2006年8月23日提交的美国临时申请60/839,974的权益，将其内容以整体通过参考明确引入本文。
【技术领域】
[0004]本发明涉及一种减轻由暂时性脑缺氧和/或缺血导致的神经元细胞损害包括细胞死亡发生的方法。该方法包括下列步骤:诊断患暂时性脑缺氧和/或缺血病症的患者；和在病症发生后16小时内给该患者施用神经保护量的药剂。该药剂优选自:中枢神经系统兴奋剂(CNSS)、单胺神经递质、单胺氧化酶抑制剂(MAOI)、三环抗抑郁剂(TCA)或其组合。优选的药剂包括苯丙胺、甲基苯丙胺(MA)、哌甲酯、亚甲基二氧基甲基苯丙胺或其组合。
[0005]发明背景
[0006]中风是成人残疾的主要原因，其中超过80%与局部缺血损伤有关。迄今为止，还没有证明预防或神经保护治疗对人是有效的。苯丙胺是受到最广泛研究的一种药物，是在发生神经细胞损害后用于促进中风康复的最有希望的一组药物中的一种(参见(Martinssonand Eksborg2004))o在大鼠中，在感觉运动皮质切除24小时后施用单剂量的苯丙胺(例如，右旋苯丙胺)促进了偏瘫康复(Feeney等人，1982)。已经在各种不同的局部损害模型和种类中证明了这种有益效果(Sutton等人，1989 ；Hovda和Fenney 1984 ；Hovda和Feeneyl985 ；Schmanke 等人，1996 ；Dietrich 等人，1990 ；Stroemer 等人，1998)。在各个这样的研究中，通过血管组件的 永久结扎/栓塞，或者皮质切除来建立缺血性损害的模型。
[0007]不同类型的缺血性损害涉及血流向脑中的暂时中断和再灌注。海马对于这种类型的缺血性损害极为敏感。在人和实验啮齿动物模型中，暂时性缺血发生会导致位于海马的神经元，特别是CAl段的椎体细胞选择性和延迟性死亡(Kirinol982)。这种类型的损害会削弱与空间记忆有关的认知功能的实现(Zola-Morgan等人，1986 ；Squire andZoIa-Morgan1991)。尽管在局部缺血或皮质切除模型中所施用的苯丙胺与行为恢复的改善有关，但是据先有技术报道，用苯丙胺治疗不会减小梗塞体积，因此，不是预防性或神经元保护剂。现有技术也提示，在皮质损害后，苯丙胺通过影响脑可塑性(Gold等人，1984)或消除神经机能联系不能(Hovda等人，1987 ;Sutton等人,2000)来促进行为恢复。但是，现有技术还教导了，在某些类型的损害包括黑质的损害后苯丙胺不会改善恢复(Mintz andTomerl986)。现有技术也教导了，在局部缺血前，施用苯丙胺(例如，甲基苯丙胺；MA)确实会增大皮质和纹状体区的梗死体积(Wang等人，2001)。
[0008]仍然需要一种治疗方法来在其发生前预防神经元损害，并在暂时性脑缺氧和/或缺血病症发生后切实提供神经元保护作用，以使损害最小或预防损害。本文公开了这样一种预防方法，其提供了一种在其发生前预防或减轻脑神经元细胞损害的方法，而不是试图在发生后治疗损害并促进康复。[0009]发明简述
[0010]本发明涉及一种减轻由暂时性脑缺氧和/或缺血导致的神经元细胞损害发生的方法。该方法优选包括下列步骤:诊断患暂时性脑缺氧和/或缺血病症的患者；和在病症发生后16小时内给该患者施用神经保护量的药剂。该药剂优选自:中枢神经系统兴奋剂(CNSS)、单胺神经递质、单胺氧化酶抑制剂(MAOI)、三环抗抑郁剂(TCA)或其组合。
[0011]优选的药剂包括苯丙胺、甲基苯丙胺、哌甲酯、亚甲基二氧基甲基苯丙胺或其组
入
口 O
[0012]在一个具体的实施方案，该药剂是以小于5mg/kg的单位剂量施用于患者的甲基
苯丙胺。
[0013]在其他具体的实施方案中，该药剂是甲基苯丙胺、哌甲酯、亚甲基二氧基甲基苯丙胺或其组合和至少一种选自下列物质的其他药剂的组合:单胺神经递质、MAOI或TCA。所述其他药剂也可以包括单胺神经递质，优选自:多巴胺、去甲肾上腺素或5-羟色胺。
[0014]本发明优选减轻脑神经元细胞损害，包括细胞死亡的发生，更优选地，减轻对神经元细胞的神经元细胞损害的发生。在一个优选的实施方案中，本发明减轻对海马的神经元细胞的神经元细胞损害的发生。
[0015]典型地,暂时性脑缺氧和/或缺血病症是由失血、心脏病发生、窒息、手术(例如，心脏手术)、中风、气道阻塞、缺血性视神经病、脊髓损害、外伤性脑损害或低血压导致的。但是，该病症也可以是由很多病症导致的，这些病症是由短暂时间内的缺氧和/或葡萄糖接触神经元细胞而导致的神经元细胞损害。
[0016]在某些优选的实施方案中，该药剂是在病症发生后16，14，12，10，8，6，4或2小时内施用的。优选该药剂是通过胃肠外或口服途径施用的，但是也可以考虑其他途径，并且可以根据病症使用其他途径。
[0017]在一个实施方案中，该药剂是在包含药学可接受的载体的药物组合物中施用的。根据病症和复发的可能性，该药物组合物可以是立即或延长释放制剂。
[0018]附图简述
[0019]附图1:显示的是在缺氧-缺糖(OGD)后MA的神经保护剂量应答。所示的是OGD后48小时取的碘化丙啶染色的大鼠海马切片培养物的代表性影像。用下列剂量的MA处理培养物:(A)非-OGD的对照组；⑶在0GD5分钟后加入125 μ m MA ； (C)在0GD5分钟后加入 250 μ m MA ; (D)在 0GD5 分钟后加入 500 μ m MA ; (E)在 0GD5 分钟后加入 ImM μ m MA ; (F)仅0GD。表(G)显示的是如相对荧光强度(IOD)所报告的PI染色的统计分析。**=p〈0.01，单向 ANOVA，Dunnet' sPost-Hoc (OGD)，误差棒=平均值 &SEM ； (OGD) n=10,(非 _0GD)n=13，(ImM MA)n=10, (500 μ M MA)n=ll, (250 μ M MA)n=9, (125 μ M MA)n=7。
[0020]附图2:显示的是在OGD后MA介导的神经保护作用的时间分析。所示的是OGD后48小时取的碘化丙啶染色的大鼠海马切片培养物的代表性影像。在中风后，在所示的时间点施用250 μ M剂量的MA: (A)非-OGD ；⑶OGD后0-5分钟；(C) OGD后2小时；⑶OGD后4小时；(E)OGD后8小时；(F)OGD后16小时；(G)未处理的0GD。表⑶显示的是如相对荧光强度(IOD)所报告的PI染色的统计分析。η=4，*=ρ〈0.05，单向ANOVA，Dunnet'spost-hoc (OGD)，误差棒=平均值 &SEM。
[0021]附图3:显示的是在新的开放场装置中游走的平均(土SEM)距离。在5分钟的2-VO(Isch)或假手术(Sham)后24小时进行动物试验。在手术后(1_2分钟)，沙鼠接受甲基苯丙胺(5mg)或盐水载体(Omg)。将沙鼠置于中心区，让其适应新环境5分钟，用自动跟踪系统收集距离数据。与无药物的假手术组相比，没有用甲基苯丙胺治疗的缺血沙鼠的活动显著更多。用药物治疗的缺血和假手术的沙鼠并无不同，相对于对照组的状态，药物治疗并不能显著改变活动水平。*P〈0.05vS.缺血+药物状态。
[0022]附图4:显示的是在缺血性发生(Isch)或对照假手术(Sham)后21天评价的各个海马切片的组织学等级量表。在手术后1-2分钟，用甲基苯丙胺(5mg)或载体(Omg)治疗沙鼠。用4点等级量表评价对海马CAl区的损害。将各动物评价为得分O (正常神经元体的4-5个致密层)，I (存在一些变异神经元的4-5个致密层)，2 (具有“虚空间”和/或其间的神经胶质细胞的备用神经体)，3(完全不存在或仅存在稀少的正常神经元体，CAl子域有强烈的神经胶质增生)。分析表明，用甲基苯丙胺治疗显著减轻了缺血性发生后对海马CAl的损害。
[0023]附图5:是在施用甲基苯丙胺(5mg/kg)或载体后，缺血性损害或假手术操作后21天进行的海马区的显微照片。5-分钟的2-V0导致海马CAl区(图C，D)的椎体细胞的选择性丧失。如所期望，假手术(图A，B)不会导致任何神经元细胞丧失。在缺血性损伤后1-2分钟用甲基苯丙胺治疗的沙鼠不会显示对海马的任何损害(图E，F)。用甲酚紫给切片染色。刻度棒=200 μ m(A，C，E)和 60 μ m(B，D, F)。
[0024]优选实施方案的详述
[0025]本发明可以用于减轻由暂时性脑缺氧和/或缺血病症导致的脑神经元细胞损害，包括细胞死亡的发生。优选该方法减轻对海马细胞的神经元细胞损害的发生。暂时性脑缺氧和/或缺血病症是由很多导致短暂时间内脑细胞缺氧和/或葡萄糖的病症导致的。例如，心脏病发作、窒息`、手术(例如，心脏手术)、中风、失血、气道阻塞或低血压。优选地，要治疗的患者是哺乳动物，例如，猴、狗、猫、马、牛、羊、猪，更优选患者是人。
[0026]与现有技术相反，该方法实际上提供了一种在暂时性脑缺氧和/或缺血发生后保护或预防对脑神经元细胞的损害，而不是简单的在导致神经元细胞损害后促进康复。为了给患者提供最大的神经元保护作用，应当在暂时性脑缺氧和/或缺血病症发生后16小时(例如，10，8，6，4，2小时)内给患者施用神经保护剂。该神经保护剂优选自:中枢神经系统兴奋剂(CNSS)、单胺神经递质、单胺氧化酶抑制剂(MAOI)、三环抗抑郁剂(TCA)或其组合。
[0027]在一个更优选的实施方案中，该神经保护剂是苯丙胺、甲基苯丙胺、哌甲酯、亚甲基二氧基甲基苯丙胺，或其组合。在一个优选的实施方案中，苯丙胺是一种包含苯乙胺的化合物。在某些实施方案中，所述苯乙胺是d-苯丙胺，例如右旋苯丙胺，例如天冬氨酸右旋苯丙胺、硫酸右旋苯丙胺、蔗糖右旋苯丙胺、甲基苯丙胺等等。具体的非限制性例子包括 ADREX、BIPHETAMINE、DESOXYN、DEXEDRINE、FERNDEX、ROBESE, SPANSULE、0XYDESS I1、DEXTR0STAT。
[0028]在一个实施方案中，该药剂是在包含药学可接受的载体的药物组合物中施用的。根据病症和复发的可能性，该药物组合物可以是立即或延长释放制剂。该组合物还可以包含其他药学活性的化合物包括，例如至少一种选自下列物质的其他药剂:单胺神经递质、MAOI或TCA。其他药剂也可以包括单胺神经递质，优选自:多巴胺、去甲肾上腺素或5-羟色胺，更优选去甲肾上腺素。[0029]本领域技术人员将会认识到很多可以用于制备包含该神经保护剂的无毒性的药学可接受的组合物的合成方法。
[0030]药物组合物可以制备成各个的剂型。因此，本发明的药物组合物和剂型包含本文所述的活性成分。词语“药剂”或“神经保护剂”表示本文所述的本发明的化合物或其盐。本发明的药物组合物和剂型还可以包含药学可接受的载体。
[0031]在一个实施方案中，术语“药学可接受的”是指联邦政府或州政府的管理机构认可的或在美国药典或其他一般公认的药典中列出可以用于动物，更特别地用于人的。术语“载体”是指与活性成分施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这些药物载体可以是液体，例如水和油，包括来自石油、动物、植物或合成来源的那些,例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。药物载体可以是盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体硅、尿素等等。此外，可以使用其他赋形剂。
[0032]本发明的单个单位剂型适合口服、粘膜(例如，鼻、舌下、阴道、颊或直肠)、胃肠外(例如，皮下、静脉内、快速注射、肌内或动脉内)或经皮施用于患者。剂型的例子包括但不限于:片剂；锭；胶囊，例如软弹性明胶胶囊；扁胶囊；含片；锭剂；分散剂；栓剂；软膏；泥敷剂(糊药)；糊剂；粉末剂；敷料；乳膏；膏药；溶液；贴剂；气雾剂(例如，鼻腔喷雾剂或吸入剂)；凝胶剂；适合口服或通过粘膜施用于患者的液体剂型，包括混悬剂(例如，水性或非水性液体混悬剂，水包油型乳剂或油包水型液体乳剂)、溶液和酏剂；适合胃肠外施用于患者的液体剂型；和无菌固体(例如，晶体或无定形固体)，其可以重新溶解以提供适合胃肠外施用于患者的液体剂型。该药剂优选是经胃肠外或口服途径施用的，但是也可以关注在本文中详细讨论的其他途径,这主要取决于缺血的情况。
[0033]本发明的组合物、形状和剂型的类型典型地根据它们的给药途径和要治疗的动物而不同。例如，胃肠外的剂型可以包含比用于治疗相同疾病的口服剂型的量更少的一种或多种其含的活性成分。本发明所包括的具体剂型的这些和其他方法可以是互不相同的，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。参见,例如Remington’s PharmaceuticalSciences,18th ed., Mack Publishing, Easton Pa.(1990)。
[0034]典型的药物组合物和剂型包含一种或多种赋形剂。适当的赋形剂是制药领域的技术人员公知的，本文提供了适当的赋形剂的非限制性的例子。具体的赋形剂是否适合掺入到药物组合物或剂型中将取决于本领域公知的各种因素，包括但不限于，该剂型施用于患者的途径。例如，口服剂型例如片剂可以包含不适合用于胃肠外剂型的赋形剂。具体赋形剂适合与否也取决于该剂型中的具体活性成分。例如，一些赋形剂例如乳糖或暴露于水可以加速一些活性成分的分解。
[0035]本发明还包括包含一种或多种降低活性成分分解速率的化合物的药物组合物和剂型。这些化合物在本文中称作“稳定剂”，包括但不限于，抗氧化剂例如抗坏血酸、PH缓冲剂或盐缓冲剂。
[0036]对于具体的病症或治疗方法，可以用已知的方法通过经验确定剂量，剂量取决于下列因素:例如所使用的具体化合物的生物活性、施用方法、宿主的年龄、健康和体重；症状的性质和程度；治疗的频率；其他治疗物的施用和所需的效果。下文描述了各种可能的施用剂量和方法，应当理解，下文仅仅是意欲解释说明。本领域技术人员可以确定施用或递送的实际剂量和方法。例如，当施用于人的神经保护剂是甲基苯丙胺时，单位剂量通常小于5mg/kg。大剂量一般是有毒的，通常不应当使用。
[0037]根据所使用的化合物和是否使用延长释放制剂，给药的频率也可以不同。但是，对于大多数疾病的治疗，优选单剂量。
[0038]口服剂型
[0039]适合口服的本发明的药物组合物可以是作为分离的剂型存在，例如但不限于，片剂(例如，咀嚼片)、锭、胶囊和液体(例如，芳香糖浆)。这些剂型包含预定量的活性成分，可以通过本领域技术人员公知的制药方法来制备。通常参见Remington’s PharmaceuticalSciences,18th ed., Mack Publishing, Easton Pa.(1990).[0040]通过将根据常规药物混合技术将直接混合物中的活性成分与至少一种赋形剂组合制备本发明的典型的口服剂型。根据施用所需的制备的形式，赋形剂可以采取范围广泛的形式。例如，适合在口服液体或气雾剂型中使用的赋形剂包括但不限于，水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂和着色剂。适合用在固体口服剂型(例如，粉末剂、片剂、胶囊和锭)中的赋形剂的例子包括但不限于，淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。
[0041]由于它们易于施用，片剂和胶囊代表了最有利的口服单位剂型，在这种情况中，使用固体赋形剂。如果需要，可以通过标准的水性或非水性技术来给片剂包衣。这些剂型可通过任何药剂学方法制备。一般地，制备药物组合物和剂型，通过将活性成分与液体载体、精细分离的固体载体或两者均匀和直接混合，然后如果需要将该产品塑形成需要的形状。
[0042]例如，可以通过压片或模压来制备片剂。制备压制片剂，通过在适当的机器中将自由流动形式例如粉末或颗粒的活性成分，任选与赋形剂混合，压片。制备模压片，通过在适当的机器中，模压用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物。
[0043]可以在本发明的口服剂型中使用的赋形剂的例子包括但不限于，粘合剂、填充剂、崩解剂和润滑剂。适合在药物组合物和剂型中使用的粘合剂包括但不限于，玉米淀粉、马铃薯淀粉或其他淀粉、明胶、`天然和合成胶例如阿拉伯胶、海藻酸钠、海藻酸、其他海藻酸盐、粉末状的西黄蓍胶、瓜尔胶、纤维素及其衍生物(例如，乙基纤维素、醋酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预胶凝淀粉、羟丙基甲基纤维素(例如，Nos.2208，2906，2910)、微晶纤维素及其混合物。
[0044]微晶纤维素的适当形式包括但不限于，以AVICEL-PH-101，AVICEL-PH-10 3AVICELRC-581, AVICEL-PH-105 (可购自 FMC Corporation, American Viscose Division, AvicelSales,Marcus Hook,Pa.)出售的物质及其混合物。一种具体的粘合剂是以AVICEL RC-581出售的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠的混合物。适当的无水或低湿度赋形剂或添加剂包括AVICEL-PH-103 和淀粉 1500LM。
[0045]适合在本文所述的药物组合物和剂型中使用的填充剂的例子包括但不限于，滑石、碳酸钙(例如，颗粒或粉末)、微晶纤维素、粉末状纤维素、葡聚糖、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨糖醇、淀粉、预胶凝淀粉及其混合物。本发明的药物组合物中粘合剂或填充剂典型地占该药物组合物或剂型的约50到约99重量％。
[0046]在本发明的组合物中使用崩解剂，提供了当暴露在水性环境中时崩解的片剂。包含太多崩解剂的片剂可以在贮存时崩解，而包含太少的话则不能以所期望的速率或在期望的条件下崩解。因此，既不太多也不太少而不利地改变活性成分的释放的足够量的崩解剂应当用于本发明的固体口服剂型。基于制剂的类型，所使用的崩解剂的量可以不同，并且是本领域技术人员很容易辨别的。典型的药物组合物包含约0.5到约15重量％的崩解剂，优选约I到约5%的崩解剂。
[0047]可以在本发明的药物组合物和剂型中使用的崩解剂包括但不限于，琼脂、海藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、聚克立林钾、淀粉羟乙酸钠、马铃薯或木薯淀粉、其他淀粉、预胶凝淀粉、其他淀粉、粘土、其他藻胶、其他纤维素、胶及其组合物。
[0048]可以在本发明的药物组合物和剂型中使用的润滑剂包括但不限于，硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨糖醇、甘露醇、聚乙二醇、其他二醇、硬脂酸、月桂硫酸钠、滑石、氢化植物油(例如，花生油、棉子油、向日葵油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂及其混合物。其他的润滑剂包括例如syloid硅胶(AER0SIL200,由ff.R.Grace C0.0f Baltimore, Md.制造)、合成娃的凝固气溶胶(由Degussa C0.0f Piano, Tex.出售)、CAB-O-SIL(由 Cabot C0.0f Boston, Mass.出售的致热的二氧化硅产品)及其混合物。如果使用，润滑剂的使用量典型地占它们所掺入的药物组合物或剂型的约I重量％以下。
[0049]本发明的优选固体口服剂型包含活性成分、无水乳糖、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸、无水胶体硅和明胶。
[0050]胃肠外剂型
[0051]可以通过各种途径将胃肠外剂型施用于患者，包括但不限于，皮下、静脉内、快速注射、肌内和动脉内。由于它们的施用典型地会绕过患者对污染物的天然屏障，因此胃肠外剂型优选是无菌的或在施用于患者前能够灭菌。胃肠外剂型的例子包括但不限于，注射用溶液、要溶解或悬浮在药学可接受的注射用载体中的干燥产品、注射用混悬液和乳剂。
[0052]可以用于提供本发 明的胃肠外剂型的适当载体是本领域技术人员公知的。例子包括但不限于:注射用水USP ;水性载体，例如但不限于，氯化钠注射液、林格注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液和乳酸林格注射液；与水可混溶的载体，例如但不限于，乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水性载体，例如但不限于，玉米油、棉子油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、豆蘧酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
[0053]现在将通过下列非限制性的实施例来解释说明本发明。应当理解，上文描述的是本发明的优选实施方案，可以对其进行改变而不脱离如权利要求所述的本发明的精神或范围。
实施例
[0054]以前并没有研究过暂时性脑缺血性损伤后苯丙胺的神经保护效力。在本研究中，用暂时性脑缺血的体外和体内模型来评价甲基苯丙胺(MA)。对于体外模型，在缺氧缺糖下激发大鼠海马切片培养物。在第二个系列的实验中，使用5-分钟的2-V0闭塞沙鼠模型和行为试验的组合来研究MA的体内神经保护效力。在该研究期间，令人惊奇地发现和证明了，在暂时性脑缺血后16小时内施用MA确实是具有神经保护作用的，减轻了神经元细胞损害，包括死亡。
[0055]材料和方法[0056]1.1 动物
[0057]所有的实验动物操作都是经University Institutional Animal Care and UseCommittee认可的。将28只重60_80gm的成年雄性蒙古沙鼠(长爪沙鼠)用于体内实验。将这些动物分别置于光亮-(12小时亮/暗循环)和温度_(23°C )可控的环境中。随意提供商业销售的啮齿动物用弹丸剂和水。
[0058]1.2体外海马切片的研究
[0059]将出生后第7天(P7)的新生大鼠(斯普拉-道来)断头，在无菌条件下切出海马。在McI Iwain组织切块机上将海马切片，在37 °C和5%C02下，将各切片在6-孔板的Millicell渗透膜(0.44 11的孔径)上培养6天。在头两天，将切片保持在每24小时更换的初级板培养基(50%DMEM⑴葡萄糖，25%HBSS(+)葡萄糖，25%热灭活的马血清，5mg/ml ,P-葡萄糖(Sigma), ImM Glutamax, 1.5%PenStrep/ 两性霉素 B(Gibco)，和补充有抗氧化剂的5mL的50X B27 (Gibco))中。在第4天，将切片置于无血清的神经基础培养基(IOmLNeurobasal-A, 200 μ L of50X B27 补充剂，100 μ L 的 IOOX 两性霉素 B 和 100 μ L 的 100ΧGlutamax)中，该培养基每48小时更换。在实验前24小时，将插入物置于无血清的神经基础培养基和不含抗氧化剂的Β27补充剂中。在缺氧缺糖(OGD)前，在5%C02和IOL/小时的氮气下注入无葡萄糖的平衡盐溶液(BSS) (120mM NACl,5mM KCl，1.25mM NaH2PO4, 2mM MgSO4,2mM CaCl2, 25mM NaHCO3, 20mM HEPES，25mM蔗糖，pH7.3) I小时。然后将插入物转移到去氧的BSS中，并置于具有氧反馈传感器的37ο槽(Ρι?-Οχ)中，其中该传感器维持气体水平为
0.1%02，5%C02，94.4%氮气90m。在OGD后，立即将切片转移回预热的神经基础培养基中，并每次实验记录分析。
[0060]1.3暂时性脑缺血
[0061]用异氟烧麻醉沙鼠，并在手术期间用恒温毪(Harvard Apparatus, South Natick,USA)将其核心体温维持在37-38°C。在颈部制作中线切口，分离总的颈动脉，用85-gm压力动脉瘤夹阻断5分钟(ISCH ；n=14)。将第2组的沙鼠(SHAM ；n=14)进行相同的操作，除了不夹颈动脉。缝合切口，在再灌注2分钟内动物接受MA(5mg/kg ;1.P)或等体积的载体(盐水；0mg)。将动物置于加热的笼中，观察30分钟。将泰诺林(8mg/ml)加入到饮用水中以提供手术后的止痛。
[0062]1.4行为试验和组织学评价
[0063]在手术后将各沙鼠在开放场装置中测定48小时，该开放场是由77cm X77cm的金属屏蔽板构成的，壁高15cm。将动物置于中心区，让其暴露在新环境中5分钟，用自动跟踪系统(ANY-maze, Stoelting, IL)收集行为数据(游走的距离，速度)，并用ANOVA和适当的事后比较检验分别评价(P〈0.05认为是显著的)。在手术后21天，用CO2处死沙鼠，用磷酸盐缓冲盐水，然后用4%多聚甲醛灌注。不评价用MA处理的假手术沙鼠(SHAM+Omg)的组织，这是因为急性施用MA预计不会对该组的海马有组织学改变。移出脑，固定至少48小时，然后通过海马区收集40 μ m的振动切片。将切片置于载玻片上，用甲酚紫染色。用其他文章(Babcock等人，1993)所述的4点等级量表，在没有处理条件的知识下通过两个独立的观测者来评价对海马CAl区的损害。将各动物评价为得分O (正常神经元体的4-5个致密层)，
I(存在一些变异神经元的4-5个致密层)，2 (细胞间具有“虚空间”和/或神经胶质细胞的备用神经元体)，3(完全不存在或仅存在稀少的正常神经元体，CAl子域有强烈的神经胶质增生)。将等级平均并用非参数统计(Kruskal-Wallis和Mann-Whitney U检验；P〈0.05认为是显著的)评价。
[0064]结果
[0065]2.1体外海马切片的研究
[0066]暴露在缺氧缺糖(CO)下90分钟并用甲基苯丙胺(MA)处理的大鼠海马切片显示了碘化丙啶(PI)吸收水平的显著(p=〈0.01)降低，表明，与仅O⑶的切片相比减少了神经元死亡(附图1)。在MA的剂量效应研究中，我们观察到，250 μ M MA是最佳的剂量，随着浓度在这个量上的增加或减少，PI吸收会增加。但是，在所有试验的浓度(125 μ Μ，250 μ Μ, 500 μ Μ, ImM)下，我们都观察到了，与仅OGD的切片相比，具有显著的神经保护作用(ρ=〈0.01)。
[0067]为了进一步说明MA的效果，我们在OGD后的各个时间点加入了 250 μ Μ，发现当在OGD后最长达16小时施用时，MA显著(ρ=〈0.05)减少了神经元死亡。在OGD后24小时加入MA也减少了神经元死亡，但是与OGD并没有显著性差异。
[0068]2.2暂时性脑缺血的研究
[0069]在异氟烷终止后10分钟内，沙鼠显示出了协调的运动。用MA治疗的动物的毛竖起，它们的尾部朝上。在手术后48小时，在开放场装置中测定动物。发生缺血性损伤且没有进行MA治疗的沙鼠游走了 129.4m(±20 ;SEM)，而用或不用药物治疗的假手术对照组分别游走了 72.7m(±6)和73.2m(±7.5)。在手术后用MA治疗的缺血大鼠游走了 66.3m±5.6。活动数据的分析表明，药物治疗和手术条件之间具有显著的相互作用(P〈0.05)。随后的计划比较表明，在无MA治疗时缺血的沙鼠与无药物的假手术组相比有显著更多的活动(P〈0.05)。用MA治疗的缺血和假手术沙鼠没有显著性差异(P>0.05)。最后，用MA治疗不会相对于对照组情况显著改变活`动水平(SHAM+Omg vs.SHAM+5mg ；P>0.05)。速度数据(游走的距离/时间)的分析表明了类似的式样，用盐水治疗的缺血沙鼠(ISCH)显示了比所有其他实验组显著地最快的速度(数据未显示)。
[0070]所评价组的组织学得分和代表性显微照片分别如附图3和4所示。ISCH+Omg条件下的沙鼠显示了对海马CAl区的广泛损害。该组中6只沙鼠中的4只完全不存在正常的神经元体，在CAl子域有强烈的神经胶质增生。相反，在SHAM+Omg组中的所有沙鼠的评级都显示对海马没有可检测的损害(平均等级0+0)。在ISCH+5mg MA组中的6只动物显示了在海马区中正常神经元体的4-5个致密层(组评级.07±.07)。该条件下仅有I只沙鼠显示了对CAl区的可检测的任意损害。等级评量的分析表明了各组之间的显著性差异(P〈0.05)。随后各组数据的评价表明，SHAM+Omg和ISCH+5mg的条件没有显著性差异(P>0.05)，这两种条件与ISCH+Omg组有显著性差异(P〈0.05)。
[0071]讨论
[0072]本研究的结果表明，如果在暂时性缺血损伤后16小时内施用神经保护剂，例如MA，可以减轻或预防对海马中神经元细胞的损害。例如，MA导致了用缺氧缺糖激发的大鼠海马切片培养物的剂量依赖性神经保护应答。250 μ M的剂量显示了最大程度的保护，当在缺氧缺糖后最长达16小时施用时是有效的。在0GD24小时后，施用MA不能显著地减少PI吸收，表明MA的给药必须在OGD后相对短的时间内进行，以激活负责减轻神经元损害和死亡的一种或多种机制。[0073]也用5-分钟的沙鼠2-V0暂时性缺血模型证明了 MA的体内神经保护效力。在再灌注1-2分钟内施用MA预防了海马CAl椎体细胞任何显著的损失。组织学评价表明，用MA治疗的缺血沙鼠显示了对海马CAl区几乎完全性的保护，7只动物中仅有I只显示了海马中任何可检测的神经病理。沙鼠5-分钟的双侧颈动脉闭塞导致活动能力增强，这与海马CAl细胞死亡是相关的(Wang和Corbett 1990 ;Babcock等人，1993)。在本研究中，用MA治疗的缺血大鼠的活动能力与对照水平相当，这是神经保护作用显著的标志。完全可能的是，苯丙胺产生的激醒和活动过度可以与缺血对行为的影响相互作用。但是，在药物已经代谢后(48小时)进行本研究的行为试验。符合该解释的是下列观察:相对于接受盐水(SHAM+Omg)的动物，用MA治疗的对照沙鼠没有活动过度。在体内实验中使用的MA的剂量是来自使用沙鼠作为实验模型的先前的报道(Teuchert-Noodt等人，2000 ；Araki等人，2002)。我们也进行了初级研究，其中发现MA的剂量大于5mg/kg{例如，10和20mg/kg}对于手术后的沙鼠是致命的，但并没有进一步评价。
[0074]苯丙胺与锻炼的结合也已经显示出是从中风中行为恢复的有希望的药理学策略(参见Martinsson and Eksborg, 2004)。我们观察到如果在损伤后特定时间窗内，即16小时内给药，MA能切实预防对海马的可检测的损害，这代表了一种新的发现。值得注意的是，这些发现表明，神经保护作用不依赖于损伤后的任何行为锻炼。可能的是，与现有技术对损害发生后治疗的教导不同的是，MA切实保护和预防对海马的神经损害是影响暂时性脑缺血。与局部缺血或皮质损害的其他类型不同，暂时性脑缺血的特征在于细胞延迟死亡的类型局限于海马椎体细胞。在该模型中暂时性缺血发作后的再灌注是在损伤后3-5天发生的后续的细胞死亡的关键事件。
[0075]当前对在急性中风事件前施用MA的研究表明，MA显著增加了神经元死亡(Wang等人，2001)。但是，根据我们现在的发现，完全可能是:在中风事件前用MA治疗消除了在中风时间后无法释放而残留的多巴胺和去甲肾上腺素的蓄积，随后神经信号的减少可以在MA预治疗和中风中观察到的损害中发挥作用。CNSS，例如，MA在非常短的时间跨度内诱导这些神经递质极其大量地释放的能力可以部分解释在我们的实验中我们所观察到的神经保护效果。目标在于了解CNSS剂 神经保护机制的未来研究可以进一步解释急性缺血事件的确切机制和治疗。
[0076]上述技术性内容描述了减轻由暂时性脑缺氧和/或缺血导致的神经元细胞损害的方法的说明性实施方案，而不是意欲将本发明限制这些精确的实施方案内。此外，对相关领域的普通技术人员显而易见的任何改变和/或变更，包括但不限于对药物盐衍生物或非功能性的改变都意欲包括在本发明的范围内。
[0077]参考文献
[0078]Arakij H.，Yamamoto, T.，Kobayashij Y.，Futagamij K.，Kawasaki, H.，GomitajY.2002.Effect of methamphetamine and imipramine on cerebral ischemia-1nducedhyperactivity in Mongolian gerbils.Japan Journal of Pharmacology88, 293-299.[0079]Babcock, A.M.，Baker, D.A.，Lovacj R.1993.Locomotor activity in theischemic gerbil.Brain Research625, 351-354.[0080]Boyesonj M.G.，Feeney, D.M.1990.1ntraventricuIar noradrenalinefacilitates motor recovery following sensorimotor cortex injury.PharmacologyBiochemistry Behavior35, 497-501.[0081]Boyesonj M.G.，Harmon, R.L.，Jones, J.L.1994.Comparative effects offluoxetine, amitriptyline and serotonin on functional motor recoveryafter sensorimotor cortex injury.American Journal Physical MedicineRehabiIitation73, 76-83.[0082]Culmsee Cj Semkova Lj Krieglstein J.1999.NGF mediates theneuroprotective effect of the beta2_adrenoceptor agonist clenbuteroI invitro and in vivo:evidence from an NGF—antisense study.NeurochemistryInternational35, 47-57.[0083]Dietrich W.D., Alonso 0.，Busto R., Watson B.D., Loor Y., GinsbergM.D.1990.1nfluence of amphetamine treatment on somatosensory function of thenormal and infarcted rat brain.Stroke21, III147-1II150.[0084]Feeney D.M.，Gonzalez A.，Law W.A.1982.Amphetamine, haloperidol, andexperience interact to affect rate of recovery after motor cortex injury.Science217，855-857.[0085]Follesa P., Mocchetti 1.1993.Regulation of basic fibroblastgrowth factor and nerve growth factor mRNA by beta-adrenergic receptoractivation and adrenal steroids in rat central nervous system.MolecularPharmacology43, 132-138.[0086]Gold P.E.，Delanoy R.L., Merrin J.1984.Modulation of long-termpotentiation by peripherally administered amphetamine and epinephrine.BrainResearch305, 103-107.[0087]Hovda D.A.，Feeney D.M.1985.Haloperidol blocks amphetamine induced
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【权利要求】
1.甲基苯丙胺在制备在患者中通过下述方法减少由暂时性脑缺氧和/或缺血病症导致的脑神经元细胞死亡发生的药物中的用途，该方法包括下列步骤:诊断患暂时性脑缺氧和/或缺血病症的患者；和在病症发作后16小时内给该患者施用神经保护量的甲基苯丙胺。
2.权利要求1的用途，其中甲基苯丙胺是以小于5mg/kg的单位剂量施用于患者。
3.权利要求1的用途，其中治疗减少了对海马脑细胞的神经元细胞损害的发生。
4.权利要求1的用途，其中该病症是由低血压、失血、心脏病发作、外伤性脑损害、窒息、手术、中风、缺血性视神经病或气道阻塞导致的。
5.权利要求4的用途，其中该病症是由心脏手术导致的。
6.权利要求4的用途，其中该病症是由外伤性脑损害导致的。
7.权利要求1的用途，其中施用发生在该病症发作后14小时内，并且仅施用单剂量的甲基苯丙胺。
8.权利要求1的用途，其中施用是经快速注射。
9.权利要求1的用途，其中甲基苯丙胺是在药物组合物中，所述药物组合物基本上由甲基苯丙胺和药学可接受的载体组成。
10.权利要求9的用途，其中该药物组合物是延长释放制剂。
11.权利要求1的用途，其中患者是需要这种治疗的人。
12.权利要求11的用途，其中甲基苯丙胺在手术12小时内施用。
13.权利要求11的用途，其中甲基苯丙胺在手术2小时内施用。
14.甲基苯丙胺在制备在患者中通过下述方法减少由暂时性脑缺氧和/或缺血病症导致的脑神经元细胞死亡发生的药物中的用途，所述暂时性脑缺氧和/或缺血病症由外伤性脑损害导致，该方法包括下列步骤:诊断患暂时性脑缺氧和/或缺血病症的患者，和在病症发作后16小时内给该患者施用神经保护量的甲基苯丙胺，所述暂时性脑缺氧和/或缺血病症由外伤性脑损害导致。
15.权利要求14的用途，其中甲基苯丙胺是在药物组合物中，所述药物组合物基本上由甲基苯丙胺和药学可接受的载体组成。
【文档编号】A61K31/137GK103479603SQ201310338192
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2007年8月15日 优先权日:2006年8月23日
【发明者】D·J·鲍尔森, T·F·劳 申请人:蒙大拿大学