金荞麦提取物在制备治疗阿尔茨海默症药物中的用途
【专利摘要】本发明涉及金荞麦提取物在制备治疗阿尔茨海默症药物中的用途，本发明还涉及了一种用于预防或治疗阿尔茨海默症的药物组合物以及一种用于预防或治疗阿尔茨海默症的功能性保健食品。本发明技术方案提供了一种金荞麦提取物的新用途，可用于制备治疗阿尔茨海默症的药物或功能性保健食品，开拓了金荞麦提取物的应用领域。金荞麦提取物为天然产物，安全、无毒，可以有效地用来制备用于预防、延缓和治疗阿尔茨海默症的药物组合物和功能性保健食品。
【专利说明】金荞麦提取物在制备治疗阿尔茨海默症药物中的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及天然药物化学领域，具体涉及一种金荞麦提取物的新用途以及含有金荞麦提取物的药物组合物和功能性保健食品。
【背景技术】
[0002]阿尔茨海默症(AD)是一种进行性的致命的神经退行性疾病，它的流行与世界人口的老龄化成正比。《2009世界阿尔茨海默症报告》中说，到2050年全球将有1.15亿人受到这种疾病的困扰(Martin Prince, Jim Jackson等,2009)。AD的主要病理标志是淀粉样神经炎斑块蛋白沉积(Melanie Meyer-Luehmann, Tara L等,2007),形成神经纤维缠结,反应性小胶质细胞和星型胶质细胞增生，长期激活的小胶质细胞释放趋化因子和受损的细胞因子，如IL-1、IL-6和TNF-α导致炎症级联反应，这些炎症因子反过来又加强了 Aβ的释放(Mehlhorn 等，1999)。炎症可导致神经元死亡(L.E.Rojo, J.A.Fernandez 等，2008),或引发神经退行性疾病(P.D.Drew, P.D.Store等,2005)。根据淀粉样蛋白的假说,A β在大脑中的沉积是促使AD发病的主要原因(Hardy及Selkoe，2002)。神经炎可能对AD的发展和长期性有显著作用(Heneka及0’Ban1n，2007)。因此，清除大脑中的Αβ沉积和抗炎代表了一种重要的防治该病的策略(Wang J, Ho L, Zhao Z, Seror, Humala N, Dickstein DL, ThiyagarajanΜ, Percival SS,Talcott ST, Pasinetti GM(2006a)Moderate consumpt1n of CabernetSauvignon attenuate Abeta neuropathology in a mouse model of Alzheimer’ sdisease.FASE BJ20:2313 - 2320)。
[0003]目前临床上用于治疗AD的药物有乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂(如加兰他敏)，钙拮抗剂，改善脑血液循环和脑细胞代谢的药物(如脑复康)，激素类药物(如雌激素)，非甾体抗炎药物(如布洛芬和阿司匹林)，抗氧化剂(如维生素E)，毒蕈碱受体激动剂(占诺美林)等。这些药物通过不同途径缓解早期病人的认知障碍，适度改善症状，但还不能有效地逆转AD脑内老年斑沉积和神经元纤维缠结等病理改变以阻止病情进展。
[0004]金养麦(Fagopyrumdibotrys (D.Don)Hara)属于寥科(Polygonaceae)养麦属(Fagopyrum)的双子叶植物,根据文献记载,金养麦药材以根莖入药。据明代兰茂所著《滇南本草》所载，金荞麦“治五淋、(赤)白浊，杨梅结毒、丹流等症”，《本草拾遗》、《李氏草秘》、《纲目拾遗》中也均有“性寒、味酸苦，清热，解毒，祛风利湿”的记载。它是云南及我国南方常用的一种中草药。近年研究发现，金荞麦具有癌化学预防及抗癌活性，是一种很有前景的抗肿瘤中药。
[0005]金荞麦的化学抗肿瘤活性成分原花色素缩合性单宁混合物，总单宁含量为67.49%,称为原矢车菊素(procyanidin) B_2、B-4及原矢车菊素B-2的3，3’ - 二没食子酸酉旨(3,3，-digalloylrocyanidin B—2)。
[0006]金荞麦根为我国药典收载品种(刘慧，刘月红，安根炬等，金荞麦活性成分的研究，辽宁医药2004，19，(4)35?37)，我国已批准其提取物的片剂和胶囊剂(肖培根主编，金荞麦，新编中药志第一卷，化学工业出版社，北京:607?610)为治疗药物。
【发明内容】
[0007]为进一步寻找金荞麦提取物更多的应用领域，本发明的目的是提供金荞麦提取物在制备治疗阿尔茨海默症药物中的用途。
[0008]其中，所述金荞麦提取物为金荞麦的乙醇提取物、甲醇提取物、正己醇提取物、丙醇提取物或热水提取物。
[0009]优选地，所述金荞麦提取物为金荞麦的乙醇提取物。
[0010]其中，所述金荞麦提取物的制备过程为:向金荞麦中加入I?10倍重量的体积百分比浓度为20?90%的乙醇溶液或甲醇溶液或正己醇溶液或丙醇溶液，回流后浓缩即得。
[0011]本发明的另一目的是提供一种用于预防或治疗阿尔茨海默症的药物组合物，其包括金荞麦提取物以及药学上可接受的辅料。
[0012]其中，所述金荞麦提取物为金荞麦的乙醇提取物。
[0013]其中，所述金荞麦提取物的制备过程为:向金荞麦中加入I?10倍重量的体积百分比浓度为20?90%的乙醇溶液，回流后浓缩即得。
[0014]其中，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、软膏剂、混悬剂、凝胶剂、滴丸、口服液、注射剂或散剂。
[0015]本发明的另一目的是提供一种用于预防或治疗阿尔茨海默症的功能性保健食品，其包括金荞麦提取物。
[0016]其中，所述金荞麦提取物为金荞麦的乙醇提取物。
[0017]其中，所述金荞麦提取物的制备过程为:向金荞麦中加入I?10倍重量的体积百分比浓度为20?90%的乙醇溶液，回流后浓缩即得。
[0018]本发明技术方案提供了一种金荞麦提取物的新用途，可用于制备治疗阿尔茨海默症的药物或功能性保健食品，开拓了金荞麦提取物的应用领域。金荞麦提取物为天然产物，安全、无毒，可以有效地用来制备用于预防、延缓和治疗阿尔茨海默症的药物组合物和功能性保健食品。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是实施例2的Morris水迷宫实验结果，其中，图1A为各组小鼠的平均逃避潜伏期结果，图1B为各组小鼠的平均游泳距离结果，图1C为各组小鼠的平均游泳速度结果，图1D为各组小鼠在第八天探索平台实验的首次进入平台的平均逃避潜伏期；
[0020]图2是实施例3的耐受性实验结果，其中，图2A为各组小鼠的体重结果，图2B为各组小鼠的进食量结果，图2C为各组小鼠的肝功能ALT及AST的血清指标结果；
[0021]图3是实施例4的Αβ水平测定结果，其中，图3Α为各组小鼠大脑中总的Aβ水平结果，图3Β为各组小鼠大脑中的Aβ 40水平结果，图3C为各组小鼠大脑中的Aβ 42水平结果，图3D为各组小鼠血清中总的A β水平结果，图3Ε为转基因小鼠食用金荞麦提取物饲料后大脑组织中Aβ斑块负荷的结果；
[0022]图4是实施例5的实验结果，其中，图4Α为小鼠大脑中小胶质细胞的对比效果图，图4Β为小鼠大脑中星形细胞的对比效果图，图4C为小鼠大脑中出血斑点的对比效果图；
[0023]图5是实施例6炎症因子水平变化实验中小鼠血清中的IL-1 β ,TNF- α和IFN- Y 浓度水平的结果。
【具体实施方式】
[0024]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0025]本发明使用的野生型(WT)和APPSwe/PSldE9转基因小鼠购于南方模式动物研究所(上海)，动物的管理严格遵守2007年颁布的《云南省动物管理条例》，并严格按照供应商提供的PCR方法对小鼠基因进行了鉴定。
[0026]将小鼠分别设为以下四个大组:APPSwe/PS I dE9转基因小鼠的金荞麦提取物给药组(N= 12，金荞麦提取物和普通饲料相混)、APPSwe/PS I dE9转基因小鼠的姜黄素(Curcumin)给药组(N=12，姜黄素和普通饲料相混)、APPSwe/PS I dE9转基因小鼠的AD对照组(N=12，普通饲料)以及一个WT野生型对照组(N=12，普通饲料)。每个大组又分雌雄两个小组，每组各6只动物。
[0027]本发明所有数据的分析均使用SPSS17.0软件，一般用mean土SEM表示，除非另有说明。单向ANOVA分析被用于确定所有测试组间显著性的不同，P>0.05被认为无显著性差巳升。
[0028]实施例1金荞麦提取物的制备
[0029]取金荞麦干药材破碎成颗粒、加I?10倍的20%?90%的乙醇回流提取三次、滤液减压浓缩、加入鳌合剂(0.6%的柠檬酸)，混匀，喷雾干燥制成浸膏粉，加入赋形剂，混匀，干法制粒等步骤制成。
[0030]实施例2莫里斯(Morris)水迷宫行为学实验
[0031]小鼠水迷宫适应阶段两天(不记录，可视平台高于水面2cm)，训练阶段从第三天开始，平台隐藏在水下1cm，水温保持23°C左右，连续进行5天，每只小鼠每天训练3次。训练时，将小鼠面向池壁从3个入水点分别放入水池，记录小鼠从入水到找到水下隐蔽平台和停留在平台上所需时间，作为潜伏期(latency)，用秒(S)表示。若入水后60s内小鼠未能找到平台，则将其轻轻从水中拖上平台，并停留30s，然后进行下一次训练。第8天移走平台，每只小鼠从平台起始点对面下水，游泳60秒，动物在目标区域游泳的时间，穿越平台的次数和路径等主要参数将被微型摄像机(Stoelting C0.，America)跟踪记录供分析。
[0032]水迷宫实验结果见附图1，WT(野生型)作为野生型对照组，给予正常饲料。APPSwe/PSldE9转基因小鼠给予正常的饮食，作为对照组。另一组APPSwe/PS I dE9小鼠从3个月起持续9个月按100mg/kg/d的剂量给予金荞麦提取物。另外一组APPSwe/PSldE9转基因小鼠按47mg/kg/d给予姜黄素作为阳性对照组。小鼠每天用Morris水迷宫进行3次寻找平台实验，持续7天，第8天移除平台后，小鼠从平台起始象限对面的点入水进行探索实验。隐藏跳台后的七天里各组小鼠的潜伏期(图1A)、游泳距离(图1B)、游泳速度(图1C)没有明显差异(P>0.05)。第8天的探索平台实验(图1D)显示潜伏期也没有差异(P>0.05vs.Control),这意味着金荞麦提取对AD小鼠的学习记忆能力有提高的趋势。图中所有的数据都进行了ANOVA 分析及 Student-Newman-Keulspost-hoc 检验。
[0033]实施例3耐受性实验
[0034]APPSwe/PS I dE9转基因小鼠从第三个月(此时大脑中还未形成A β沉积)开始喂食含有金荞麦提取物和姜黄素的饲料，直至第十二个月。在此期间，动物无死亡发生，无行为异常，长期食用这种饲料的动物的体重和日食量也没有受到影响(将图2A和2B)。另外，长期食用金荞麦和姜黄素也不会引起小鼠的肝功能损伤(图2C)。
[0035]小鼠平均每天的进食量为每克体重0.14-0.16g，每日金荞麦提取物的消耗量为每克体重54 μ g，姜黄素为每克体重消耗77 - 98μ g。在喂食期间为观察到小鼠死亡和生理异常情况，且未引起肝功能损伤。血清中总胆红素(Tb)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)测定的值依然在正常范围内(由昆医附一院检验科协助完成)，由于总胆红素(Tb)的含量较低(〈1U/L)，图中未显示。这些数据说明，金荞麦提取物毒性小，长期食用是安全的。
[0036]实施例4大脑和血清中A β水平的测定实验
[0037]将APPSwe/PS I dE9转基因小鼠从第三个月开始喂食含有金荞麦提取物和姜黄素的饲料。九个月后吸入乙醚麻醉处死小鼠，通过灌注取右心房的血及脑组织并称重，对左脑大脑半球做组织病理分析，右脑半球则装入冻存管存放在在-80° C液氮中用于生化分析。
[0038]小鼠大脑的组织病理分析:对给药组的转基因小鼠的大脑海马区和大脑皮层中的Αβ做定量分析，并与对照组比较，观察Aβ斑块的沉积的影响、对小胶质细胞和星形细胞增生的影响，并用ELISA实验进行验证。
[0039]三大系列的六个等距离跨越海马区域的组织切片(?200 μ m部分)被随机挑选出来，使用免疫组织化技术对所有的Aβ进行染色，分别激活小胶质细胞和星型胶质细胞。切片与主要抗体(CD45和GFAP抗体)在4°C过夜培育，以二氨基氧化酶和葡萄糖为底物，进一步用 DAB 试剂盒(Cat.N0.AB500-500Slide Kit CHEMICON Internat1nal, Inc.)展开。对所有的Αβ沉淀、小胶质细胞和星形胶质细胞增生进行定量分析，病理图像可以通过数字显微镜的摄像头获得，然后进行图像分析，所有的图像处理和分析都采用单盲分析。小鼠大脑和血清中A β 40和A β 42肽水平的定量采用ELISA(Cat.#EZBRAIN40及Cat.#EZBRAIN42,MILLIP0RE)试剂盒。
[0040]如图3所示，用ELISA试剂盒对各组小鼠大脑SDS (Α β-SDS)及甲酸(Α β-FA)提取部分中的Aβ进行检测，Aβ-SDS代表可溶性Aβ，Ai3-FA代表不可溶的Αβ，单个动物的总的A β水平的计算是用总的可溶性A β (可溶性的SDS-A β 42加上可溶性的SDS-A β 40)加上总的FA中的可溶性A β (可溶性的FA-A β 42加上可溶性的FA-A β 40)。
[0041]与食用普通饲料的转基因小鼠相比，食用含金荞麦提取物(P=0.001)饲料及含有姜黄素(ρ〈0.001)饲料的转基因小鼠大脑中总的Αβ的负荷明显降低(图3Α) (ANOVAF=71.044，P=0.003<0.05)。食用含金荞麦提取物饲料的小鼠大脑中A β的负荷降低约45%，食用姜黄素饲料的AD小鼠则降低约57%，SDS-A β及FA-A β (Α β 40及A β 42)的组间比较与总的Αβ的比较本质上一致(图3Β和图3C)。
[0042]食用含金荞麦提取物及含有姜黄素饲料的转基因小鼠的血清中的Αβ也显著降低(图3D) (AN0VA，F=53.057，P=0.005)，小鼠血清中总的Αβ的浓度与大脑中Αβ的总负荷有正相关性(Pearson r=0.986，P=0.014)，这就表明，在用金荞麦提取物作为食物防治阿尔茨海默氏症(AD)的研究中，对血清中Αβ浓度的检测值可以反应小鼠大脑Αβ的负荷。
[0043]图3Ε为APPSwe/PSldE9转基因小鼠食用金荞麦提取物饲料后大脑组织中Aβ斑块负荷的结果。6个空间等距离系列脑组织切片，用漂片免疫组化法对脑片上的Αβ淀粉蛋白斑块进行反应(ant1-Αβ antibody6E10, Serotec),并用DAB试剂盒完成显色反应,对新皮层区和海马区的Αβ淀粉蛋白斑块进行定量，对总的检测区域内的阳性反应斑点与面积比进行分析，计算单位面积的阳性反应的数量的平均值及标准差。对比食用姜黄素饲料的AD小鼠与对照组小鼠新皮层区和海马区Αβ斑块所占的面积部分(AVOVA分析，P〈0.01orP<0.05)有显著性差异。
[0044]食用金荞麦提取物组(P=0.007)与食用姜黄素(P=0.005 小鼠大脑海马区及新皮质区的Αβ明显减少。这与ELISA试剂盒对Αβ水平的检测结果的趋势一致，食用金荞麦提取物饲料的组用免疫组化定量，总的Αβ沉积减少了 65%，姜黄素组减少了 70%，这些数据表明金荞麦提取物在减少Aβ负荷和预防Αβ沉积方面有明显效果。
[0045]实施例5金荞麦提取物阻碍神经病理通路的实验
[0046]采用抗体⑶45加小胶质细胞及GFAP加星形细胞的免疫组化实验来检测新皮质区和海马区域。
[0047]图4Α为小鼠大脑中小胶质细胞的对比效果图。6个空间等距离系列脑组织切片，用漂片免疫组化法对脑片上的激活小胶质细胞进行反应(大鼠单克隆ant1-⑶45，Millipore)，并用DAB试剂盒完成显色反应，同时对新皮层区和海马区的激活的小胶质细胞进行定量，对总的检测区域内的阳性反应斑点与面积比进行分析，计算单位面积的阳性反应斑点的数量的平均值及标准差(AN0VA分析，P〈0.01)，有显著性差异。野生型(WT)小鼠的大脑组织上几乎没有观察到小胶质细胞，APPSwe/PS I dE9转基因小鼠则有明显的小胶质细胞。统计用的是ANOVA分析(F=42.635，P〈0.001)。结果表明，与喂普通饲料的转基因小鼠相比，食用含金荞麦提取物的小鼠的小胶质细胞的水平明显降低(7 ± 3.8vs32.6 ± 11.2，F〈0.001)，与食用姜黄素的小鼠相比则水平一致(7±3.8±3.8vs4.8±2.2，P=0.012)。
[0048]图4B为小鼠大脑中星形细胞的对比效果图。6个空间等距离系列脑组织切片，用免疫组化漂片法对脑片上的星形细胞进行反应(兔抗-胶质纤维酸蛋白，DAK0)，并用DAB试剂盒完成显色反应，对新皮层区和海马区的星形细胞细胞进行定量，对总的检测区域内的阳性反应斑点与面积比进行分析，计算单位面积的阳性反应斑点的数量的平均值及标准差，(AN0VA分析，P〈0.05)，有显著性差异。食用含有金荞麦提取物饲料的小鼠星形细胞明显较少(F=19.966，P〈0.001)，与食用普通饲料的小鼠的大脑上的星形细胞相比水平明显降低(14.8±5.1vs35.2±3.9，P〈0.001 )，与食用含姜黄素饲料的小鼠相比，无显著性差异(14.8±5.lvsl5.7±5.3, P=0.801)。
[0049]图4C为小鼠大脑中出血斑点的对比效果图。准备6张空间等距离系列脑组织切片，用含浓盐酸2%的亚铁氰化钾溶液(体积比计算为2%)对脑片上的血红素斑点进行染色，然后再用1%的核固红复染，对每张脑片子上的蓝色微型斑点进行计数，计算单位面积的阳性反应斑点的数量的平均值及标准差、(AN0VA分析，Ρ〈0.05)，有显著性差异。含铁血黄素阳性反应的蓝色特征颗粒是出血点，主要观察新皮层区、柔脑膜区、大脑的海马区和丘脑区域。喂食普通饲料的每个转基因小鼠的单侧大脑的微出血点率为38±13.0，远高于野生型(WT)4.0±11.0 (P〈0.001)。同样，喂含有金荞麦提取物(10.4±119，P〈0.05)和姜黄素(23.2±16.8)饲料的小鼠也没有观察到明显的微出血点(ANOVA，F=7.125，P=0.003)。
[0050]实施例6炎症因子水平变化实验
[0051]给药组的小鼠取右心房血液，并做心脏灌注，对血清中的炎症因子IL-1、IL-6和TNF-α的水平进行测评，并与对照组比较，观察AD小鼠血清中炎症因子水平的变化，采用ELISA 试剂盒(Cat N0.BMS607/2, BMS6002, BMS606, eB1science, USA)进行测定，并严格按照厂家提供的操作指南进行。
[0052]图5为测得的小鼠血清中IL-1 β ,TNF- α和IFN- Y浓度水平的结果(AN0VA分析，P>0.05vs喂正常饲料的WT野生型，P>0.05vs喂对照药物饲料的AD组)。
[0053]小胶质细胞和巨噬细胞被激活后会释放出一些炎症因子IL-1 β、TNF-α和IFN-Y，在AD大脑内部的炎症级联反应的进展过程中，这是一个重要的病理现象。通常情况下，转基因小鼠血清中炎症因子的水平应该趋向于增高，但检测发现IL-Ιβ和IFN-Y的水平变化不大，与野生型小鼠相比无显著性差异(ANOVA IL-1 β，F=L 520，P=0.253AN0VAIFN- Y , F=0.252，P=0.859)。食用金荞麦提取物饲料转基因小鼠与食用正常饲料的对照组转基因小鼠AD组相比，血清中的TNF-a水平也无明显降低，没有显著性差异(0.08±0.0025pg/mL vs0.0858±0.0061pg/mL, P=0.093)，食用姜黄素饲料的 AD 小鼠也没有显著变化(0.08±0.0025vs0.0824±0.0071, P=0.470)，这表明金荞麦提取物对AD小鼠血清中的炎症因子抑制效果不明显(ANOVATNF-a，F=8.39，P=0.002)。
[0054]以上实施例说明:
[0055](I)施用对象对金荞麦提取物具有很好的耐受性，长期服用不会引起肝功能受损和其它生理功能异常。
[0056](2)金荞麦提取物能有效清除AD小鼠大脑中Αβ的沉积，减少血清中Αβ负荷的的水平，减轻炎症引起的小胶质细胞增生，减少由Αβ淀粉缠结引起的出血，金荞麦提取物可作为一种潜在的对AD有防治和治疗作用的药物(或功能性保健食品)。
[0057]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.金荞麦提取物在制备治疗阿尔茨海默症药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述金荞麦提取物为金荞麦的乙醇提取物、甲醇提取物、正己醇提取物、丙醇提取物或热水提取物。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述金荞麦提取物的制备过程为:向金荞麦中加入I?10倍重量的体积百分比浓度为20?90%的提取溶液，回流后浓缩即得，所述提取溶液为乙醇、甲醇、正己醇或丙醇。
4.一种用于预防或治疗阿尔茨海默症的药物组合物，其特征在于，包括金荞麦提取物以及药学上可接受的辅料。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述金荞麦提取物为金荞麦的乙醇提取物。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述金荞麦提取物的制备过程为:向金荞麦中加入I?10倍重量的体积百分比浓度为20?90%的乙醇溶液，回流后浓缩即得。
7.根据权利要求4-6任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、软膏剂、混悬剂、凝胶剂、滴丸、口服液、注射剂或散剂。
8.一种用于预防或治疗阿尔茨海默症的功能性保健食品，其特征在于，包括金荞麦提取物。
9.根据权利要求8所述的功能性保健食品，其特征在于，所述金荞麦提取物为金荞麦的乙醇提取物。
10.根据权利要求9所述的功能性保健食品，其特征在于，所述金荞麦提取物的制备过程为:向金荞麦中加入I?10倍重量的体积百分比浓度为20?90%的乙醇溶液，回流后浓缩即得。
【文档编号】A61P25/28GK104510782SQ201310445027
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】袁建平, 曾跃勤 申请人:云南康创生物医药科技孵化有限公司