一种鸡新城疫二联体疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明属于动物疫苗制备【技术领域】，具体涉及一种以HN蛋白和鸡α干扰素为有效成分的二联体疫苗及其制备方法。该二联体疫苗，通过利用基因工程技术将HN基因和鸡α干扰素基因转化感染BHK-21细胞并充分表达获得目的蛋白，将目的蛋白与佐剂混合制备而得疫苗。利用HN基因与鸡α干扰素基因表达蛋白制备的二联体疫苗注入鸡体内时，HN蛋白和α干扰素在鸡体内发挥各自生物学功能，在预防鸡新城疫病毒感染同时，还具有积极的预防和治疗其他种类病毒感染的效果，疫苗总体安全可靠，能够长时间地、持续地诱导机体产生特异性抗体，提高鸡的免疫力，较好的克服了传统疫苗单一预防一种疾病的不足。
【专利说明】一种鸡新城疫二联体疫苗及其制备方法
【技术领域】[0001]本发明属于动物疫苗制备【技术领域】，具体涉及一种以HN蛋白和鸡α干扰素(a -1FN)为有效成分的二联体疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002]家禽养殖过程中，随着病原菌新菌株、变异株的不断出现，原来对某些畜禽疫病具有较好防治效果的药物已逐渐难以达到较为满意的治疗效果。近年来，随着家禽养殖过程中病毒性疾病危害的日益严重，我国在疾病预防控制的疫苗产品制备方面投入了巨大的人力、物力和财力，对控制疾病的大规模流行扩散起到了关键的预防作用。
[0003]鸡新城疫(Newcastle disease, ND)疾病是一种由新城疫病毒引起的一种高度接触性、急性败血性传染病，是目前危害养禽业发展最为严重的传染病之一，因此又被称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟。目前对鸡新城疫病主要以早期注射疫苗预防为主。
[0004]HN蛋白是鸡新城疫病毒的主要结构蛋白，具有良好的免疫原性和反应原性，已被用于制备鸡新城疫疾病预防的亚单位疫苗。鸡α干扰素既具有抗病毒活性又具有免疫调节和疫苗佐剂的作用，在鸡新城疫疾病的预防和治疗过程中用途较为广泛。
[0005]现有技术中，单独利用HN蛋白制备预防鸡新城疫疾病的亚单位疫苗已有较多研究，利用鸡α干扰素(α-1FN)作为疫苗来提高鸡免疫力或预防治疗疾病也有很多报道，但尚未见到将两者进行结合共同制备预防鸡新城疫疾病的疫苗的相关报道。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于通过基因工程手段将HN基因和鸡α干扰素基因共同转化入真核系统进行表达，将表达获得的目的蛋白用于制备预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗。
[0007]一种预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗，通过以下方法制得:
(1)利用PCR技术扩增鸡α干扰素基因，利用RT-PCR技术扩增鸡新城疫病毒HN基因；
(2)将步骤(1)获得的HN基因和鸡α干扰素基因克隆到真核表达载体质粒pcDNA3.1中，构建重组真核双表达载体质粒pcDNA3.1-1FN-HN ；
(3)将步骤(2)获得的重组真核双表达载体质粒pcDNA3.1-1FN-HN转染ΒΗΚ-21细胞进行ZeocinTM抗性筛选；
(4)将步骤(3)筛选所得阳性细胞进行培养，使HN基因和鸡α干扰素基因得到充分表
达；
(5)将步骤(4)HN基因和鸡α干扰素基因所表达蛋白回收纯化获得目的蛋白；
(6)将步骤(5)所获得的目的蛋白与佐剂混合制备预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗。
[0008]所述预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗，步骤(6)中所述目的蛋白与佐剂壳聚糖的质量比为1:1。
[0009]所述预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗的制备方法，包括以下步骤:
(I)利用PCR技术扩增鸡α干扰素基因，利用RT-PCR技术扩增鸡新城疫病毒HN基因；(2)将步骤(1)获得的HN基因和鸡α干扰素基因克隆到真核表达载体质粒pcDNA3.1中，构建重组真核双表达载体质粒pcDNA3.1-1FN-HN ；
(3)将步骤(2)获得的重组真核双表达载体质粒pcDNA3.1-1FN-HN转染ΒΗΚ-21细胞进行ZeocinTM抗性筛选；
(4)将步骤(3)筛选所得阳性细胞进行培养，使HN基因和鸡α干扰素基因得到充分表
达；
(5)将步骤(4)HN基因和鸡α干扰素基因所表达蛋白回收纯化获得目的蛋白；
(6)将步骤(5)所获得的目的蛋白与佐剂混合制备预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗。
[0010]步骤(6)中所述目的蛋白与佐剂壳聚糖的质量比为1:1。
[0011]目前许多药物对某些畜禽疫病已经难以显示满意的防治效果，尤其是病毒性疾病的危害日益严重，因此迫切需要找到一种有效的防治方法。干扰素(IFN)作为一组具有多种功能的活性蛋白质，在具有广谱性的抗病毒作用的同时，还影响细胞的生长，以及分化、免疫功能调节的多种功能的发挥，因此在疫苗制备【技术领域】具有较为广泛的用途。传统的动物干扰素因其直接生产成本高、产品质量难控制、种间差异大和干扰素在动物体内不能长期稳定存在等原因，其应用范围较为有限，而利用基因工程技术制备的重组干扰素，因其制备纯度和效率远高于传统技术，因此具有较大的市场潜力和竞争力。
[0012]发明人利用基因工程技术创新性的将鸡新城疫病毒HN基因与鸡α干扰素基因同时转入真核表达系统，通过诱导、表达、纯化，可同时获得大量的目的蛋白。利用HN基因与鸡α干扰素基因表达蛋白制备的二联体疫苗注入鸡体内时，HN蛋白和a-1FN在鸡体内发挥各自生物学功能，在预防鸡新`城疫病毒感染同时，还具有积极的预防和治疗其他种类病毒感染的效果，疫苗总体安全可靠，能够长时间地、持续地诱导机体产生特异性抗体，提高鸡的免疫力，较好的克服了传统疫苗单一预防一种疾病的不足。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为鸡α -干扰素基因PCR扩增产物；
图2为鸡HN基因RT-PCR扩增产物；
图3为重组质粒pcDNA3.1-1FN-HN及其EcoR I和HindIII双酶切鉴定结果；
图4为重组质粒pcDNA3.1-1FN-HN及其BamHI和SalI双酶切鉴定结果；
图5为ZeocinTM抗性筛选下的细胞形态，其中A为转染质粒pcDNA3.1-1FN-HN的BHK-21细胞，B为转染质粒pcDNA3.1的BHK-21细胞，C为转染PBS的BHK-21细胞空白对照，D为未转染的BHK-21细胞空白对照；
图6为转染的BHK-21细胞中表达蛋白的IFA检测结果，其中A为转染质粒pcDNA3.1-1FN-HN的BHK-21细胞HN蛋白的IFA检测结果，B为转染质粒pcDNA3.1-1FN-HN的BHK-21细胞a -1FN的IFA检测结果，C为转染质粒pcDNA3.1的BHK-21细胞WA检测结果，D为未转染的BHK-21细胞IFA检测结果；
图7表达产物的Western-bloting鉴定，其中条带I为pcDNA3.1-1FN-HN表达蛋白的Western-blotting检测,条带2为标准低分子量蛋白质。
【具体实施方式】[0014]下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
[0015]实施例1
本实施例着重描述鸡新城疫二联体疫苗的制备过程。
[0016]本发明的二联体疫苗的制备过程大体上包括以下步骤:
(1)利用PCR、RT-PCR技术分别克隆鸡a-1FN基因和鸡新城疫病毒HN基因；
(2)将HN基因和鸡a-1FN基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，构建重组真核双表达载体pcDNA3.1-1FN-HN, PCR及酶切鉴定筛选正向阳性克隆；
(3)重组质粒pcDNA3.1-1FN-HN转染BHK-21细胞，然后进行ZeocinTM抗性筛选；
(4)针对筛选的阳性细胞进行间接免疫荧光(IFA)和利用Western-blotting技术检测目的蛋白HN和a -1FN在ΒΗΚ-21细胞中的表达；
(5)利用蛋白纯化技术纯化目的蛋白；
(6)收获目的蛋白，配合佐剂制备二联体疫苗。
[0017]具体制备过程如下:
(I)利用PCR、RT-PCR技术分别克隆鸡新城疫病毒HN基因和鸡a -1FN基因 鸡新城疫HN基因与鸡a-1FN基因的引物设计` 根据已知的鸡新城疫病毒的HN基因和鸡a -1FN基因组序列，设计了鸡HN基因Ρ1、Ρ2的PCR引物及鸡α-1FN基因的Ρ3、Ρ4的PCR引物。
[0018]Pl 5' -ACA GAA TCC GTT CTA CCA CAT CAC C 一 3'
Ρ2 5' — GTC AAG CTT CCA ACC ATC CTA TGA T 一 3'
Ρ3 5' — ATA GGA TCC AAC ATG CCT GGG CCA TCA G — 3'
Ρ4 5' — TCC GTC GAC TTA GCG CAT GGT GCG G — 3'
引物Pl带有EcoR I酶切位点，引物Ρ2带有HindIII酶切位点，引物Ρ3带有BamH I酶切位点，引物Ρ2带有SalI酶切位点，Pl和Ρ2引物之间所扩增片断长约1.8Κρ，Ρ3和Ρ4引物之间所扩增片断长约582bp，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
[0019]PCR扩增鸡a-1FN基因
以Ρ3、Ρ4为引物，以重组质粒pMD-T-1FN-a为模板，进行PCR扩增。
[0020]PCR反应采用50 μ L反应体系，在50 μ L反应体系中加入:10 X PCR buffer 5 μ L，dNTP 2 μ L，模板I μ L，上、下游引物各I μ L，Taq酶0.5 μ L，灭菌水39.5 μ L，总体积50 μ L。混合均匀后盖紧管口放入PCR仪内扩增反应。
[0021]PCR反应条件:95°C预变性8min后进入循环，94°C变性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸Imin, 30个循环后，72°C再延伸lOmin。
[0022]用1%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，用tiangen凝胶回收试剂盒回收PCR产物，tiangen凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，得到约582bp的PCR产物，见图1。
[0023]RT-PCR扩增鸡HN基因
按照TRIzoI法对其鸡新城疫病毒基因组RNA进行提取。
[0024]以P1、P2为引物，以鸡新城疫病毒基因组RNA为模板进行RT-PCR扩增。
[0025]RT-PCR反应采用50 μ L反应体系，在50 μ L反应体系中加入:10XPCR buffer5 μ L，dNTP 2 μ L，模板I μ L，上、下游引物各I μ L，Taq酶0.5 μ L，灭菌水39.5 μ L，总体积50 μ L。混合均匀后盖紧管口放入PCR仪内扩增反应。
[0026]RT 反应条件如下:70°C，5min ；42°C，Ih ；95°C，5min ；4°C，5 min。
[0027]PCR反应条件:94°C预变性5min后进入循环，94°C变性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸2.5min, 30个循环后，72°C再延伸lOmin。
[0028]用1%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，用tiangen凝胶回收试剂盒回收PCR产物，tiangen凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，得到约1.SKp的PCR产物，见图2。
[0029](2)将HN基因和鸡a -1FN基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，构建重组真核双表达载体pcDNA3.1-1FN-HN, PCR及酶切鉴定筛选正向阳性克隆
用BamH I和SalI将PCR扩增回收的鸡a -1FN基因及目的载体pcDNA3.1双酶切，然后进行连接。将连接产物转化至DH5a中，挑取克隆进行酶切鉴定。结果表明酶切片段与预期大小一致，重组质粒(pcDNA3.1-1FN)构建成功。
[0030]用EcoR I和HindIII将PCR扩增回收的鸡HN基因及目的载体pcDNA3.1进行双酶切，然后进行连接。将连接产物转化至DH5 α中，挑取克隆进行酶切鉴定。结果表明酶切片段与预期大小一致，重组质粒(pcDNA3.1-1FN-HN)构建成功。
[0031]重组载体质粒(pcDNA3.1-1FN-HN)转化大肠杆菌感受态细胞后，第二天挑取阳性单个菌落过夜培养后，提取质粒进行EcoR I和HindIII双酶切，得到约1.8kb和6.0Kp两条片段与预期要求相符合，见图3 ;再将提取的质粒进行BamHI和SalI双酶切，得到约582bp和7.2Kp两条片段与预期要求相符合，见图4。
[0032](3)重组质粒pcDNA3.1-1FN-HN转染ΒΗΚ-21细胞，然后进行ZeocinTM抗性筛选 重组质粒pcDNA3.1-1FN-HN转染ΒΗΚ-21细胞
按LipofectamineTM 2000试剂盒(购自Invetrogen公司)说明书进行转染,所用培养液均不含有抗生素和血清。
[0033]具体操作步骤如下:
取25 μ g载体质粒pcDNA3.1-1FN-HN和1 μ g鸡HN基因组RNA (按照本领域常规方法从病鸡的十二指肠中提取)，加入94 μ L DMEM培养液(购自美国英杰生命技术有限公司)中，轻轻混匀，室温静置15min备用。
[0034]另取1OyL 脂质体 2000 (LipofectamineTM 2000)加入 90yL DMEM 培养液中，轻轻混匀后室温静置15min备用。
[0035]将上述两者混合得混合液a，室温静置30 — 45min。
[0036]将转染用的BHK-21细胞弃去上清，取200 μ L混合液a加入已准备好的单层BHK-21细胞上，再加入800 μ LDMEM培养液，轻轻混匀后，置于37°C 5% CO2培养箱中培养4 — 5h。
[0037]吸出转染混合液，加入含有10%胎牛血清和100U/mL青、链霉素的DMEM培养液继
续培养。
[0038]ZeocinTM 抗性筛选
将未转染BHK-21细胞传代培养，用含O, 50，125，250，500，750和I 000 μ g / mL不同ZeocinTM浓度的选择培养液代替含双抗的细胞培养液培养，隔3—4 d换液传代培养，并适时观察细胞的存活比率，最终确定细胞正常生长的最高ZeocinTM浓度为SOyg /mL。[0039]将转染pcDNA3.l-1FN-HN质粒的BHK-21细胞在含更高的ZeocinTM浓度培养基中(IOOyg / mL)培养5— 6代，直至培养液中无死亡细胞出现。将细胞转入96孔板继续培养并做10—1 —10_12的稀释，得到一个由单细胞克隆扩大培养出的细胞系，命名为BHK-1FN.HN(图5-A);转染pcDNA3.1质粒的BHK-21细胞中也筛选出一株ZeocinTM抗性细胞(图5-B);而转染PBS和未转染质粒的BHK-21对照细胞则在抗性压力下逐渐脱落死亡(图 5-C，D)。[0040](4)针对筛选的阳性细胞进行间接免疫荧光(IFA)和利用Western-blotting技术检测目的蛋白HN和a -1FN在ΒΗΚ-21细胞中的表达
对筛选的阳性细胞进行间接免疫荧光 具体步骤如下:
用含4%的多聚甲醛固定筛选的朋1(-21细胞401^11，？851'洗涤后再用0.5%1'1^0凡/PBS冰上穿透10min，0.1%的BSA室温封闭20 min。
[0041]抗HN蛋白单抗(1:500稀释)和抗a-1FN的单抗(1:200稀释)分别为一抗孵育30 min，FITC标记的羊抗小鼠IsG 二抗(I:1 000)孵育30 min，PBST洗涤后荧光显微镜下
观察结果。
[0042]借助荧光显微镜可以看到转染pcDNA3.1-1FNa-HN的BHK-21细胞中均散在大量的荧光(图6-A，B)，而转染pcDNA3.1空质粒和未转染的细胞中则没有荧光(图6_C，D)。结果表明，pcDNA3.1-1FNa -HN重组质粒在BHK-21细胞中成功共表达了 HN和IFNa蛋白。
[0043]Western-blotting 检测
重悬筛选出的阳性BHK-21细胞，离心后用PBS (pH7.4)缓冲液漂洗菌体沉淀2次，后重悬于100 μ L PBS中，加入2 X蛋白电泳上样缓冲液100 μ L。
[0044]将100 μ L细胞培养液上清进行相同的处理后，分别于100°C煮沸5 min，经12
000r / min离心15 min后取上清液10 μ L进行SDS — PAGE蛋白电泳，然后转移至NC膜上进行Western-blotting分析。所用一抗为抗6xHis标签单抗(1:500稀释),二抗为HRP标记的羊抗小鼠IgG(l:1 000稀释)，用DAB作为底物进行显色反应。
[0045]Western-blotting检测目的蛋白反应原性的具体步骤如下:
A.转印剪8块滤纸与I块硝酸纤维素膜(NC)，大小与凝胶相等，在转移缓冲液中浸泡5min，在正极板上按4层滤纸、NC膜、凝胶、4层滤纸的顺序叠放整齐，确定无气泡后盖上负极板，按胶体积0.65mA/cm2转移2h。
[0046]B.封闭转移完成后，取下NC膜，切下标准分子量Marker，置氨基黑染色液中浸染20min，取出后用漂洗脱色，直至背景蓝色脱尽。其余NC膜用PBS冲洗，加入IOml封闭液，室温轻轻振摇l_2h。
[0047]C.与抗体的结合封闭结束后，用PBS冲洗NC膜4~5次，加入PBST按照
1: 1000倍稀释的伪狂犬阳性血清10mL，37°C结合3 h，用PBST冲洗4~5次，每次在摇床缓慢摇动。加入1: 500倍稀释的兔抗猪IgG(二抗)，室温下轻摇孵育lh，取出用PBST冲洗3~4次，每次IOmin0
[0048]D.底物显色将NC膜转移到IOmL底物溶液中，室温避光轻摇3min观察显色情况，等出现明显条带时，立即转入PBST缓冲液中终止显色，室温保存。
[0049]Western blotting检测结果显示,在BHK-21细胞条带中，74.6KD及19 ku附近出现2条阳性条带，大小与表达HN和α-1FN蛋白的预期相一致，表明两种蛋白在BHK-21细胞中得到了很好的表达，但细胞上清中未见表达蛋白条带，见图7。
[0050]( 5 )利用蛋白纯化技术纯化目的蛋白；
将重组菌IOyL接种至3mL、2XYT培养液(100 μ g/mLKan+)中，37°C培养过夜。取过夜培养物2mL接种于500mL 2 X YT培养液中，剧烈振摇至0D600为0.6~1.0时，加入IPTG至终浓度0.8mmol/L, 37°C诱导表达4h以上。
[0051]包涵体的制备与蛋白质的变性溶解:(1)将上述诱导后的重组菌5000r/min离心15min，弃上清，用蒸馏水洗2次，再用1/10原培养体积的TEl缓冲液重悬细菌沉淀。
(2)裂解细菌在细菌悬液中加入溶菌酶至终浓度为200mg/L (约40 μ L、50mg/mL的贮液)和1/10体积的1% TritonX-100，30°C作用15~30min后，于冰浴中超声裂解细菌(80W、作用3s、间隔9s、99次)，此时溶液由粘稠变为清亮。4°C下10000r/min离心lOmin，收集包涵体沉淀。(3)洗涤分别用TE2、TE3缓冲液各洗涤包涵体沉淀2次(重悬包涵体，分别作用lOmin)，4°C，10 000r/min离心lOmin，收集沉淀。(4)变性加IOmL变性液溶解沉淀，室温放置Ih以上。4°C下12000r/min离心lOmin，收集变性溶解的上清液，去除不溶性杂质。
[0052]HN蛋白的复性及纯化:利用分光光度计测定变性溶解的重组菌HN蛋白浓度，分别在变性液中加入相应体积的稀释液，调整其蛋白终浓度在100mg/L以下，并使溶液中尿素浓度保持在lmol/L。然后加入还原型谷胱苷肽(GSH)和氧化型谷胱苷肽(GSSG)，使其终浓度分别达到0.9mmol/L和0.lmmol/L，4°C放置20h以上对HN蛋白进行复性。复性后用缓冲液透析48h,每隔6h换液I次。透析完全后溶液中应不含尿素,再用PEG-20000浓缩透析液。将复性后的蛋白过滤除菌。
`[0053]复性的HN蛋白经浓缩后，经紫外分光光度计测定样品在A260nm和A280nm波长的光吸收值，按照公式计算样品中蛋白质浓度:蛋白质浓度(mg/mL) = (l.45XA280 一
0.74XA260)X稀释倍数。蛋白质纯度测定用SDS-PAGE电泳检测纯化的蛋白，用薄层扫描仪扫描分析目的蛋白的纯度。
[0054]( 6 )收获目的蛋白，配合佐剂制备二联体疫苗。
[0055]将收获的目的蛋白与佐剂壳聚糖按1:1比例混合制成二联体疫苗。
[0056]实施例2
为进一步检验本发明所制备的二联体疫苗的针对新城疫病毒的预防效果，发明人做了进一步的动物学实验。
[0057]选取血清学为ND阴性的5日龄健康雏鸡80只，随机分成4组，分别为:空白对照组(用常规菌体苗0.5ml/只)、二联体疫苗低剂量组(0.3ml/只)、中剂量组(0.5ml/只)、高剂量组(0.8ml/只)，每组20只。
[0058]利用实施例1所提供的制备鸡新城疫HN和a -1FN 二联体疫苗的方法，制备二联体疫苗，于雏鸡颈部皮下接种，具体的对比处理如下表所示
表1试验鸡分组与处理 miI剂量/ (mi/只)I试验鸡数/只I给药途径
空白对照组_05_20_颈部皮下接种
而和IFN-α亚单位疫苗低剂量组 0.320颈部皮下接种.涵和IFN-α亚单位疫苗中剂量组 |θ.5|20I颈部皮下接种
【权利要求】
1.一种预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗，其特征在于，该疫苗通过以下方法制得:(1)利用PCR技术扩增鸡α干扰素基因，利用RT-PCR技术扩增鸡新城疫病毒HN基因； (2)将步骤(1)获得的HN基因和鸡α干扰素基因克隆到真核表达载体质粒pcDNA3.1中，构建重组真核双表达载体质粒pcDNA3.1-1FN-HN ； (3)将步骤(2)获得的重组真核双表达载体质粒pcDNA3.1-1FN-HN转染ΒΗΚ-21细胞进行ZeocinTM抗性筛选；(4)将步骤(3)筛选所得阳性细胞进行培养，使HN基因和鸡α干扰素基因得到充分表达；(5)将步骤(4)HN基因和鸡α干扰素基因所表达蛋白回收纯化获得目的蛋白；(6)将步骤(5)所获得的目的蛋白与佐剂混合制备预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗。
2.如权利要求1所述预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗，其特征在于，步骤(6)中所述目的蛋白与佐剂壳聚糖的质量比为1:1。
3.权利要求1所述预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗的制备方法，包括以下步骤:(1)利用PCR技术扩增鸡α干扰素基因，利用RT-PCR技术扩增鸡新城疫病毒HN基因； (2)将步骤(1)获得的HN基因和鸡α干扰素基因克隆到真核表达载体质粒pcDNA3.1中，构建重组真核双表达载体质粒pcDNA3.1-1FN-HN ； (3)将步骤(2)获得的重组真核双表达载体质粒pcDNA3.1-1FN-HN转染ΒΗΚ-21细胞进行ZeocinTM抗性筛选；(4)将步骤(3)筛选所得阳性细胞进行培养，使HN基因和鸡α干扰素基因得到充分表达；(5)将步骤(4)HN基因和鸡α干扰素基因所表达蛋白回收纯化获得目的蛋白；(6)将步骤(5)所获得的目的蛋白与佐剂混合制备预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗。
4.如权利要求3所述预防鸡新城疫疾病的二联体疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述目的蛋白与佐剂壳聚糖的质量比为1:1。
【文档编号】A61K48/00GK103495182SQ201310453688
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】郭芳茹, 杨慧敏, 张遂平, 杨果, 王菊萍, 董战杰, 王黎明 申请人:河南亚卫动物药业有限公司