一种脱细胞血管基质凝胶及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种脱细胞血管基质凝胶及其制备方法和应用。其由以下方法制备：a）剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，于TritonX-100溶液中脱细胞处理，再冷冻干燥，打碎成粉，60目筛网过滤，得到脱细胞血管基质粉，b）将脱细胞血管基质粉放置于含浓度为0.09-0.11%的胃蛋白酶的盐酸溶液中消化66-78小时，加入氢氧化钠溶液中和盐酸，再加入PBS平衡离子浓度，最后将凝胶溶液放入37℃培养箱中成胶。该脱细胞血管基质凝胶具有良好的塑形能力和力学性能，内部疏松，具有一定的孔隙率，胶原纤维直径合适，稳定性好，可满足制备治疗缺血性疾病的药物、作为组织工程的支架材料和/或细胞培养的要求。
【专利说明】一种脱细胞血管基质凝胶及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织工程化凝胶【技术领域】，具体地说，是一种脱细胞血管基质凝胶及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]纤维蛋白凝胶是一种良好的支架材料，一直是组织工程研究的重点之一。纤维蛋白凝胶主要由天然的细胞外基质成分构成，具有良好的生物相容性、有效的生物活性以及生物可降解性，同时还具有三维多孔结构和良好的可塑性。近年来，纤维蛋白凝胶作为支架材料日益广泛地应用到组织工程研究中，其对肌组织、骨及软骨组织、上皮组织等的形成具有重要作用，但同时却不能为骨及软骨组织工程提供足够的机械强度。
[0003]脱细胞血管基质凝胶是一种组织工程化凝胶，其可应用于以下领域:1)用于注射直接治疗缺血性疾病:比如下肢缺血、心肌缺血等；2)作为细胞治疗的载体，凝胶混合细胞后局部注射治疗，起到局部限制细胞流动和流失的作用；3)作为内皮细胞和平滑肌细胞体外培养过程中铺层用，从而起到帮助细胞粘附、维持细胞形态和功能、促进增殖等作用；4)可作为细胞三维培养的载体，诱导细胞分化等。
[0004]中国期刊《中华医学杂志》，2004年09期，刊出的论文“以液态胶原为支架构建组织工程化心肌组织的实验研究”，将添加了基质因子的液态I型胶原与分离并培养的新生大鼠心肌细胞混合，在环形槽中铸成了环形心肌细胞/胶原条带。中国期刊《中国组织工程研究与临床康复》，2008年49期，刊出的论文“细胞外基质凝胶支架混合人脐静脉来源内皮细胞构建组织工程化的内皮细胞片层”，其首先取新生SD大鼠鼠尾制备I型液态胶原溶液，然后将其与人脐静脉内皮细胞混合，观察内皮细胞在细胞外基质凝胶中的生长过程及发育情况。中国专利文献CN200310118986.4，
【公开日】2004年11月17日，发明名称为“一种用骨基质凝胶构建组织工程软骨的方法”，其首先用软骨细胞分离培养或基质干细胞分离培养诱导为软骨细胞即获取种子细胞，然后取新西兰兔或人胚胎长骨或干骺端松质骨构建骨基质凝胶BMG，最后将种子细胞接种于皮质骨或松质骨BMG上进行体外培养构建组织工程软骨。还有一些报道是将自体来源的血浆通过冻存、离心、沉淀、离子交换、透析等步骤分别获得纤维蛋白原及凝血酶，并将纤维蛋白原与凝血酶混合，使其在凝血酶作用下产生聚合反应，转变成纤维蛋白，交联成立体的网状结构，形成纤维蛋白凝胶。
[0005]但是目前关于脱细胞血管基质凝胶及其制备方法还未见报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种脱细胞血管基质凝胶。
[0007]本发明的再一的目的是，提供一种脱细胞血管基质凝胶的制备方法。
[0008]本 发明的另一的目的是，提供上述脱细胞血管基质凝胶的用途。
[0009]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
一种脱细胞血管基质凝胶，它是由以下方法制备得到的:a)制备脱细胞血管基质粉:剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，放置于
0.9-1.1% Triton X-100溶液中，震荡脱细胞处理，期间隔天水洗并更换0.9-1.1% TritonX-100溶液；再将脱细胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷冻过夜后置于真空冷冻干燥箱冷冻干燥直至血管片变干燥坚硬；打碎成粉，60目筛网过滤；
b)取步骤a)制备的脱细胞血管基质粉放置于含浓度为0.09-0.11%的胃蛋白酶的
0.009-0.011mol/L盐酸溶液中，磁力搅拌消化66-78小时，加入氢氧化钠溶液中和盐酸，然后加入PBS平衡离子浓度，最后将凝胶溶液放入37°C培养箱中成胶；其中，所述的脱细胞血管基质粉与盐酸溶液的比例是5-15mg/ml，所述的氢氧化钠溶液中氢氧化钠摩尔量与盐酸溶液中盐酸摩尔量相等，所述的PBS与盐酸溶液的比例为1: (850-950)mol/mL。
[0010]优选地，所述的脱细胞血管基质凝胶是由以下方法制备得到的:
a)制备脱细胞血管基质粉:剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，放置于1%Triton X-100溶液中，震荡脱细胞处理，期间隔天水洗并更换1% Triton X-100溶液；再将脱细胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷冻过夜后置于真空冷冻干燥箱冷冻干燥直至血管片变干燥坚硬；打碎成粉，60目筛网过滤；
b)取步骤a)制备的脱细胞血管基质粉放置于含浓度为0.1%的胃蛋白酶的0.01mol/L盐酸溶液中，磁力搅拌消化72小时，加入氢氧化钠溶液中和盐酸，然后加入PBS平衡离子浓度，最后将凝胶溶液放入37°C培养箱中成胶；其中，所述的脱细胞血管基质粉与盐酸溶液的比例是5-15mg/ml，所述的氢氧化钠溶液中氢氧化钠摩尔量与盐酸溶液中盐酸摩尔量相等，所述的PBS与盐酸溶液的比例为l:900mol/mL。
[0011]优选地，所述的震荡脱细胞处理具体是在37°C摇床，200rpm的条件下处理6_7天。
[0012]优选地，所述的将凝胶溶液放入37°C培养箱中成胶具体是将凝胶溶液放入37°C培养箱中至少I小时。
[0013]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:
一种脱细胞血管基质凝胶的制备方法，它包括以下步骤:
a)制备脱细胞血管基质粉:剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，放置于
0.9-1.1% Triton X-100溶液中，震荡脱细胞处理，期间隔天水洗并更换0.9-1.1% TritonX-100溶液；再将脱细胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷冻过夜后置于真空冷冻干燥箱冷冻干燥直至血管片变干燥坚硬；打碎成粉，60目筛网过滤；
b)取步骤a)制备的脱细胞血管基质粉放置于含浓度为0.09-0.11%的胃蛋白酶的
0.009-0.011mol/L盐酸溶液中，磁力搅拌消化66-78小时，加入氢氧化钠溶液中和盐酸，然后加入PBS平衡离子浓度，最后将凝胶溶液放入37°C培养箱中成胶；其中，所述的脱细胞血管基质粉与盐酸溶液的比例是5-15mg/ml，所述的氢氧化钠溶液中氢氧化钠摩尔量与盐酸溶液中盐酸摩尔量相等，所述的PBS与盐酸溶液的比例为1: (850-950)mol/mL。
[0014]优选地，所述的脱细胞血管基质凝胶的制备方法包括以下步骤:
a)制备脱细胞血管基质粉:剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，放置于1%Triton X-100溶液中，震荡脱细胞处理，期间隔天水洗并更换1% Triton X-100溶液；再将脱细胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷冻过夜后置于真空冷冻干燥箱冷冻干燥直至血管片变干燥坚硬；打碎成粉，60目筛网过滤；
b)取步骤a)制备的脱细胞血管基质粉放置于含浓度为0.1%的胃蛋白酶的0.01mol/L盐酸溶液中，磁力搅拌消化72小时，加入氢氧化钠溶液中和盐酸，然后加入PBS平衡离子浓度，最后将凝胶溶液放入37°C培养箱中成胶；其中，所述的脱细胞血管基质粉与盐酸溶液的比例是5-15mg/ml，所述的氢氧化钠溶液中氢氧化钠摩尔量与盐酸溶液中盐酸摩尔量相等，所述的PBS与盐酸溶液的比例为l:900mol/mL。
[0015]优选地，所述的震荡脱细胞处理具体是在37°C摇床,200rpm的条件下处理6_7天。
[0016]优选地，所述的将凝胶溶液放入37°C培养箱中成胶具体是将凝胶溶液放入37°C培养箱中至少I小时。
[0017]为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:
如上所述的脱细胞血管基质凝胶的用途，所述的用途选自:
a)制备治疗缺血性疾病的药物，
b)作为组织工程的支架材料，和/或
c)制备细胞培养用的培养基。
[0018]所述的缺血性疾病是指器官或组织缺血方面的疾病，如下肢缺血、心肌缺血等；所述的作为组织工程的支架材料是指作为细胞治疗的载体，将其混合细胞后用于局部注射治疗；所述的制备细胞培养用的培养基可以是作为内皮细胞和平滑肌细胞体外培养过程中铺层用，从而起到帮助细胞粘附、维持细胞形态和功能、促进增殖等作用，还可以是作为细胞三维培养的载体，诱导细 胞分化等，但不仅限于此。
[0019]需要说明的是，上述“直至血管片变干燥坚硬”，其方法优选将脱细胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷冻过夜后，再置于真空冷冻干燥箱在温度一 50°C左右下冷冻干燥46-50小时左右。上述胃蛋白酶消化过程，优选在37°C，340-360转/分钟条件下进行磁力搅拌。
[0020]本发明优点在于:
本发明成功制备得到脱细胞血管基质凝胶，该制备方法使用Triton X-100溶液进行脱细胞，脱除效果彻底，可获得纯的基质成份，胃蛋白酶浓度、处理时间合理，可保证脱细胞血管基质粉中的蛋白成分充分被消化，保证凝胶的均一性，平衡离子浓度得当，可保证I小时后即可快速形成凝胶。所制备得到的脱细胞血管基质凝胶具有良好的塑形能力，保持了一定的力学性能，又保证了内部疏松，具有一定的孔隙率，胶原纤维直径合适，成胶稳定性好，可满足制备治疗缺血性疾病的药物、作为组织工程的支架材料和/或细胞培养的要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]附图1是脱细胞血管基质凝胶的制备模式图。
[0022]附图2是脱细胞血管基质凝胶制备过程中脱细胞血管基质粉的状态。
[0023]附图3是脱细胞血管基质凝胶(5mg/ml)的鉴定。
[0024]附图4是脱细胞血管基质凝胶(10mg/ml)的鉴定。
[0025]附图5是脱细胞血管基质凝胶(15mg/ml)的鉴定。
[0026]附图6是脱细胞血管基质凝胶的胶原纤维直径分析结果。
[0027]附图7是凝胶60分钟内的OD值变化情况。
【具体实施方式】[0028]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0029]本文中，所述的PBS缓冲液其pH为7.2~7.4，包含以下物质组成:NaCl 137mmol/L、KC1 2.7mmol/L、Na2HPO4 10mmol/L、ΚΗ2Ρ04 2mmol/L。IOXPBS 缓冲液就是 0.1M 的 PBS。
[0030]实施例1脱细胞血管基质凝胶的制备及检测(一)
一、脱细胞血管基质凝胶的制备
1、制备脱细胞血管基质粉
从屠宰场购买成年猪(约120kg)主动脉，剔除外膜及筋膜成份后剪碎成不规则的血管小片，放置于1% Triton X-100溶液中，37°C摇床，200rpm震荡脱细胞处理6.5天，期间隔天水洗并更换1% Triton X-100溶液直至血管片发白为止。将经过脱细胞处理后的血管片放置于一 80°C冰箱冷冻过夜后置于真空冷冻干燥箱(Labconco Triad 2.5L，美国)冷冻干燥，温度一 50°C左右，时间48小时左右，直至血管片变干燥坚硬。然后用小型粉碎机将其打碎成粉，经过60目筛网过滤。
[0031]2、制备脱细胞血管基质凝胶
分别称取50、100、150mg上述步骤I中制备的脱细胞血管基质粉放置于IOml含质量体积浓度为0.1%的胃蛋白酶(P7012-1G，Sigma)的0.01mol/L盐酸溶液中，37°C，350转/分钟磁力搅拌消化72小时后加入1/10体积(即Iml)的0.lmol/L氢氧化钠溶液中和盐酸，然后加入1/9体积(即1.1llml)的10XPBS平衡离子浓度。吸取500μ1凝胶溶液放入削掉头部的2ml注射器中，放入37°C培养箱I小时后即可形成脱细胞血管基质凝胶。
[0032]二、脱细胞血管基质凝胶的检测` UHE染色
将脱细胞后的血管小片和上述2ml注射器中形成的脱细胞血管基质凝胶于4%多聚甲醛固定后石蜡包埋，切片脱蜡水化后苏木素染色5分钟，冲洗后盐酸酒精分化数秒，自来水洗返蓝30分钟，伊红染色过夜后乙醇脱水，二甲苯透明后中性树脂封片。
[0033]2、扫描电镜
将上述2ml注射器中形成的脱细胞血管基质凝胶用冷的2.5%戊二醛固定24小时，然后I XPBS漂洗三次，每次30分钟。再经过梯度乙醇脱水(30，50，70，90，100)，每次30分钟，最后放置于100%乙醇中4°C过夜，第二天重新用100%乙醇漂洗3次，每次30分钟。之后用真空干燥箱干燥后离子喷射仪喷金，然后进行扫描电镜(FEI QUANTA 250)观察并拍照。
[0034]3、凝胶胶原纤维直径分析
计算脱细胞血管基质凝胶中的胶原纤维直径时，在脱细胞血管基质凝胶的扫描电镜图上随机挑选100根纤维，通过Image软件测量其直径，最后求其平均值和标准差，并做统计分析。
[0035]4、凝胶吸光度测试
将放在冰上的脱细胞血管基质凝胶样本(包括上述步骤制备的三种脱细胞血管基质凝胶，脱细胞血管基质粉与盐酸溶液比例分别为5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml)各吸取10μ1放入96孔板，每个样本重复6个孔，放入预热到37°C的多功能酶标仪上进行检测(SYNERGY/2MICROPLATE READER, BioTek)，检测405nm吸光度下的数据，每2分钟读取一次，持续60分钟。
[0036]三、实验结果1、脱细胞血管基质粉的制备
根据脱细胞血管基质凝胶的制备模式图(图1)中的方法制备脱细胞血管基质粉，新鲜猪主动脉剪碎后呈红色(图2A)，脱除细胞后外观呈白色(图2B)，HE染色显示细胞脱除干净，剩下基质成份(图2C)，真空冷冻干燥后血管变得硬而干燥(图2D)，用小型粉碎机打碎后呈均匀的白色粉末(图2E)。
[0037]2、脱细胞血管基质凝胶的形成
将上述打碎的脱细胞血管基质粉末打碎后溶于胃蛋白酶溶液中消化72小时候后呈乳白色粘稠状(图2F)，氢氧化钠中和，调节好离子浓度放入37°C培养箱I小时后可见半透明胶冻状半固体形成，具有良好的塑形能力(图3A、3B、4A、4B、5A、5B)。
[0038]3、凝胶HE染色
HE染色可见脱细胞血管基质凝胶内部形成了细胞外基质为主要成份的网络状连接，这样的结构既保持了一定的力学性能，又保证了内部疏松，具有一定的孔隙率(图3C、4C、5C)。
[0039]4、凝胶扫描电镜
扫描电镜结果显示脱细胞血管基质凝胶表面具有良好的胶原纤维结构，呈无序的网格状交叉排布，除胶原的其余基质成份分布其中或者附着在胶原纤维表面(图3D、4D、)。
[0040]5、凝胶胶原纤维直径分析
通过统计，5mg/ml的脱细胞血管基质凝胶胶原纤维直径为5.82037nm±l.39185nm，10mg/ml凝胶胶原纤维直径为5.89368nm±l.25852nm，这两者之间无明显统计学差异(P = 0.3532)，而15mg/ml凝胶的胶原纤维直径为96.27796nm±19.78365nm，与前两者具有明显的统计学差异(P=4.15593E-68 和 1.48086E-68)(图 6)。
[0041 ] 6、凝胶405nm吸光值检测
37°C下，脱细胞血管基质凝胶在405nm处的吸光值结果来看，脱细胞基质逐渐变混浊并呈胶状，20-30分钟左右变得稳定，至60分钟其OD值保持不便(图7)，说明成胶稳定性好。
[0042]实施例2脱细胞血管基质凝胶的制备及检测(二)
一、脱细胞血管基质凝胶的制备
1、制备脱细胞血管基质粉
从屠宰场购买成年猪(约120kg)主动脉，剔除外膜及筋膜成份后剪碎成不规则的血管小片，放置于0.9% Triton X-100溶液中，37°C摇床，200rpm震荡脱细胞处理7天，期间隔天水洗并更换0.9% Triton X-100溶液直至血管片发白为止。将经过脱细胞处理后的血管片放置于一 80°C冰箱冷冻过夜后置于真空冷冻干燥箱(Labconco Triad 2.5L，美国)冷冻干燥，温度一 50°C左右，时间46小时左右，直至血管片变干燥坚硬。然后用小型粉碎机将其打碎成粉，经过60目筛网过滤。
[0043]2、制备脱细胞血管基质凝胶
分别称取50、100、150mg上述步骤I中制备的脱细胞血管基质粉放置于IOml含质量体积浓度为0.09%的胃蛋白酶(P7012-1G，Sigma)的0.009mol/L盐酸溶液中，37°C，360转/分钟磁力搅拌消化78小时后加入1/10体积(即Iml)的0.09mol/L氢氧化钠溶液中和盐酸，然后加入1/8.5体积(即1.176ml)的10XPBS平衡离子浓度。吸取500μ1凝胶溶液放入削掉头部的2ml注射器中，放入37°C培养箱I小时后即可形成脱细胞血管基质凝胶。[0044]二、脱细胞血管基质凝胶的检测 检测方法同实施例1。
[0045]三、实验结果 1、脱细胞血管基质粉的制备
新鲜猪主动脉剪碎后呈红色，脱除细胞后外观呈白色，HE染色显示细胞脱除干净，剩下基质成份，真空冷冻干燥后血管变得硬而干燥，用小型粉碎机打碎后呈均匀的白色粉末。
[0046]2、脱细胞血管基质凝胶的形成
将上述打碎的脱细胞血管基质粉末打碎后溶于胃蛋白酶溶液中消化78小时候后呈乳白色粘稠状，氢氧化钠中和，调节好离子浓度放入37°C培养箱I小时后可见半透明胶冻状半固体形成，具有良好的塑形能力。
[0047]3、凝胶HE染色
HE染色可见脱细胞血管基质凝胶内部形成了细胞外基质为主要成份的网络状连接，具有一定的孔隙率。
[0048]4、凝胶扫描电镜
扫描电镜结果显示脱细胞血管基质凝胶表面具有良好的胶原纤维结构，呈无序的网格状交叉排布，除胶原的其余基质成份分布其中或者附着在胶原纤维表面。
[0049]5、凝胶胶原纤维直径分析
通过统计，5mg/ml的脱细胞血管基质凝胶胶原纤维直径为5.85068nm±l.27134nm，10mg/ml凝胶胶原纤维直径为5.91672nm±l.30861nm,这两者之间无明显统计学差异，而15mg/ml凝胶的胶原纤维直径为95.87289nm±20.34718nm,与前两者具有明显的统计学差
巳
[0050]6、凝胶405nm吸光值检测
37°C下，脱细胞血管基质凝胶在405nm处的吸光值结果来看，脱细胞基质逐渐变混浊并呈胶状，20-30分钟左右变得稳定，至60分钟其OD值保持不便，说明成胶稳定性好。
[0051]实施例3脱细胞血管基质凝胶的制备及检测(三)
一、脱细胞血管基质凝胶的制备
1、制备脱细胞血管基质粉
从屠宰场购买成年猪(约120kg)主动脉，剔除外膜及筋膜成份后剪碎成不规则的血管小片，放置于1.1% Triton X-100溶液中，37°C摇床，200rpm震荡脱细胞处理6天，期间隔天水洗并更换1.1% Triton X-100溶液直至血管片发白为止。将经过脱细胞处理后的血管片放置于一 80°C冰箱冷冻过夜后置于真空冷冻干燥箱(Labconco Triad 2.5L，美国)冷冻干燥，温度一 50°C左右，时间50小时左右，直至血管片变干燥坚硬。然后用小型粉碎机将其打碎成粉，经过60目筛网过滤。
[0052]2、制备脱细胞血管基质凝胶
分别称取50、100、150mg上述步骤I中制备的脱细胞血管基质粉放置于IOml含质量体积浓度为0.11%的胃蛋白酶(P7012-1G，Sigma)的0.01 lmol/L盐酸溶液中，37°C，340转/分钟磁力搅拌消化66小时后加入1/10体积(即Iml)的0.1 lmol/L氢氧化钠溶液中和盐酸，然后加入1/9.5体积(即1.053ml)的10XPBS平衡离子浓度。吸取500μ1凝胶溶液放入削掉头部的2ml注射器中，放入37°C培养箱1.1小时后即可形成脱细胞血管基质凝胶。[0053]二、脱细胞血管基质凝胶的检测 检测方法同实施例1。
[0054]三、实验结果
1、脱细胞血管基质粉的制备
新鲜猪主动脉剪碎后呈红色，脱除细胞后外观呈白色，HE染色显示细胞脱除干净，剩下基质成份，真空冷冻干燥后血管变得硬而干燥，用小型粉碎机打碎后呈均匀的白色粉末。
[0055]2、脱细胞血管基质凝胶的形成
将上述打碎的脱细胞血管基质粉末打碎后溶于胃蛋白酶溶液中消化66小时候后呈乳白色粘稠状，氢氧化钠中和，调节好离子浓度放入37°C培养箱1.1小时后可见半透明胶冻状半固体形成，具有良好的塑形能力。
[0056]3、凝胶HE染色
HE染色可见脱细胞血管基质凝胶内部形成了细胞外基质为主要成份的网络状连接，具有一定的孔隙率。
[0057]4、凝胶扫描电镜
扫描电镜结果显示脱细胞血管基质凝胶表面具有良好的胶原纤维结构，呈无序的网格状交叉排布，除胶原的其余基质成份分布其中或者附着在胶原纤维表面。
[0058]5、凝胶胶原纤维·直径分析
通过统计，5mg/ml的脱细胞血管基质凝胶胶原纤维直径为5.97253nm±l.28240nm,10mg/ml凝胶胶原纤维直径为5.86259nm±l.29851nm,这两者之间无明显统计学差异，而15mg/ml凝胶的胶原纤维直径为94.99804nm±21.01755nm,与前两者具有明显的统计学差
巳
[0059]6、凝胶405nm吸光值检测
37°C下，脱细胞血管基质凝胶在405nm处的吸光值结果来看，脱细胞基质逐渐变混浊并呈胶状，20-30分钟左右变得稳定，至60分钟其OD值保持不便，说明成胶稳定性好。
[0060]对比例I
一、脱细胞血管基质凝胶的制备
1、制备脱细胞血管基质粉
从屠宰场购买成年猪(约120kg)主动脉，剔除外膜及筋膜成份后剪碎成不规则的血管小片，放置于0.85% Triton X-100溶液中，37°C摇床，200rpm震荡脱细胞处理7天，期间隔天水洗并更换0.85% Triton X-100溶液直至血管片发白为止。将经过脱细胞处理后的血管片放置于一 80°C冰箱冷冻过夜后置于真空冷冻干燥箱(Labconco Triad 2.5L,美国)冷冻干燥，温度一 50°C左右，时间46小时左右，直至血管片变干燥坚硬。然后用小型粉碎机将其打碎成粉，经过60目筛网过滤。
[0061]2、制备脱细胞血管基质凝胶
分别称取50、100、150mg上述步骤I中制备的脱细胞血管基质粉放置于IOml含质量体积浓度为0.09%的胃蛋白酶(P7012-lG，Sigma)的0.0009mol/L盐酸溶液中，37°C，360转/分钟磁力搅拌消化78小时后加入1/10体积(即Iml)的0.009mol/L氢氧化钠溶液中和盐酸，然后加入1/8.5体积(B卩1.176ml)的10XPBS平衡离子浓度。吸取500μ1凝胶溶液放入削掉头部的2ml注射器中，放入37°C培养箱I小时后即可形成脱细胞血管基质凝胶。[0062]二、脱细胞血管基质凝胶的检测 检测方法同实施例1。
[0063]三、实验结果
1、脱细胞血管基质粉的制备
HE染色显示细胞脱除不彻底，基质成份中夹杂细胞。
[0064]对比例2
一、脱细胞血管基质凝胶的制备
1、制备脱细胞血管基质粉
从屠宰场购买成年猪(约120kg)主动脉，剔除外膜及筋膜成份后剪碎成不规则的血管小片，放置于1% Triton X-100溶液中，37°C摇床，200rpm震荡脱细胞处理6.5天，期间隔天水洗并更换1% Triton X-100溶液直至血管片发白为止。将经过脱细胞处理后的血管片放置于一 80°C冰箱冷冻过夜后置于真空冷冻干燥箱(Labconco Triad 2.5L，美国)冷冻干燥，温度一 50°C左右，时间48小时左右，直至血管片变干燥坚硬。然后用小型粉碎机将其打碎成粉，经过60目筛网过滤。
[0065]2、制备脱细胞血管基质凝胶
分别称取45mg、155mg上述步骤I中制备的脱细胞血管基质粉放置于IOml含质量体积浓度为0.1%的胃蛋白酶(P7012-lG，Sigma)的0.001mol/L盐酸溶液中，37°C，350转/分钟磁力搅拌消化72小时后加入 1/10体积(即Iml)的0.01mol/L氢氧化钠溶液中和盐酸，然后加入1/9体积(B卩1.1llml)的10XPBS平衡离子浓度。吸取500μ1凝胶溶液放入削掉头部的2ml注射器中，放入37 °C培养箱成胶。
[0066]二、脱细胞血管基质凝胶的检测 检测方法同实施例1。
[0067]三、实验结果
1、脱细胞血管基质凝胶的形成
将上述打碎的脱细胞血管基质粉末打碎后溶于胃蛋白酶溶液中消化72小时候后呈乳白色粘稠状，氢氧化钠中和，调节好离子浓度放入37°C培养箱中成胶。5小时后浓度为
4.5mg/ml的处理仍不能形成胶冻状半固体；1小时后15.5mg/ml的处理可见半透明胶冻状半固体形成，具有良好的塑形能力。
[0068]2、凝胶HE染色
HE染色可见15.5mg/ml的脱细胞血管基质凝胶内部分散有大量颗粒，表明脱细胞血管基质粉未能完全消化。
[0069]对比例3
一、脱细胞血管基质凝胶的制备
1、制备脱细胞血管基质粉
从屠宰场购买成年猪(约120kg)主动脉，剔除外膜及筋膜成份后剪碎成不规则的血管小片，放置于1.1% Triton X-100溶液中，37°C摇床，200rpm震荡脱细胞处理6天，期间隔天水洗并更换1.1% Triton X-100溶液直至血管片发白为止。将经过脱细胞处理后的血管片放置于一 80°C冰箱冷冻过夜后置于真空冷冻干燥箱(Labconco Triad 2.5L，美国)冷冻干燥，温度一 50°C左右，时间50小时左右，直至血管片变干燥坚硬。然后用小型粉碎机将其打碎成粉，经过60目筛网过滤。
[0070]2、制备脱细胞血管基质凝胶
分别称取50、100、150mg上述步骤I中制备的脱细胞血管基质粉放置于IOml含质量体积浓度为0.11%的胃蛋白酶(P7012-1G，Sigma)的0.01 lmol/L盐酸溶液中，37°C，340转/分钟磁力搅拌消化66小时后加入1/10体积(即Iml)的0.1 lmol/L氢氧化钠溶液中和盐酸，然后分别加入1/8.4体积(即1.190ml)、1/9.7体积(即1.031ml)的10XPBS平衡离子浓度。吸取500μ1凝胶溶液放入削掉头部的2ml注射器中，放入37°C培养箱成胶。
[0071]二、脱细胞血管基质凝胶的检测 检测方法同实施例1。
[0072]三、实验结果
1、脱细胞血管基质凝胶的形成
上述处理放入37°C培养箱3小时后仍未见半透明胶冻状半固体形成，可见其塑形能力较差。
[0073]2、凝胶扫描电镜
扫描电镜结果显示脱细胞血管基质凝胶表面胶原纤维结构呈交叉排布，但是有聚集现象，除胶原的其余基质成份分布也出现聚集现象。
[0074]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。`
【权利要求】
1.一种脱细胞血管基质凝胶，其特征在于，它是由以下方法制备得到的: a)制备脱细胞血管基质粉:剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，放置于0.9-1.1% Triton X-100溶液中，震荡脱细胞处理，期间隔天水洗并更换0.9-1.1% TritonX-100溶液；再将脱细胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷冻过夜后置于真空冷冻干燥箱冷冻干燥直至血管片变干燥坚硬；打碎成粉，60目筛网过滤； b)取步骤a)制备的脱细胞血管基质粉放置于含浓度为0.09-0.11%的胃蛋白酶的0.009-0.011mol/L盐酸溶液中，磁力搅拌消化66-78小时，加入氢氧化钠溶液中和盐酸，然后加入PBS平衡离子浓度，最后将凝胶溶液放入37°C培养箱中成胶；其中，所述的脱细胞血管基质粉与盐酸溶液的比例是5-15mg/ml，所述的氢氧化钠溶液中氢氧化钠摩尔量与盐酸溶液中盐酸摩尔量相等，所述的PBS与盐酸溶液的比例为1: (850-950)mol/mL。
2.根据权利要求1所述的脱细胞血管基质凝胶，其特征在于，它是由以下方法制备得到的: a)制备脱细胞血管基质粉:剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，放置于1%Triton X-100溶液中，震荡脱细胞处理，期间隔天水洗并更换1% Triton X-100溶液；再将脱细胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷冻过夜后置于真空冷冻干燥箱冷冻干燥直至血管片变干燥坚硬；打碎成粉，60目筛网过滤； b)取步骤a)制备的脱细胞血管基质粉放置于含浓度为0.1%的胃蛋白酶的0.01mol/L盐酸溶液中，磁力搅拌消化72小时， 加入氢氧化钠溶液中和盐酸，然后加入PBS平衡离子浓度，最后将凝胶溶液放入37°C培养箱中成胶；其中，所述的脱细胞血管基质粉与盐酸溶液的比例是5-15mg/ml，所述的氢氧化钠溶液中氢氧化钠摩尔量与盐酸溶液中盐酸摩尔量相等，所述的PBS与盐酸溶液的比例为l:900mol/mL。
3.根据权利要求1或2所述的脱细胞血管基质凝胶，其特征在于，所述的震荡脱细胞处理具体是在37°C摇床,200rpm的条件下处理6_7天。
4.根据权利要求1或2所述的脱细胞血管基质凝胶，其特征在于，所述的将凝胶溶液放入37°C培养箱中成胶具体是将凝胶溶液放入37°C培养箱中至少I小时。
5.一种脱细胞血管基质凝胶的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤: a)制备脱细胞血管基质粉:剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，放置于0.9-1.1% Triton X-100溶液中，震荡脱细胞处理，期间隔天水洗并更换0.9-1.1% TritonX-100溶液；再将脱细胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷冻过夜后置于真空冷冻干燥箱冷冻干燥直至血管片变干燥坚硬；打碎成粉，60目筛网过滤； b)取步骤a)制备的脱细胞血管基质粉放置于含浓度为0.09-0.11%的胃蛋白酶的0.009-0.011mol/L盐酸溶液中，磁力搅拌消化66-78小时，加入氢氧化钠溶液中和盐酸，然后加入PBS平衡离子浓度，最后将凝胶溶液放入37°C培养箱中成胶；其中，所述的脱细胞血管基质粉与盐酸溶液的比例是5-15mg/ml，所述的氢氧化钠溶液中氢氧化钠摩尔量与盐酸溶液中盐酸摩尔量相等，所述的PBS与盐酸溶液的比例为1: (850-950)mol/mL。
6.根据权利要求5所述的的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤: a)制备脱细胞血管基质粉:剔除血管外膜及筋膜成份后剪碎成血管小片，放置于1%Triton X-100溶液中，震荡脱细胞处理，期间隔天水洗并更换1% Triton X-100溶液；再将脱细胞后的血管小片置于一 80°C冰箱冷冻过夜后置于真空冷冻干燥箱冷冻干燥直至血管片变干燥坚硬；打碎成粉，60目筛网过滤； b)取步骤a)制备的脱细胞血管基质粉放置于含浓度为0.1%的胃蛋白酶的0.01mol/L盐酸溶液中，磁力搅拌消化72小时，加入氢氧化钠溶液中和盐酸，然后加入PBS平衡离子浓度，最后将凝胶溶液放入37°C培养箱中成胶；其中，所述的脱细胞血管基质粉与盐酸溶液的比例是5-15mg/ml，所述的氢氧化钠溶液中氢氧化钠摩尔量与盐酸溶液中盐酸摩尔量相等，所述的PBS与盐酸溶液的比例为l:900mol/mL。
7.根据权利要求5或6所述的的制备方法，其特征在于，所述的震荡脱细胞处理具体是在37°C摇床，200rpm的条件下处理6-7天。
8.根据权利要求5或6所述的的制备方法，其特征在于，所述的将凝胶溶液放入37°C培养箱中成胶具体是将凝胶溶液放入37°C培养箱中至少I小时。
9.权利要求1或2所述的脱细胞血管基质凝胶的用途，其特征在于，所述的用途选自: a)制备治疗缺血性疾病的药物， b)作为组织工程的支架材料，和/或 c)制备细胞培养用的培养基。
【文档编号】A61L27/36GK103705542SQ201310642466
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】付炜, 冯蓓, 殷猛, 王伟 申请人:上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心