一种引发强效cd4+ t细胞免疫反应的新型hiv疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种引发强效CD4+?T细胞免疫反应的新型HIV疫苗，将LC3b的基因与HIV抗原基因融合，进而将该融合基因克隆到疫苗载体中构建出新的疫苗。根据动物实验数据可以预见，相比于其他技术的HIV疫苗，使用本发明中的方法设计的HIV疫苗可以诱发更为强烈的，更为广谱以及更加多功能性的T淋巴细胞，尤其是多功能的CD4+T细胞反应，该方法还可以诱发强烈的B细胞反应。本发明技术可以普遍应用于预防和治疗艾滋病。
【专利说明】—种引发强效CD4+ T细胞免疫反应的新型HIV疫苗
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种疫苗，特别涉及一种引发强效⑶4+ T细胞免疫反应的新型HIV疫苗。
【背景技术】
[0002]自 1984 年发现艾滋病（Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS)至今，30年中，在艾滋病的治疗与预防方面，取得了极大的进步。然后，艾滋病仍然是全球威胁人民健康的最严重的疾病之一。截至2012年底，全球有约3400万的人感染艾滋病，累计死亡人数超过3000万。
[0003]目前为止，还未见有效的HIV疫苗应用于临床。一直以来，HIV诱发的特异性的细胞免疫反应，尤其是CD8+ T细胞免疫反应被认为是主要控制HIV病毒复制。因此，很多HIV疫苗的设计都是基于此点，诱发更强烈的CD8+ T细胞反应以降低病毒载量。然而STE，Phambili，HVTN505等临床试验的失败表明：仅靠诱发强的CD8+ T细胞反应来预防或者控制HIV是远远不够的。在经历了数次的临床失败后，近年来，对于HIV疫苗的⑶4+ T淋巴细胞反应逐渐受到关注，或许诱发强烈，多功能性的CD4+ T淋巴细胞免疫反应是HIV疫苗发展的另一个方向。
[0004]均衡的⑶4+ T细胞和⑶8+ T细胞免疫反应或许可以更好的控制HIV。 STEP,Phambili,HVNT505失败的原因之一很有可能就是基于5型腺病毒（Ad5)载体的HIV疫苗诱发了强的CD8+ T细胞免疫反应而相对弱的CD4+ T细胞反应。在泰国进行的一项HIV疫苗三期临床试验（RV144)有效的预防了 HIV病毒，这是首次在临床水平证实HIV疫苗具有保护性。RV144试验中所诱发的⑶4+ T细胞反应主要是针对于HIV-I env的V2区，而且高水平的针对V1V2区的抗体很有可能能够有效的抑制或抵抗HIV-I病毒的感染。RV144试验表明诱发强的HIV特异性的CD4+ T细胞免疫反应对HIV疫苗的效果的发挥有重要的作用。
[0005]在哺乳动物中，LC3蛋白有3种形式：LC3a，LC3b，LC3c。可合成微管相关蛋白I轻链（microtuble associated protein I light chain 3, MAPlLC3b, LC3b )有 2 种形式，LC3b-I和LC3b-II。LC3-I游离于细胞质中，和磷脂酰乙醇胺（PE)结合，形成LC3b_II。LC3b-II是唯一的已知的可以特异性的定位在自噬体膜上的蛋白。当发生自噬的时候，在胞质中，游离的LC3b-I就会转化为LC3b-II，LC3b-II共价结合与自噬体的膜上，从而形成自噬体完整的膜结构。LC3b-II也是自噬体发生的Marker。有研究报道，将流感蛋白MPl与LC3b融合从而通过自噬途径把MPl递呈至⑶4 T细胞识别，提高⑶4+ T细胞免疫反应。但是，未有文献报导这种递呈作用具有普遍性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种HIV疫苗。
[0007]本发明所采取的技术方案是：
一种HIV疫苗，疫苗含有HIV目的抗原基因与LC3基因的融合基因，HIV目的抗原基因选自HIV gag、env λ pol、nef、vif、tat、vpr、vpx、revD
[0008]作为本发明的进一步改进，LC3基因为LC3b基因。
[0009]作为本发明的进一步改进，疫苗的载体为质粒或病毒。
[0010]作为本发明的进一步改进，疫苗的载体为质粒pVAX载体或腺病毒AD5载体。
[0011 ] 作为本发明的进一步改进，将HIV目的抗原基因与LC3基因融合，使表达出的融合蛋白中，HIV目的抗原与LC3蛋白的N端融合。
[0012]本发明的有益效果是：
动物模型实验数据显示，通过融合LC3b到SIVgag蛋白，可以诱发更加强烈，广谱，多功能性的CD4+ T淋巴细胞反应。并且，这种方法是安全可行的。本发明的疫苗可以普遍用于预防和治疗艾滋病。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图I是携带SIVgag_LC3b的DNA载体和Ad5载体的构建；图IA是携带有的LC3b，SIVgag, SIVgag-LC3b的示意图，图IB是用western-blot方法检测重组pVAX载体蛋白表达水平的检测，分别使用Anti-SIVgag和Anti-LC3b抗体；图IC是用western-blot的方法检测重组腺病毒蛋白水平的检测；
图2是靶向SIVgag到自 噬体的细胞定位图；
图3是靶向SIVgag到溶酶体（图3A)和MIICs的细胞定位图（图3B)；
图4是ELIS0PT检测疫苗诱发的IFN- Y分泌水平；图4A是免疫策略；图4B是DNA疫苗初免后（4周)，ELISP0T检测IFN-Y分泌水平；图4C是腺病毒加强后（6周），ELISP0T检测IFN- Y分泌水平；
图5是多色流式技术（ICS)检测Gag肽刺激CD4+ T细胞分泌细胞因子的结果；图5A是设定阳性细胞阈值的策略图；图5B是DNA疫苗初免后（4周)，ICS检测Gag肽刺激⑶4+T细胞分泌细胞因子的结果；图5C为腺病毒加强（8周)，ICS检测Gag肽刺激⑶4+ T细胞分泌细胞因子的结果；
图6是小鼠免疫6周后，酶联免疫吸附测定法（ELISA)检测SIV特异性抗体分泌水平。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实验，进一步说明本发明。
[0015]下列实验中未提及的具体实验方法，通常按照现有常规实验方法进行。
[0016]鉴于现有技术中缺乏HIV的实验模型，以下实验中，使用SIV实验模型对疫苗的效果进行评价。
[0017]一、疫苗的构建
基因的获得：从NCBI数据库中得到LC3b基因序列，通过全基因合成得到LC3b基因。LC3b的基因序列如SEQ ID N0:1所示，SIVgag的基因序列SEQ ID NO :2所示；携带有SIVgag的pVAX载体以及Ad5-SIVgag重组腺病毒由本实验室保存。
[0018]疫苗的构建
质粒载体外源元件的插入顺序如如图I A所示。SIVgag-LC3b融合基因表达出的融合蛋白中，SIVgag蛋白与LC3蛋白的N端融合。[0019]按照常规的方法将合成的LC3b基因构建到pVAX质粒载体上，即pVAX_LC3b。通过酶切，连接的方法将LC3b和SIVgag共同构建于pVAX载体上，即pVAX_SIVgag-LC3b图IB是用Western-blot方法检测重组pVAX载体蛋白表达水平的检测。pVAX_LC3b，pVAX-SIVgag-LC3b均的到正确表达。SIVgag在融合了 LC3b后，条带上移，表达结果符合预期大小。
[0020]重组腺病毒的构建，扩增，纯化与鉴定
按照常规的重组腺病毒构建方法将LC3b和SIVgag-LC3b构建到腺病毒载体中，其中的腺病毒载体为缺失了 El和E3区域的人五型腺病毒，然后拯救得到携带目的基因的重组腺病毒，少量扩增后进行表达和基因组酶切鉴定，接着在Trex293细胞中大量扩增，并采用氯化铯梯度密度离心进行纯化，对纯化的病毒再次鉴定正确后测定其感染滴度TCID5tl和物理颗粒浓度，然后分装冻存备用（相关方法的具体操作步骤可参见CN101219221A)。图IC是用western-blot方法检测重组腺病毒蛋白表达水平的检测结果图；Ad5_SIVgag可表达p55和p27，而Ad5-SIVgag-LC3b表达的条带大小为71Ka和43Ka，表明融合蛋白表达正确。无论用Anti-SIVgag,还是Anti-LC3b抗体均得到相同的结果。并且与DNA疫苗表达结果一致。
[0021]二、靶向SIVgag到自噬体，溶酶体，MIICs的检测
1.实验材料 1.1细胞
稳定表达GFP-LC3b的Hela细胞系，Hela细胞系，小鼠巨噬细胞RAW264. 7细胞系。
[0022]I. 2 抗体
一抗：Anti-MHCII (品牌 ：Abcam ；货号：ab64528), Anti-LAMPII (品牌：Abcam ；货号：ab37024)，Anti-SIVgag (美国国立健康研究所艾滋病研究和参考试剂项目（NIH AIDSResearch & Reference Reagent Program)提供X
[0023]二抗：Alexa Fluro 488标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(品牌：碧云天；货号：A0428),Cy3_标记山羊抗小鼠IgG (H+L)(品牌：碧云天；货号：A0521), Alexa Fluro 488标记山羊抗兔IgG (H+L)(品牌：碧云天；货号：A0423)，Cy3_标记山羊抗大鼠IgG (H+L)(品牌：碧云天?’货号:A0507)。
[0024]其他：DAPI (品牌：碧云天；货号：C1002)。
[0025]实验操作
2.I实验步骤
1)用4% 多聚甲醒（Paraformaldehyde)固定细胞 IOmin ；
2)弃固定液O.2%吐温20 (TWEEN-20)透膜IOmin ；
3)弃透膜液，PBS洗3遍,每遍5min；
4)1%牛血清白蛋白封闭Ih ；
5)弃封闭液，一抗体孵育2h；
6)弃一抗，PBS洗3遍,每遍5min；
7)相应二抗孵育Ih；
8)弃二抗，PBS洗3遍,每遍5min；
9)DAPI 染核 3min ；
10)镜下观察。[0026]2. 2检测系统
使用激光共聚焦显微镜（LEICA DMI6000B)观察细胞。[0027]实验结果
在载体构建正确后，在细胞水平检测SIVgag是否被LC3b靶向到自噬体，并最终被MHCII递呈至⑶4+ T细胞识别。
[0028]3. I靶向SIVgag到自噬体
转染 pVAX-SIVgag，pVAX-SIVgag-LC3b 到稳定表达 GFP_LC3b 的 Hela 细胞系。转染 36h后，加入氯喹（CQ)，并设不加CQ组做对照。转染48h后，将细胞如上述实验步骤处理，在激光共聚焦显微镜下观察。如图2所不,在融合了 LC3b后，SIVgag在胞质中聚集成点，并且可与GFP-LC3b共定位，说明LC3b靶向SIVgag到自噬体。而SIVgag在胞质中是弥散的分布的，不能聚集成点，无法与GFP-LC3b共定位。
[0029]3. 2靶向SIVgag到溶酶体和MIICs
转染pVAX-SIVgag，pVAX-SIVgag-LC3b到Hela细胞，具体操作如上述实验步骤。如图3A所示，融合蛋白可以成点并与LAMPII共定位，证明SIVgag在溶酶体/自噬溶酶体中存在。而SIVgag不可成点，弥散的分布于细胞质中，也无法与LAMPII共定位。
[0030]鼠巨噬细胞RAW264. 7 感染 Ad5_SIVgag，Ad5_SIVgag-LC3b 腺病毒，感染 36h 后加入氯喹（CQ)，并设不加CQ组做对照。剩余步骤如上述实验步骤。如图3B所示，融合蛋白可以成点并与MHCII共定位，表明SIVgag被运送至MIICs中。而SIVgag弥散与细胞质中，无法与MHCII定位。
[0031]三、疫苗在小鼠模型中的免疫原性
在证实LC3b能够靶向SIVgag到自噬体，并通过自噬这条途径将SIVgag最终有效的递呈至⑶4+ T淋巴细胞后。进一步研究融合了 LC3b的SIVgag是否能够在机体内发挥作用而有效的提高⑶4+ T淋巴细胞反应。
[0032]1.实验材料
I.I流式抗体
所用单克隆抗体，抗鼠 anti-CD3-PerCP, anti_CD4_FITC and anti_CD8_APC (BDBiosciences) anti-IFN-y-PE, anti-TNF-a-PE_cy7, anti-IL-2-APC-cy7 (BDPharmingen)购自 BD 公司。
[0033]I. 2 SIVgag 抗原多肽
SIVgag多肽由美国国立健康研究所艾滋病研究和参考试剂项目（NIH AIDS Research& Reference Reagent Program)提供,大部分肽由15个氨基酸组成,两两之间有11个氨基酸重叠，纯度>80%。用二甲基亚砜（DMSO)溶解配制成O. 4mg/ml/肽的储存液，分装后-70°C保存。
[0034]I. 3其他试剂
ELISP0T板（品牌=Millipore ;货号：MSIPS4510)购自达科为生物科技有限公司，SIVgag蛋白购自苏州杰恩生物技术有限公司，TMB/E底物(货号：ES001)购自美国Chemicon公司。BCIP/NBT底物（品牌=Pierce ;货号：34042)购自广州吉泰生物科技有限公司。链霉素偶联的碱性磷酸酶（品牌：BD PharMingen，货号：554065)购自基因有限公司。
[0035]2、实验方法2. 1实验动物和免疫策略
每组8只6-8龄雌性C57BL/6小鼠。DNA疫苗免疫剂量为50 u g/100 u L/只；腺病毒 疫苗免疫剂量为IX 109vp/只/100ML，分别在小鼠两侧的股四头肌各注射50ML。共免疫4 次，间隔2周。免疫策略如图4A所示。免疫2次DNA疫苗后（即4周)，每组随机取4只，处 死，进行免疫检测。剩余4只继续注射腺病毒疫苗。
[0036]2.2多色流式技术检测多功能T细胞
1)分离好的PBMC细胞计数后调整至2X106/ml，加入到96孔培养板，每孔200 u L ;培 养基为R10 ；
2)在上述细胞悬液中加入特异性抗原肽，阴性对照孔加入相应浓度的DMS0，阳性对照 加入佛波酯（PMA) (20ng/ml) +离子霉素（1000ng/ml)；
3)37 V，5% C02 培养 l-2h ；
4)加入布雷菲德菌素（BFA)(10ug/ml)混匀；
5)37 V，5% C02 培养 16h ；
6)吹打均匀细胞，转移至流式管中（12X75mm聚苯乙烯管）;加入1ml流式洗液；混匀 后300g室温尚心10分钟；
7)弃上清；分别加入细胞表明标记抗体，如anti-Q)3-PerCP，anti-Q)4-FITCand anti-CD8-APC，振荡 2 — 3 秒;
8)室温避光放置25- 30分钟；
9)加入3mlFACS洗液；混匀后300g室温离心10分钟；
10)重复洗涤一次；
11)振荡均勻细胞，然后加入250M1细胞固定/通透液（cytofix/cytoperm,品牌：BD； 货号：554722)，混匀；
12)4°C，避光反应20min ；
13)加入lml1 X细胞通透/洗漆液（perm/wash,品牌：BD Biosciences ;货号： 554723 ;产品为10倍，用之前用无菌蒸馏水稀释至1倍)，400g，离心8min ;弃上清；
14)重复一次；
15)弃上清，加入anti-IFN-y-PE, anti-TNF-a-PE_cy7，anti-IL-2-APC_cy7 (各 101^抗体)，混勻；
16)4°C避光30 — 60分钟；
17)加入lmlIX细胞通透/洗漆液（perm/wash), 400g,离心8min ;
18)弃上清，加入lml流式洗液；混匀后400g室温离心10分钟；
19)吸走大部分上清，约留300yl ;振荡混匀后上机；
20)在FACSAria流式细胞仪上检测，用CellQuest软件获取数据，然后用Modfit软 件分析。
[0037]2.3 IFN-y酶联免疫斑点技术
第一天：
取一管包被抗体(抗鼠IFN- y抗体对其中包含有这个抗体，品牌：BD，PharMingen ;克 隆号为R4-6A2)用无菌PBS (pH7. 2-7. 4) 1:100稀释，100 u 1/孔加入到96孔PVDF膜板， 4 °C包被过夜。[0038]第二天：
O甩去液体，用无菌PBS洗涤3次，每孔加入200 μ I RlO完全培养基，37°C封闭2小
时；
2)封闭期间分离PBMC;采用95%稀释的淋巴细胞分离液(商品名为opti-pr印）分离淋巴细胞；
3)弃去封闭液，每孔加入ΙΟΟμΙPBMC ；
4)实验中设阳性对照组（ConA组)，特异肽，空白对照（DMSO);在37°C5%C02培养箱中
孵育；
第三天：
5)24h后，弃去细胞悬液，用无菌PBST 220 μ I/well洗涤6次；
6)甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干；
7)用含5%FBS的PBST按1:400稀释检测抗体(生物素标记的抗鼠IFN-Y抗体)，100 μ l/well，4°C过夜；
第四天：
8)用无菌PBST220 μ I/孔洗涤4次；
9)甩去洗液，在无菌干燥纸`上扣干；
10)配置链霉素偶联的碱性磷酸酶：用含5%FBS的PBST按1:2500稀释链霉素偶联的碱性磷酸酶，100 μ I/孔，37°C，2小时；
11)处理BCIP/NBT 底物（Pierce, Cat :34042)，37°C温浴 30min ；
12)用无菌PBST220 μ I/孔洗涤5次，甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干；
13)加入BCIP/NBT底物，100μ I/孔，避光反应7min ；
14)弃去底物，用水洗涤2次。风干读板。
[0039]2. 4 ELISA检测SIVgag特异性结合抗体 O用SIVgag蛋白包板,浓度为I μ g/ml,过夜；
2)弃包被蛋白，PBST洗3遍，每次5min;
3)4%的脱脂奶粉封闭Ih ；
4)4%的脱脂奶粉2倍比稀释待检测的小鼠血清，每孔100μ L，37°C，2小时；
5)弃血清，PBST洗3遍,每次5min；
6)辣根过氧化物标记山羊抗小鼠I:5000稀释，每孔100yL，37°C，l小时；
7)弃上清，PBST洗3遍,每次5min；
8)加入TMB/E显色，每孔100μ L，室温避光IOmin ；
9)加入lmol/L硫酸终止反应；
10)读板：使用Synergy? HT Multi-Mode Plate Reader (BioTek Instruments, Inc.,Vermont, USA)在450nm吸光值下读板。
[0040]3.实验结果
3.I SIVgag-LC3b融合蛋白可以诱发更强的抗原特异性的细胞免疫反应比较了 SIVgag和SIVgag-LC3b在小鼠体内的免疫源性，ELISP0T检测IFN- Y的分泌情况。如图4B所示，在DNA疫苗初后，即免疫4周以后，免疫SIVgag-LC3b组诱发的更强的免疫反应，与免疫SIVgag组比较，产生的斑点是其2. 5倍（59/23)，差异极显著（p=0. 0006)。在用腺病毒加强免疫后，即免疫6周以后，针对SIVgag特异性的免疫应答显著增强，免疫SIVgag-LC3b组平均产生749个斑点（百万个PBMC细胞)，而免疫SIVgag组平均产生420个斑点，差异极显著（P=0.0019)。无论是单独使用DNA疫苗免疫还是在腺病毒疫苗加强后，免疫SIVgag-LC3b组都要比免疫SIVgag组免疫反应高出I倍左右。
[0041]融合蛋白诱发更强更多功能性的CD4+ T淋巴细胞免疫反应
ELISP0T检测的是总IFN-Y的量，进一步检测⑶4+ T，⑶8+ T细胞抗原特异性的免疫反应。图5B是只免疫DNA疫苗所诱发的⑶4+ T细胞反应，免疫SIVgag-LC3b组⑶4+ T分泌IFN- Y，TNF- a，IL-2的细胞远远高于免疫SIVgag组，约为2-3倍左右；分泌细胞因子IFN- Y / TNF- a，IFN- y / IL-2，IFN- y / TNF- a / IL-2 的多功能性 CD4+ T 细胞的也均高于SIVgag组，多功能性⑶4+ T细胞的增多对于HIV疫苗来说是非常重要的。在两次腺病毒加强免疫反应后，如图5C所示，这种差距进一步被拉大，免疫SIVgag-LC3b组⑶4+ T细胞分泌的IFN-Y，TNF-a，IL-2比免疫SIVgag组增强了将近10倍左右。更为有意义的是，多功能性CD4+ T细胞，尤其是同时分泌3种细胞因子的多功能CD4+ T细胞增多非常明显。从图OT，5E可以看出，无论是单独注射DNA疫苗，还是腺病毒疫苗加强，免疫SIVgag-LC3b组分泌单细胞因子的⑶4+ T细胞以及多功能性⑶4+ T都更为均衡。
[0042]融合蛋白可以诱发出更强的SIVgag特异的结合抗体
由于单独的DNA疫苗所诱发的免疫方面整体是比较弱的，因此只检测了第一次腺病毒加强后的小鼠血清中的抗体水平。如图6所示，免疫SIVgag-LC3b组，SIVgag特异性的结合抗体显著（ρ=0· 01)高于免疫SIVgag组。
[0043]根据上述实验结果,可以预见，当使用HIV目的抗原基因，如HIV gag、env、pol、nef、vif、tat、vpr、vpx、rev,特别是同源性最高的HIV gag替换SIV gag基因时,制备得到的HIV疫苗可以表达出HIVgag-LC3b融合蛋白，进而诱发更强的抗原特异性的细胞免疫反应，更强更多功能性的CD4+ T淋巴细胞免疫反应。
【权利要求】
1.一种Hiv疫苗，其特征在于：所述疫苗含有HIV目的抗原基因与LC3基因的融合基因，HIV 目的抗原基因选自 HIV gag、env、pol、nef、vif、tat、vpr、vpx、rev。
2.根据权利要求1所述的一种HIV疫苗，其特征在于：LC3基因为LC3b基因。
3.根据权利要求1或2所述的一种HIV疫苗，其特征在于：疫苗的载体为质粒或病毒。
4.根据权利要求3所述的一种HIV疫苗，其特征在于：疫苗的载体为质粒pVAX载体或腺病毒AD5载体。
5.根据权利要求1或2所述的一 种HIV疫苗，其特征在于^fHIV目的抗原基因与LC3基因融合，使表达出的融合蛋白中，HIV目的抗原与LC3蛋白的N端融合。
【文档编号】A61K39/21GK103480003SQ201310419864
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】孙彩军, 陈凌, 靳怡 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院