一种副鸡嗜血杆菌、灭活疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种副鸡嗜血杆菌、灭活疫苗及其制备方法，所述副鸡嗜血杆菌为副鸡嗜血杆菌（Haemophilusparagallinarum)HN-VA株，已于2012年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCCNO.7211。本发明首次采用副鸡嗜血杆菌HN-VA株制备针对鸡传染性鼻炎的灭活疫苗，该疫苗的研究和制备有效解决了当前我国鸡传染性鼻炎难以有效预防，发病率高、死亡率高的问题，且不会对鸡产生任何不良反应，实验安全性高，接种后可在鸡体内产生高效价的中和抗体，免疫效果较好。
【专利说明】一种副鸡嗜血杆菌、灭活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种副鸡嗜血杆菌，同时该副鸡嗜血杆菌的灭活疫苗及其制备方法， 属于微生物制剂领域。
【背景技术】
[0002] 副鸡嗜血杆菌（Haemophilus paragallinarum)是一种引起鸡急性上呼吸道疾病 的致病菌。该病首先发现于波兰和美国，以后在其它各国经常发生。1980年以来，我国也屡 有本病的报道。该呼吸道疾病俗称鸡传染性鼻炎，临床上以面部水肿、鼻窦炎、流泪为主要 特征，可引起产蛋鸡的产蛋量下降，育成鸡的生长受阻、开产期推迟，肉鸡增重下降，给养禽 业造成巨大的经济损失。目前对副鸡嗜血杆菌的治疗主要以抗生素为主，但是采用抗生素 常会造成耐药菌株的出现，导致副鸡嗜血杆菌在同一鸡群中复发。因此副鸡嗜血杆菌疫苗 的研究成为热点，但是目前副鸡嗜血杆菌疫苗对部分患病鸡预防效果较差。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种副鸡嗜血杆菌。
[0004] 本发明的目的还在于提供一种副鸡嗜血杆菌的灭活疫苗。
[0005] 本发明的目的还在于提供一种副鸡嗜血杆菌的灭活疫苗的制备方法。
[0006] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种副鸡嗜血杆菌，所述副 鸡嗜血杆菌为副鸡嗜血杆菌（Haemophilus paragallinarum)HN_VA株，已于2012年7月23 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，保藏号：CGMCC NO. 7211。
[0007] 所述副鸡嗜血杆菌HN-VA株的分离方法如下：
[0008] (1)病料的处理：从发病雏鸡鼻窦内深部取分泌物作为病料，将病料接种于鸡血清 琼脂肉汤培养基培养，进行分离纯化；
[0009] (2)病原禽胚分离培养：将步骤（1)纯化的病原菌接种于SPF鸡胚，收集死亡鸡胚 的卵黄液，即得副鸡嗜血杆菌HN-VA株。
[0010] 本发明所采用的技术方案还在于提供一种副鸡嗜血杆菌的灭活疫苗，其活性成分 为灭活的副鸡嗜血杆菌HN-VA株。
[0011] 本发明所采用的技术方案还在于提供一种副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，包 括以下步骤：
[0012] (1)将副鸡嗜血杆菌HN-VA株接种于SPF鸡胚，收集接种后死亡的SPF鸡胚卵黄 液，得到生产用种子；
[0013] (2)将生产用种子扩大培养，加入灭活剂灭活，然后加入防腐剂和矿物油佐剂进行 乳化，制得副鸡嗜血杆菌的灭活疫苗。
[0014] 所述灭活剂为甲醛。
[0015] 所述甲醛终体积浓度0· 2%。
[0016] 所述防腐剂为硫柳汞。
[0017] 所述硫柳汞的用量为终质量浓度0. 01%。
[0018] 所述矿物油佐剂为白油佐剂。
[0019] 本发明首次采用副鸡嗜血杆菌HN-VA株制备针对鸡传染性鼻炎的灭活疫苗，该疫 苗的研究和制备有效解决了当前我国鸡传染性鼻炎难以有效预防，发病率高、死亡率高的 问题，且不会对鸡产生任何不良反应，实验安全性高，接种后可在鸡体内产生高效价的中和 抗体，免疫效果较好。
[0020] 本发明用HN-VA株制备灭活疫苗工艺简单、操作方便、制备的疫苗抗原性好、安全 性高，对外界环境无任何不良影响，安全评估系数高。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为副鸡嗜血杆菌HN-VA株的PCR扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1
[0023] 本发明的副鸡嗜血杆菌HN-VA株，是通过以下方式获得的：
[0024] 2012年6月，郑州尉氏某鸡厂大批7周龄以上雏鸡发生多起以打喷嚏，流鼻液，颜 面浮肿，眼睑和肉髯水肿为主要特征的传染病，造成鸡只死亡和产蛋率下降。因此针对该批 发病雏鸡，分离纯化得到病原菌，命名为HN-VA株。通过对HN-VA株各项观察，特异性PCR 鉴定和测序分析表明，HN-VA株属于副鸡嗜血杆菌。
[0025] (1)病料的处理：用无菌拭子插入发病雏鸡鼻窦内深部取分泌物做病料，然后划线 培养于鸡血清琼脂肉汤培养基中，37°C培养48h，再挑取单个菌落接种于鸡血清肉汤培养基 上中培养16-20h。
[0026] (2)病原禽胚分离培养：将纯化的病原菌接种于鸡血清肉汤液体培养基中培养 16h，然后将菌液接种于6日龄SPF鸡胚3枚，每枚0. lml。观察接种24h后的鸡胚死亡情 况，收集30h内死亡的鸡胚的卵黄液，获得的菌株命名为HN-VA株。将等量的卵黄液分装于 灭菌瓶内，每瓶2ml，检验合格后作为一级种子。也可用鸡胚复壮，但不应超过6代。检验方 法：取1瓶卵黄液，接种于含有鸡肉汤培养基的三角瓶内，培养16-20小时后，观察三角瓶， 若液体菌种均匀一致浑浊生长，则检验菌液合格。
[0027] (3) HN-VA 株的鉴定
[0028] (a)染色镜检：挑取单个菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌的形态特 征。镜下可见大量的单个、成对或短琏的两极浓染的革兰氏阴性细小杆菌。
[0029] (b)卫星现象：取2个副鸡嗜血杆菌培养基的平板，一个划线接种所分离纯化的细 菌并点种金黄色葡萄球菌，另一个只划线接种分离菌作对照。于37°C培养箱中培养48h，发 现其在葡萄球菌周围长出"卫星现象"。
[0030] (C)挑取单个菌落用生理盐水稀释，震荡均匀后制成悬液。在载玻片的一端，滴加 菌体悬液50 μ 1，另一端加入50 μ 1生理盐水，两端再各加入50 μ 11%鸡血红细胞，轻轻晃 匀。温箱中反应3分钟左右观察。鸡血红细胞出现凝集现象，这说明HN-VA株为A型副鸡 嗜血杆菌。
[0031] (d) PCR鉴定：根据副鸡嗜血杆菌的16SrRNA基因（GenBank中登录号为 AY498870. 1)的保守区设计引物，由Invitro-gen公司合成，引物序列如下：
[0032] 上游引物 HP16S-F :5' -CCAACCTTCCTCACCACC-3'（如 SEQ ID No. 1 所示），
[0033] 下游引物 HP16S-R :5' -CCGCATAGAATCGGAAGA-3'（如 SEQ ID No. 2 所示）。
[0034] 按照《精编分子生物学实验指南》的方法提取菌体基因组DNA，进行PCR扩增。
[0035] PCR 反应体系为：10XPCRbuffer2y 1，（1ΝΤΡ2μ 1，MgCl2Iy 1，Taq 酶 0· 2μ 1，上、 下游引物各 〇· 5μ 1，模板 0· 5μ 1，ddH2013. 5μ 1。
[0036] PCR 反应条件为：95°C 5min，94°C lmin，56°C 50s，2°C 50s，35 个循环；72°C 延长 5min〇
[0037] 将PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，结果如图I所示。图I中1、2分别为分离的 2株菌株扩增出的特异条带，扩增片段大小为250-350bp，条带位置与预期一致。经测序后 与GenBank中的登录号为AY498870. 1的序列进行比较，同源性高达98%，扩增片段的核苷酸 序列详见序列表SEQ ID No. 3所不。以上结果表明，分离于发病雏鸡中的HN-VA株属于副鸡 嗜血杆菌。
[0038] 实施例2
[0039] 本发明副鸡嗜血杆菌的灭活疫苗，制备方法如下：
[0040] (1)生产用种子检验：将一级种子采用琼脂平板进行菌落计数。细菌计数按农业 部颁发的兽医微生物制品规程进行，以ΚΓ 1，1〇_2,1〇_3, KTltl稀释，然后取0. ImL稀释液均匀 地涂抹在琼脂平板上，每个稀释度做2板，置于37°C培养箱中培养16?20h，2板的平均数 即为该稀释度的细菌数，用营养肉汤培养的菌液作为对照，每毫升菌落数不低于15亿方可 用于生产。
[0041] (2)灭活疫苗制备：将生产用种子按万倍扩大培养，培养基用半合成肉汤培养基， 调pH到7. 2,115°C灭菌30分钟。在菌液中加入质量分数10%的甲醛溶液，使甲醛溶液占菌 液总体积的〇. 2%，然后2-8°C灭活8天，灭活期间每天振摇5次。然后在灭活合格的菌液中 加入硫柳汞，使硫柳汞终浓度为〇. 01% (质量)，和菌液2倍体积的白油佐剂进行乳化，制得 副鸡嗜血杆菌灭活疫苗。
[0042] 灭活菌液检测方法：取检品在无菌条件下接种沙氏培养基或不滴定pH普通琼脂 斜面2支、血斜2支、0. 2ml/支、置20?30°C培养。同时接种装置不少于50ml的马丁肉液 和厌气肝汤各2支，Iml/支，置37°C培养，3日后，自厌气肝汤管中吸取适量培养物，移植于 鲜血琼脂斜面和厌气肝汤小管各1支，自马丁汤大管中吸取适量培养物移植于鲜血琼脂斜 面和马丁肉汤小管各一支，连前继续培养5日，均应无菌生长。
[0043] 上述实施例中所采用的培养基均为半合成培养基，购自郑州博赛生物技术股份有 限公司。
[0044] 试验例
[0045] 1、安全检测
[0046] 用2月龄SPF鸡60只，随即分成4组，每组15只，3组实验组SPF鸡分别经颈背部 皮下注射副鸡嗜血杆菌灭活疫苗，一次单剂量接种〇. Iml/只，第4组为对照组，注射灭菌生 理盐水。对实验组SPF鸡和对照组SPF鸡连续观察2周，观察有无发病、死亡和体重变化。 结果3个实验组SPF鸡和对照组SPF鸡体重无差异，无发病、死亡，无局部和全身不良反应。
[0047] 2、效力检验
[0048] 用6周龄SPF鸡20只，10只各皮下注射疫苗0. 25ml，另10只作对照。接种30日 后，取免疫鸡和对照鸡，每只鸡各眶下鼻窦内注射副鸡嗜血杆菌HN-Vl株培养物0. 2ml，观 察2周。对照组发病5只，免疫组保护7只。
【权利要求】
1. 一种副鸡嗜血杆菌，其特征在于，所述副鸡嗜血杆菌为副鸡嗜血杆菌（Haemophilus paragallinarum)HN-VA株，已于2012年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCC NO. 7211。
2. 根据权利要求1所述的副鸡嗜血杆菌，其特征在于，所述副鸡嗜血杆菌HN-VA株的分 离方法如下： (1) 病料的处理：从发病雏鸡鼻窦内深部取分泌物作为病料，将病料接种于鸡血清琼脂 肉汤培养基培养，进行分离纯化； (2) 病原禽胚分离培养：将步骤（1)纯化的病原菌接种于SPF鸡胚，收集死亡鸡胚的卵 黄液，即得副鸡嗜血杆菌HN-VA株。
3. -种权利要求1所述的副鸡嗜血杆菌的灭活疫苗，其特征在于，其活性成分为灭活 的副鸡嗜血杆菌HN-VA株。
4. 一种如权利要求3所述的副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 将副鸡嗜血杆菌HN-VA株接种于SPF鸡胚，收集接种后死亡的SPF鸡胚卵黄液，得 到生产用种子； (2) 将生产用种子扩大培养，加入灭活剂灭活，然后加入防腐剂和矿物油佐剂进行乳 化，制得副鸡嗜血杆菌的灭活疫苗。
5. 根据权利要求4所述的一种副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述 灭活剂为甲醛。
6. 根据权利要求5所述的一种副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述 甲醒终体积浓度〇. 2%。
7. 根据权利要求4所述的一种副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述 防腐剂为硫柳萊。
8. 根据权利要求7所述的一种副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述 硫柳汞的用量为终质量浓度〇. 01%。
9. 根据权利要求4所述的一种副鸡嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述 矿物油佐剂为白油佐剂。
【文档编号】A61P31/04GK104212736SQ201310462857
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】王卫芳, 徐进, 陈建晖 申请人:郑州后羿制药有限公司