Hat乙酰化启动子和其组合物在促进免疫原性中的用途
【专利摘要】本发明提供通过提高TAP-1表达而增强通过细胞毒性T-淋巴细胞检测的MHC1类表面分子的呈递来提高TAP-1表达缺陷细胞免疫原性的方法和组合物，其包含向TAP-1表达缺陷细胞投与TAP-1表达增加量的生物可接受物质以促进所述细胞中TAP-1基因的转录从而增强所述细胞的MHC1类表面表达。所述生物可接受物质可为组蛋白H3脱乙酰酶抑制剂，例如曲古抑菌素A、具有内在组蛋白乙酰基转移酶活性的转录辅激活因子或包含CBP/p300蛋白质家族中至少一个成员的组蛋白乙酰基转移酶。所述方法和组合物可提高靶细胞(例如肿瘤细胞)的免疫原性以促进细胞毒性淋巴细胞对所述靶细胞的破坏。
【专利说明】HAT乙酰化启动子和其组合物在促进免疫原性中的用途
[0001]本申请是申请号为200880007361.1、申请日为2008年I月21日、发明名称为“HAT乙酰化启动子和其组合物在促进免疫原性中的用途”的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及医药组合物及其在医学治疗中的用途。更具体来说，其涉及增强患者体内所选细胞的免疫原性，由此使所述细胞对身体免疫系统的识别和消除更敏感的组合物和医学治疗。
【背景技术】
[0003]细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)反应是免疫系统的主要组成部分，其在对表面上表达外源抗原的已感染细胞或恶性细胞和侵入有机体进行的免疫监督和免疫破坏中发挥作用。抗原特异性T-细胞受体的配体是由外源抗原肽片段结合主要组织相容性复合物(MHC)分子构成的复合物。细胞毒性T淋巴细胞识别与MHC I类分子结合的肽，所述分子通常在细胞表面上作为包括肽部分的三元复合物来表达。三元复合物的形成涉及将细胞质中因蛋白质降解而生成的肽转运至内质网腔中。
[0004]已鉴定出两个位于MHC区域中的基因且其在此细胞质肽转运中发挥作用，即TAP-1 和 TAP-2。
[0005]先前技术概述
[0006]美国专利第6, 361,770号，杰弗単(Tefferies)等人,在2002年3月26日颁布，其教示通过将编码并表达TAP-1或TAP-2的核酸序列引入靶细胞中而在靶细胞表面上增强MHC I类分子表达的方法。靶细`胞中TAP-1或TAP-2的表达可增强MHC I类表面分子在靶细胞上的呈递，从而使得其可通过免疫系统的CTL来检测并消除。所述方法尤其可用于与肿瘤细胞相关的情况，其缺少蛋白酶体组份而使得其TAP表达低于正常量并且因此不能表达充足的可通过CTL识别的MHC I类表面分子。通过添加核酸序列增强TAP的原位表达，可使靶细胞经历免疫系统CTL的识别和作用。
[0007]已知染色质结构的调节在基因表达控制中具有重要作用。染色质结构调整中所涉及的基因失调节与细胞不受控生长、宿主免疫监督逃避和肿瘤发生密切相关。
【发明内容】
[0008]现已发现，染色质重建在与抗原加工(TAP)-1 (抗原加工机构的重要组份)相关的转运蛋白调节中具有一定作用。先前已显示染色质模板中、尤其乙酰化敏感启动子近端区域处高水平的乙酰化核心组蛋白与转录活性位点相关，且因此现已确定组蛋白H3乙酰化在TAP-1转录调节中具有重要作用。具体来说，已发现高特异性组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古抑菌素A可在癌细胞中十分有效地促进TAP-1转录和表面MHC I类呈递，从而使其免疫原性增强。据显示TAP-2、泰帕森(Tapasin)、MHC 1、LMP2，7等都可通过TSA来上调。
[0009]因此根据本发明的第一方面，提供藉助提高通过细胞毒性T-淋巴细胞检测的MHCI类表面分子的呈递来增强细胞免疫原性的方法，其包含向细胞投与有效量的生物可接受物质，所述物质可促进细胞中的基因转录而导致细胞MHC I类表面表达增强。
[0010]根据第二方面，本发明提供投与哺乳动物以增强其细胞MHC I类表面表达的医药组合物，所述组合物包含生物可接受物质和适宜佐剂或载剂，所述生物可接受物质可促进细胞中TAP-1基因转录或MHC I类表达中所涉及其它基因的转录，从而使细胞MHC I类表面表达增强。
[0011]本发明另一方面提供TAP-1表达增加量的物质和适宜佐剂或载剂在制备或制造投与哺乳动物的组合物中的用途，所述哺乳动物患有涉及过量TAP-1表达缺陷细胞的病症，且所述物质可促进细胞中TAP-1基因的转录从而使细胞MHC I类表面表达增强。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图中的附图1-8是自下文以一定详细程度阐述和论述的各个具体实验性实例所获得结果的图示和图解代表。
[0013]图9提供以下证据:在C57B1/6小鼠而非免疫缺陷型Ragl+小鼠中，体内TSA处理可抑制源自TAP缺陷型细胞的肿瘤生长。
[0014]本发明进一步阐述于下文“实验程序”和“实例”部分中。
【具体实施方式】
[0015]根据优选实施例，生物可接受物质係组蛋白H3脱乙酰酶抑制剂，例如异羟肟酸基组蛋白H3脱乙酰酶抑制剂；组蛋白乙酰基转移酶、或具有内在组蛋白乙酰基转移酶活性的转录辅激活因子。
[0016]根据具体优选实施例，物质为曲`古抑菌素A、或包含CBP/p300蛋白质家族至少一个成员的组蛋白乙酰基转移酶。
[0017]尽管本发明不欲受任何据信用于发挥作用的作用机制或生化机制的特定理论束缚，但提供并假定以下内容以更好地理解本发明及其实践。
[0018]癌中的TAP-1转录损伤可能是由TAP-1启动子区域周围致密核小体结构形成的物理屏障所导致，此可阻止通用转录因子和RNA聚合酶II到达基因启动子。如上所述，已显示染色质模板中、尤其乙酰化敏感启动子近端区域处的高水平的乙酰化核心组蛋白与转录活性位点相关。提高若干鼠类癌细胞系TAP-1启动子中的组蛋白H3乙酰化水平显示，组蛋白H3乙酰化在TAP-1转录调节中具有一定作用。尽管组蛋白H3并非唯一一类显示修饰在各种基因表达中具有一定作用的核心组蛋白，但组蛋白H3尾乙酰化与各基因活化之间的关联已得到广泛研究并且现在被广为接受。Tap-2和泰帕森等也可以此方式来调节。
[0019]用于本发明的优选组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)是高特异性曲古抑菌素A (TSA)。TSA属于选择性作用于基因的异羟肟酸基组蛋白脱乙酰酶抑制剂类别，其在培养肿瘤细胞中仅改变约2%经表达基因的转录并且赋予体外和体内抗癌效应。
[0020]本发明方法一般适用于表现TAP-1表达缺陷的哺乳动物细胞，包括恶性细胞、病毒感染细胞和细菌感染细胞。最优选地是用于在恶性肿瘤细胞、尤其黑色素瘤细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞和子宫颈癌细胞中增强TAP-1表达。由于癌细胞表达乳头状瘤EE6和E7基因，因此可通过本发明使得可增强对乳头状瘤病毒抗原的识别。由于乳头状瘤是疱疹病毒，因此预测此方法可用于所有疱疹病毒。
[0021]可通过各种途径将本发明组合物投与患者，前提是其能到达TAP表达缺陷细胞位点。所述途径包括静脉内、肌内、腹膜腔内、经口、经鼻、非经肠、肿瘤内以及离体用所述化合物处理肿瘤或树突细胞然后再将其引入患者中等途径。通过患者情况和所治疗病症的严重程度来确定适宜剂量，并且主治医师可根据与其它恶性肿瘤治疗药物的类比来确定。
[0022]本发明组合物特别优选的用途是作为与已知癌症、细菌感染、原生动物和病毒感染治疗相关的佐剂。在将本发明组合物作为佐剂与诸如疫苗等其它医药有效治疗物一起使用时，预期可将达成有效性所需疫苗量降低许多倍。
[0023]实骀稈序
[0024]细朐系和试剂
[0025]在此研究中，使用3种细胞系:TC_1、TC-1/D11和TC-1/A9作为HPV阳性癌模型。TC-1细胞系是通过用HPV16E6和E7癌基因和活化H_ras转化鼠类初代肺细胞来产生的
[I]。TC-1/D11和TC-1/A9是TAP-1和MHC I类下调的TC-1细胞的无性系[2]。也可使用鼠类初代前列腺癌细胞系PA和其转移性TAP-和MHC I类-缺陷型衍生物LMD [3]。
[0026]Dr.T.C.Wu提供通过用HPV16E6和E7癌基因和活化Η-ras转化C57BL/6初代肺细胞来产生的TC-1细胞系，约翰霍普金斯大学(Johns Hopkins University),巴尔的摩(Baltimore)，MD [7]。Μ. 斯马海尔博士 (Dr.M.Smahe I)提供 TC-1/D11 和 TC-1/A9 细胞系，血液学和输血研究所(Institute of Hematology and Blood Transfusion),布拉格(Prague)，捷克共和国(Czech Republic) [12]。在本文中 TC-1/D11 和 TC-1/A9 分别缩写为Dll和A9。CMT.64细胞系是自C57BL/6小鼠的自发肺癌来建立[4]。Ltk( = L-M(TK-))成纤维细胞细胞系得自C3H/An小鼠(ATCC，玛纳萨斯(Manassas)，VA)。所有上述细胞系都是在DMEM培养基中生长。在RPMI1640培养基中维持分别得自129/Sv小鼠初代和转移性前列腺癌的PA和LMD细胞系(T.C.汤普森(T.C.Thompson)博士惠赠，贝勒医学院(Baylor College of Medicine),休斯顿(Houston), TX) [3]以及都得自 C57BL/6 小鼠的B16F10(B16)黑色素瘤[5]和RMA淋巴瘤[6]细胞系。RPMI1640和DMEM培养基补加有10%热灭活胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μ g/ml链霉素、和IOmMHEPES0对于TC-UDll和A9细胞，将一毫摩尔丙酮酸钠和0.4mg/ml G418也添加至DMEM培养基中。细胞未经处理或经100ng/ml TSA(西格玛(Sigma),圣路易斯(St.Louis) ,MO)处理 24 小时(CMT.64、B16、PA 和 LMD)或处理 48 小时(TC_1、D11 和 A9)，或经 50ng/ml IFN-Y处理48小时。
[0027]反转录-PCR分析.[0028]用于PCR扩增的引物(西格玛-吉诺斯(Genosys)，奥克维尔(Oakville)，ON和集成 DNA 技术公司(Integrated DNA Technologies) (IDT),珊瑚村(Coralville), IA)列于表I中。总细胞RNA是使用三唑(Trizol)试剂(英杰(Invitrogen),伯灵顿(Burlington),ON)来提取并通过用DNasel (安便(Ambion)公司，奥斯汀(Austin)，TX)处理RNA样品来去除污染DNA。使用来自英杰的反转录试剂盒以20 μ I的总体积对I μ g总细胞RNA实施反转录。在含有Ix PCR缓冲液、250 μ M脱氧核苷三磷酸、1.5mM MgCl2、0.2 μ M各种引物和2.5单位Taq或钼Taq DNA聚合酶的总共50 μ I反应混合物中使用2ul等份的cDNA作为PCR模板。所有PCR试剂都得自英杰和弗门特斯(Fermentas)，伯灵顿，ON。cDNA扩增是使用特异性引物组在T梯度热循环仪(拜耳麦特(Biometra),哥廷根(Goettingen),德国)中进行，其中进行25-35轮变性(lmin，95°C )、复性(lmin，54_64°C )、和延长(2min，72°C )的循环。以在72°C下最后延伸IOmin来终止循环。在琼脂糖凝胶上分析20微升扩增产物，用溴乙啶染色并在UV光下拍照。
[0029]实时定量PCR分析.[0030]在此研究中，采用此方法来定量在染色质免疫沉淀分析中与抗体共沉淀的内源性TAP-1启动子的水平并定量在稳定转染细胞中整合的pTAPMuc构建物的拷贝数。使用基因组DNA作为扩增模板，其中在总共IOul反应混合物中使用200-500nM各种引物和1μ ISYBR绿色Taq预混合物(Green Taq ReadyMix)(罗氏(Roche))。使用罗氏荧光定量PCR态度分析仪(LightCycler)实施37轮变性(5秒，95°C )、复性(5秒，61-63。。)、和延长(20秒，72°C)的循环。
[0031]染色质免疫沉淀分析.[0032]如先前所述实施使用7xl06细胞/样品的染色质免疫沉淀实验[7]。使用5微克抗RNA pol II (N-20, sc-899,圣塔克鲁斯生物技术(Santa Cruz Biotechnologies),圣塔克鲁斯(Santa Cruz), CA)、抗乙酰基-组蛋白H3(北部生物技术(Upstate Biotechnology)公司，普莱西德湖城(Lake Placid), NY)或抗CBP (A_22，sc_369，圣塔克鲁斯)多克隆抗体(Ab)来实施免疫沉淀。使用TAP-1启动子特异性引物通过实时PCR来定量鼠类TAP-1启动子或与各样品抗体共免疫沉淀的水平。如果使用抗RNA pol II或抗乙酰基-组蛋白H3抗体来使模板免疫共沉淀，则PCR使用对TAP-1启动子3'末端具有特异性的引物，而如果使用抗CBP抗体来使模板免疫共沉淀，则使用5'末端特异性引物。使用含有鼠类TAP-1启动子的质粒的连续稀释来生成使用TAP-1启动子特异性引物组的标准曲线。
[0033]质粒构造
[0034]含有由TAP-1启动子(pTAPl-EGFP)驱动的EGFP基因的质粒是如先前所述来构造
[8]。含有由TAP-1启动子(pTAPl-luc)驱动的萤光素酶基因的类似构建物是通过将TAP-1启动子插入pGL4.14[luc2/`Hygro]载体(普洛麦格(Promega),麦迪森(Madison), WI)的Sac I与Bgl II位点之间来产生。若干种截短TAP-1启动子构建物也是通过将其5'末端截短物克隆至PGL4.14[luc2/Hygro]载体中来制备。用于全TAP-1启动子和其截短物的PCR扩增的引物列于表1中。
[0035]转染和选择
[0036]使用ExGen500体内转染试剂(弗门特斯)以TAP-1启动子构建物或无启动子pGL4.14[luc2/Hygro]载体来转染TC-1、Dll、A9、PA和LMD细胞。在转染后12-72小时之间分析瞬时转染子。为获得稳定转染子，经3周在以下浓度的潮霉素B(西格玛)存在下选择经转染细胞:550ng/ml用于TC-1细胞，250ng/ml用于Dll、A9和LMD细胞，200ng/ml用于PA细胞。
[0037]萤光素酶分析.[0038]在转染后12-72小时之间通过双萤光素酶分析(普洛麦格)来分析瞬时转染子中的相对萤光素酶活性(RLA)。稳定转染子(转染后3周-1个月)中的RLA是通过明亮(Bright-Glo)萤光素酶分析(普洛麦格)来评估，并且通过以下方式来确定:自单独用无启动子pGL4.14[luc2/Hygro]载体转染获得的对应值减去所述结果，并且用整合至各稳定转染子基因组中的质粒拷贝数来将所述值进一步标准化。
[0039]西方点溃.[0040]通过6 % (p300、CBP和TAP-1)或15 % (P-肌动蛋白和乙酰基-组蛋白H3)SDS-PAGE来分离50微克蛋白质/样品。将蛋白质转移至硝化纤维素膜(伯乐(Bio-rad),海克里斯(Hercules)，CA)上。用存于PBS中的5%脱脂乳封阻印迹并与适宜Ab稀释物一起培养。在这些研究中使用以下兔多克隆Ab:抗小鼠TAP-1(李林达(Linda Li)在杰弗里实验室(Jefferies Lab)中制造)；抗乙酰基_组蛋白H3 (北部生物技术公司)；抗p300 (C-20, sc-585，圣塔克鲁斯);抗CBP (A-22，sc-369，圣塔克鲁斯)。所用二级Ab是HRP偶联的山羊抗兔二级Ab (杰克逊免疫研究实验室(Jackson Immunoresearch Lab.),西林(West Grove),PA)。对于内参照,使用抗β _肌动蛋白小鼠单克隆Ab (西格玛)，之后使用HRP偶联的山羊抗小鼠二级Ab (皮尔斯(Pierce),罗克福德(Rockford), IL)。使用鲁米(Lumi)-光试剂(皮尔斯)来使印迹显影。
[0041]细胞毒性分析.[0042]CTL效应细胞是通过用水疱性口炎病毒(VSV)的1*107TCIP对C57B16小鼠实施注射来生成。在7天后收集脾脏，将其匀浆化并在CTL培养基(含有10% FBS(海克隆(Hyclone) ),20mM HEPES、I % NEAA、I %丙酮酸钠、I % L-谷氨酰胺、I %青霉素/链霉素和
0.1 % 2-ME 的 RPM1-1640)中与 I μ M VSV-NP肽(RGYVYQGL) —起培养 5 天。用 IFN- y (50ng/ml)将TC-1、Dll和A9细胞处理48小时，将TSA(100ng/ml)处理24小时或使其保持未经处理状态，之后用VSV以7.5的MOI感染16小时。用PBS洗涤细胞并通过将10种细胞与100 μ Ci51Cr (呈铬酸钠形式；阿莫仙(Amersham),阿林顿山(Arlington Heights), IL)在250 μ I CTL培养基中一起培养I小时来载入51Cr。在用PBS洗涤三次后，以所示比率将靶细胞与效应细胞一起培养4hr。收集IOOul来自各孔的上清液并通过Y -计数器(LKB仪器公司，盖瑟斯堡(Gaithersburg) ,MD)测量51Cr释放。如下所述计算指定51Cr释放:((实验值-培养基对照值)/(总值-培养基对照值))xl00%。通过用5%特里同(Triton)X-1OO溶液溶解细胞来获得总释放。
[0043]HPV阳性癌症异种移植物的建立和用曲古抑菌素A处理。
[0044]将存于PBS中的总计3xl0`5个TC-1或A9细胞同时注射至七周龄雌性C57BL/6同源小鼠(查尔斯河(Charles River),圣康斯坦(St.Constant), QC)中。将小鼠分为3组，每组4只动物。使TSA于DMSO中溶解至浓度为0.2mg/ml。经20天通过腹膜腔内注射施用使用50 μ I TSA (500 μ g/kg)或DMSO (媒剂对照)的每日处理，此是在注射肿瘤细胞后7天开始进行。每周对小鼠实施称重，并在整个实验过程中监测其行为和食物摄入。每周对肿瘤实施3次测量并使用下式来计算肿瘤体积:肿瘤体积=长度X宽度X高度X π /6 [32]。通过用DMSO媒剂对照处理的Α9组中肿瘤的大小来确定研究时间段。
[0045]实验结果:
[0046]实例 L
[0047]使用上述试剂和程序表明，小鼠前列腺癌模型和HPV阳性癌模型中的EP-1mRNA表达与其表面MHC I类表达相关。
[0048]人们证实，在所用两组细胞系(小鼠前列腺癌和HPV阳性癌模型)中TAP-1表达水平与MHC I类表面表达水平相关。这些结果展示于图1中。在转染子变稳定后，受TAP-1启动子控制的萤光素酶基因表达一般与内源TAP-1水平相匹配。图1A展示分别通过RT-PCR和流式细胞仪对TAP-1和表面MHC I类表达进行的分析。阴影区、细线和粗线分别代表低(A9或LMD)、中(Dll)和高(TC-1或PA)水平MHC I类表达。在RT-PCR分析中使用P-肌动蛋白cDNA的扩增作为内部对照。数据为三次实验的代表。图1B-瞬时转染子中的相对萤光素酶活性(RLA)是在转染后12-72小时内通过双萤光素酶分析来评估。稳定转染子(转染后3周-1个月)中的RLA是通过以下方式来确定:自单独用无启动子pGL4.14[luc2/Hygro]载体转染获得的对应值减去所述结果，并用整合至各稳定转染子基因组中的质粒拷贝数来将所述值进一步标准化。任意将最小值确定为I。柱:四至六次实验的平均值；条:SEM。在前列腺癌模型中，所表达表面MHC I类水平高于LMD细胞的PA细胞也表达较高水平的TAP-1。类似地，在HPV阳性癌模型中，TC-UDll和A9细胞分别表达高、中和低水平的表面MHC I类，其也以与MHC I类水平相同的顺序表达TAP-1。
[0049]实例 2.[0050]人们研究了染色质重建在TAP-1转录调节中的作用。先前通过荧光显微法和流式细胞仪进行的观察显示，在用含有由TAP-1启动子驱动的EGFP基因的报道分子构建物转染若干组TAP表达和TAP缺陷型细胞系数天后，TAP缺陷型组的多种细胞表达相对于TAP表达组中大多数细胞(数据未显示)类似或甚至较高水平的EGFP，而稳定转染子中的EGFP表达水平与内源TAP-1表达谱相匹配(赛特雅迪(Setiadi)等人,癌症研究(Cancer Res),65, 7485-7492) ο在此实验中，通过克隆pGL4.14[luc2/Hygro]载体中Iuc基因上游的小鼠TAP-1启动子(pTAPl-luc)生成萤光素酶报道分子构建物并且将构建物转染至细胞系中。根据先前对EGFP水平进行的观察，发现稳定转染子中Iuc基因的表达水平与内源TAP-1表达谱的相匹配程度高于瞬时转染子，但前列腺癌模型除外，其显示瞬时和稳定转染子的表达与内源TAP-1表达具有同等程度的匹配谱。此展示于图1B中。此外，在具有低TAP-1表达水平的细胞中结合至TAP-1启动子的RNA聚合酶II (pol II)水平相对低于具有较高TAP-1表达水平的细胞中的所述酶,如图2中所示。通过染色质免疫沉淀分别使用抗RNA pol II或抗乙酰基-组蛋白H3抗体来评估各细胞系TAP-1启动子中RNA Pol II或乙酰基-组蛋白H3的水平。纯化所洗脱DNA 片段并在使用对TAP-1启动子3'末端具有特异性的引物的实时PCR分析中使用所述DNA片段作为模板。相对RNA pol II或乙酰基-组蛋白H3水平是通过经洗脱TAP-1启动子的拷贝数与对应输入物的拷贝数之比来确定。任意将最小比率确定为I。柱:三至六次实验的平均值；条=SEM0 *与在相同分析中表达较高MHC I类的细胞相比，P <.05。
[0051]这些结果表明由于启动子已整合至基因组中，因此存在可阻碍通用转录因子和RNA pol II到达TAP-1启动子的物理屏障。LMD细胞可能具有其它缺陷在与染色质重建无关的因素中，此可损害由TAP-1启动子驱动的基因转录。
[0052]实例3组蛋白H3乙酰化在MHC I类缺陷型癌的TAP-1启动子中较低的实证.[0053]此实验研究在鼠类前列腺和子宫颈癌细胞系的TAP-1启动子中组蛋白H3乙酰化的水平，以确定组蛋白H3乙酰化在TAP-1转录调节中的作用。尽管组蛋白H3并非唯一一类在别处显示修饰在各种基因表达中具有一定作用的核心组蛋白，但由于组蛋白H3尾乙酰化与各种基因活化之间的关联已被广泛研究且现已被广泛接受[9，10，11]，因此此实验研究其乙酰化状态。[0054]根据TAP-1启动子中的RNA pol II水平和TAP-1转录水平(图1和2)，人们发现在表达较低TAP-1水平的细胞的TAP-1启动子中乙酰基-组蛋白H3的水平较低(图2)。因此发现在HPV阳性癌模型中，与TC-1和A9相比表达中等水平TAP-1的Dll细胞在TAP-1启动子中具有中等水平的乙酰基-组蛋白H3。在前列腺癌模型中，转移性TAP缺陷型LMD细胞所具有的结合至TAP-1启动子的乙酰基-组蛋白H3也少于初代细胞PA。同样测试若干种其它TAP表达(Ltk和RMA)和TAP缺陷型(CMT.64和B16)细胞系TAP-1启动子中的乙酰基-组蛋白H3水平，并且发现在Ltk和RMA中乙酰基-组蛋白H3水平高于CMT.64和B16(数据未显示)。
[0055]实例4-曲古抑菌素A (TSA)，即组蛋白脱乙酰酶抑制剂处理在TAP-1和其它抗原加工机构(APM)组份表达中的效应。
[0056]由于TAP-1启动子中低水平的组蛋白H3乙酰化似乎有助于癌中的TAP-1缺陷，故实施进一步研究以确定用TSA处理TAP缺陷型癌细胞是否会提高细胞中的TAP-1表达。结果展示于图3中。通过染色质免疫沉淀分别使用抗RNA pol II或抗乙酰基-组蛋白H3抗体来评估各细胞系TAP-1启动子中的RNA Pol II或乙酰基-组蛋白H3水平。纯化所洗脱DNA片段并在使用对TAP-1启动子3'末端具有特异性的引物的实时PCR分析中使用所述DNA片段作为模板。相对RNA pol II或乙酰基-组蛋白H3水平是通过经洗脱TAP-1启动子的拷贝数与对应输入物的拷贝数之比来确定。任意将最小比率确定为I。柱:三至六次实验的平均值；条:SEM。*与在相同分析中表达较高MHC I类的细胞相比，P <.05。
[0057]图3中的染色质免疫沉淀结果表明，在大多数细胞系中、尤其在TAP缺陷型细胞中，TSA处理增强RNA pol II复合物到TAP-1启动子的募集。在HPV阳性癌模型和前列腺癌模型二者中，TSA处理将结合至TAP缺陷型细胞TAP-1启动子的RNA pol II水平提高至与TAP表达细胞类似的水平。
[0058]除了结合至TAP`-1启动子的RNA pol II有所增加(已知此为起始转录过程的重要事件)以外，TAP缺陷型细胞中的TAP-1启动子活性(根据经pTAPl-luc构建物稳定转染的细胞中的Iuc表达来测量)在用TSA处理后也得到显著提高(图3)。然而，染色质免疫沉淀分析显示，TSA处理不能显著改变所有测试细胞系的TAP-1启动子中的乙酰基-组蛋白H3水平(图3)。此表明TSA增强TAP-1启动子活性的作用并非是由于直接改良TAP-1启动子自身中的乙酰基-组蛋白H3的水平而发生。
[0059]附图中的图4展示TSA处理在MHC I类抗原呈递中的效能。
[0060]A，在所有细胞系中、尤其在TAP缺陷型癌中，用TSA处理上调了 TAP-1和若干种其它APM组份的表达。使用来自IFN-Y处理细胞的APM cDNA的扩增作为阳性对照。使用β-肌动蛋白表达作为内参照。数据为三次实验的代表。
[0061]B,通过TSA处理来增强尤其在MHC I类缺陷型细胞上的表面H_2Kb表达。用PE偶联的抗H-2KbmAb对未经处理的细胞(阴影区域)或经100ng/ml TSA(粗线)处理的细胞或经50ng/ml IFN-Y处理的细胞(细线)实施染色。数据为三次实验的代表。
[0062]RT-PCR和西方点溃分析也显示，TAP-1的表达在TSA处理后上调(图4A)。对HPV阳性癌细胞系中若干种其它APM组份实施的额外RT-PCR分析也表明，尤其在TAP缺陷型细胞中的LMP-2、TAP-2和泰帕森的表达在TSA处理后发生上调(图4A)。同样观察到，在TC-U Dll和A9细胞(分别为高、中和低)中LMP-2和TAP-2基因具有与TAP-1基因类似的表达模式，并且也可由TSA和IFN- Y来诱导(图4A)。
[0063]使用经20-200ng/ml TSA预处理24_48小时的细胞溶解产物对TAP-1表达实施西方点溃分析，并且来自经100ng/ml TSA处理24小时(PA和LMD)或48小时(TC-K Dll和A9)的细胞的代表性数据展示于图4A中。分析显示，在增加TSA的处理剂量后，在TAP缺陷型细胞的全细胞溶解产物中TAP-1表达水平有所提高，同时乙酰基-组蛋白H3积累也有所增加(数据未显示)。在LMD、CMT.64和B16中导致TAP-1表达的最佳诱导的最佳处理剂量和时间段是以100ng/ml处理24小时，而Dll和A9细胞需要用相同TSA剂量处理48小时。
[0064]实例5
[0065]此实验表明，TSA处理可提高表面MHC I类的表达和CTL对癌细胞的杀灭。
[0066]由于若干种抗原加工组份的表达在TSA处理后提高，因此研究所述处理是否能进一步提高癌细胞系中表面MHC I类表达的水平。此可潜在地增强肿瘤抗原呈递并随后增强CTL对癌细胞的杀灭。流式细胞分析显示，TSA处理可将MHC I类缺陷型细胞中的H-2Kb表面表达提高约10倍，而在原本即表达高水平表面H-2Kb的PA和TC-1细胞中所述水平保持不变(图4B)。IFN- Y处理可在所有细胞系中提高表面H-2K表达。在TAP缺陷型肺癌(CMT.64)和黑色素瘤(B16)中同样观察到TSA对MHC I类表达的类似诱导(数据未显示)。
[0067]附图5中展示以下事实:TSA处理可增强CTL对肿瘤细胞的杀灭并在体内抑制肿瘤生长。
[0068]A，未感染或VSV感染的TC-1、Dll和A9细胞的CTL识别，所述细胞在用VSV感染前未经处理或经TSA或IFN- Y处理48小时。所有细胞皆经VSV以7.5的MOI感染16hr。柱:三次实验的平均值；条:SEM。
[0069]B,与用DMSO媒剂对照处理的小`鼠相比，在每天用500 μ g/kg TSA处理的小鼠中A9 (MHC I类缺陷型细胞)肿瘤生长受到抑制(η = 4/处理组)。TC-1组代表注射有高MHCI类表达细胞的小鼠中的肿瘤生长(η = 4)。数据代表平均肿瘤体积土SHM。
[0070]此外，实施CTL分析以测试在TSA处理后细胞中提高水平的表面H_2Kb表达是否可继而促进VSV特异性细胞毒性T淋巴细胞对VSV感染癌细胞的识别和杀灭。源自靶细胞VSV感染的肽可在Kb背景下呈递。使用0.8:1至200:1的效应细胞:靶细胞比率实施CTL分析，并且以22:1的效应细胞:靶细胞比率(使用TC-UDll和A9作为靶细胞)获得的代表性数据展示于图5A中。结果显示，CTL对所表达表面Kb低于TC-1的Dll和A9细胞的杀灭程度较低。在癌细胞的VSV感染之前用TSA处理24小时可分别将CTL对感染病毒的TC-UDll和A9细胞的杀灭增强约1.4、6和7倍。IFN- Y处理导致对所有VSV感染细胞系的杀灭水平的最大诱导。在使用VSV感染CMT.64和B16作为靶细胞的CTL分析中也观察到类似趋势(数据未显示)。在VSV感染之前将CMT.64和B16细胞用TSA处理24小时可分别将杀灭水平增强5和20倍。尽管IFN- Y诱导APM和MHC I类表达，但LMD细胞由于独立于MHC I类表达的未知机制而保持对CTL杀灭的抗性(参见李(Lee)，H.M.等人，癌症研究.60，1927-33)。
[0071]实例6-TSA处理在体内抑制肿瘤牛长.[0072]在体外培养TC-1和A9细胞并且使其传代少于8次，之后将每组3xl05个细胞以皮下方式注射至7周龄雌性C57BL/6同源小鼠中。由于动物开始长出明显A9肿瘤，因此在细胞注射后第7天开始，每天用TSA或DMSO媒剂对照处理。选择500 μ g/kg TSA/动物/天的剂量，这是因为其它人可使用此剂量成功地抑制鼠类肿瘤模型中其它类型肿瘤的生长-例如参见凯恩斯(Canes) ,D等人,癌症期刊(Int J Cancer) 113,841-848。在此研究中，观察到与DMSO对照组相比，在每天接受TSA处理的小鼠中肿瘤生长较慢(图5B)。此外，发现在表面上表达高水平MHC I类的TC-1细胞的致瘤性显著低于A9细胞(图5B)。在用3xl05至4xl05个肿瘤细胞对小鼠实施皮下注射后约3周-1个月TC-1肿瘤开始生长。在用低于3xl05个TC-1肿瘤细胞注射后I个月未检测到肿瘤(数据未显示)。这些观察结果与体外发现相匹配，所述发现表明APM组份表达和MHC I类抗原呈递的增加与较高癌细胞杀灭相关，由此抑制肿瘤生长。
[0073]实例7-由IFN- Y诱导TAP-1的机制.[0074]已知IFN- Y可在癌细胞中作为TAP-1和表面MHC I类表达的有效诱导物(赛特雅迪，A.F等人，上述文献)；然而，关于使IFN-Y诱导TAP-1的分子机制却不为人所知。在此研究中，人们发现IFN- Y处理可提高乙酰基-组蛋白H3和RNA pol II在TAP-1启动子中的水平。附图中的图6同样展示使用抗-RNA pol II或抗乙酰基-组蛋白H3抗体如上所述实施的染色质免疫沉淀。柱:三次实验的平均值；条:SEM。*与未经处理细胞相比，P<.05ο
[0075]先前研究提出，可提高RNA pol II复合物到启动子的募集的转录激活因子应可同时提高启动子区域中的组蛋白乙酰化(史特鲁尔(Struhl)，K.，基因与发育(GenesDev) 12，599-606)。此处所述结果表明，IFN-Y诱导TAP-1的一个可能机制是通过改良组蛋白H3乙酰化来达成，此可使TAP-1启动子区域周围的染色体结构松弛，由此提高通用转录因子和RNA pol II复合物至TAP-1启动子的可达性。
[0076]实例8-鉴定TAP表达细胞和TAP缺陷型细胞中负责不同启动子活性的TAP-1启动子区域。
[0077]通过将全TAP-1启动子(fpTAPl)或其Y末端截短物(427、401和150)克隆至pGL4.14[luc2/Hygro]载体中来制造若`干种TAP-1启动子构建物。附图中的图7展示对负责TAP表达细胞和TAP缺陷型细胞中不同活性的TAP-1启动子区域的分析。
[0078]A，具有转录因子结合基元和5'截短位点的TAP-1启动子序列。任意将TAP-1ATG密码子确定为+1。用(+)来指示位于有义链上的基元并且用(_)来指示位于反义链上的基
J Li ο
[0079]B, PA和LMD细胞系中由全TAP-1启动子和截短TAP-1启动子驱动的萤光素酶的相对活性。如上所述来确定稳定转染子中的RLA。任意将最大值确定为I。柱:四次实验的平均值；条:SEM。
[0080]任意将TAP-1基因的ATG密码子编号为+1，并且根据正向引物的起始碱基相对于ATG密码子的位置来命名截短启动子(图7A)。PA和LMD细胞(分别为TAP表达细胞和TAP缺陷型细胞)的稳定转染子是经3周在潮霉素B中选择转染细胞后获得。然后使用10，000个来自各稳定转染子的细胞实施萤光素酶分析。人们发现，由于自TAP-1启动子(构建物401)的5'末端截短了约160个核苷酸碱基对，因此PA细胞中的萤光素酶表达下降超过3倍，达到与LMD细胞中由全TAP-1启动子驱动的萤光素酶相同的水平(图7B)。最终截短至“150”导致几乎完全丧失启动子活性(图7B)。这些结果表明，结合至LMD细胞的转录激活因子的缺失可能发生在TAP-1启动子的第-557号与大约第-401号碱基之间。
[0081]实例9-分析CREB结合蛋白(CBP)表达和其与TAP-1启动子的关联。
[0082]由于此研究的结果指出组蛋白乙酰化在TAP-1表达调节中具有一定作用，因此进一步研究癌中缺陷型或非功能型TAP-1的转录激活因子/辅激活因子是否具有内在组蛋白乙酰基转移酶(HAT)活性。分析一种具有内在HAT活性的熟知转录辅激活因子(即环AMP反应元件结合(CREB)-结合蛋白(CBP))的功能，这是由于发现CREB结合位点位于据显示在TAP表达细胞和TAP缺陷型细胞中负责不同启动子活性的TAP-1启动子区域内，具体来说位于第-427号和第-401号碱基之间(图7A和7B)。此外，已知CBP可乙酰化组蛋白H3和H4，并且显示各种转录因子可刺激CBP的HAT活性和募集(李古伯(Legube)，G.等人，欧洲分子生物学协会杂志(EMBO R印)4，944-47)，所述转录因子包括结合位点也存于TAP-1启动子中的SP-1和AP-1 (图7A)。
[0083]西方点溃分析显示，在TAP缺陷型癌中CBP并非缺陷型或经截短(数据未显示)。然而，使用对TAP-1启动子5'末端具有特异性的引物实施的染色质免疫沉淀分析显示，在TAP缺陷型癌中结合至所述区域的CBP显著较低(图8-在TAP缺陷型癌中结合至TAP-1启动子的CBP较低并且可通过IFN-Y处理来增强)。如上所述使用抗CBP抗体实施染色质免疫沉淀。柱:四次实验的平均值；条:SEM。*与未经处理细胞相比，P <.05。*与在相同分析中表达最高MHC I类的细胞相比，P <.05。
[0084]此外，发现结合至LMD、Dll和A9细胞TAP-1启动子的CBP在用IFN- Y处理后可增加(图8)。这些结果表明，缺乏由TAP-1启动子中的CBP所发挥的HAT活性使得通用转录因子和RNA pol II复合物不可到达启动子，并且继而影响TAP-1转录。IFN-Y可通过改良诸如CBP等因子的募集来纠正缺陷，此能诱导组蛋白乙酰化，由此改良转录机构至启动子的可达性。
[0085]---------------------
[0086]上文所报告结果显示，在TAP-1基因上结合至启动子和编码区域的RNA pol II水平较低(图2)，并且由于报道分子构建物已整合至TAP缺陷型细胞基因组中，因此启动子活性较低(图1);并且指明存在限制通用转录因子和RNA pol II复合物到达TAP-1启动子的障碍物。启动子区域周围的致密核小体结构似乎可用作阻止转录激活因子结合至启动子，并因而中止转录过程的物理屏障。似乎可显著改良若干种类型基因表达的一种熟知表观遗传学机制是通过基因座中的组蛋白H3尾乙酰化来达成，此可促进所述区域中核小体结构的松弛。此可继而使所述区域对转录机构具有更强可达性。然而，已知组蛋白乙酰化酶和脱乙酰酶选择性作用于基因上，因此不能普遍影响所有基因的转录(史特鲁尔，K，上述文献)。
[0087]在本申请案中表明，在所有测试细胞系中，结合至TAP-1启动子的组蛋白H3的水平表现出与结合至TAP-1基因座的RNA pol I1、TAP-1表达和表面MHC I类表达水平类似的趋势(图2)。这些观察结果表明，TAP-1启动子中组蛋白H3乙酰化水平的差异在TAP-1转录调节中具有一定作用，但其不可能是导致不同基因转录水平的唯一机制，这是因为转录活化一般涉及若干个因子的协同作用。
[0088]用TSA (组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi))处理TAP缺陷型细胞导致结合至TAP-1启动子的RNA pol II和启动子活性显著提高(图3)。在HPV阳性癌模型中，TSA处理将TAP缺陷型细胞中的TAP-1启动子活性增强至与TAP表达细胞中类似的水平。在前列腺癌模型中，尽管TSA处理使得LMD细胞中的TAP-1启动子活性在统计上显著改良，但其中的诱导程度要低于Dll和A9细胞所表现的程度，虽然结合至TAP-1启动子的RNA pol II的诱导程度较高。加上先前观察到，在瞬时和稳定转染子二者中TAP-1启动子驱动的Iuc基因表达水平与内源TAP-1表达谱以同等程度良好匹配(图1)，这就表明在LMD细胞中存在未知的其它机制可损害TAP-1启动子驱动的基因转录。
[0089]在用TSA处理HPV阳性和前列腺癌细胞后所观察到TAP-1表达上调的原因并非是结合至TAP-1启动子自身的乙酰基-组蛋白H3的直接增加(图3)。此表明TSA作用涉及除TAP-1基因近端TAP-1启动子区域内的组蛋白H3直接乙酰化以外的其它机制。此外，这也可能意味着TAP-1启动子中组蛋白H3乙酰化的缺少是由于缺少组蛋白乙酰基转移酶的初始乙酰化所致，而不是由于可受TSA作用抑制的异常组蛋白脱乙酰酶活性所致。
[0090]除TAP-1表达的改良外，用TSA处理也导致若干种其它APM组份(例如TAP-2、LMP-2和泰帕森)和TAP缺陷型细胞中MHC I类表面表达的上调(图4)。此导致VSV感染癌细胞在Kb背景中呈递病毒肽的能力的改良，此继而改良VSV特异性CTL对病毒感染癌细胞的杀灭(图5A)。同样，据显示每天用TSA处理可抑制经A9癌细胞接种的小鼠中的肿瘤生长(图5B)。这些发现鼓励研发目标为以提高病毒或肿瘤抗原呈递的方式来改良特异性CTL对病毒感染细胞或瘤形成细胞的识别和杀灭的治疗方法。
[0091]不论TSA改良MHC I类抗原呈递和CTL杀灭癌细胞的效能如何，TSA处理所导致的诱导程度总是不如IFN-Y产生的效应强(图4-6)。结果显示，一个导致两种物质改良MHC I类抗原呈递的能力不同的关键差异是其增强TAP-1启动子中组蛋白H3乙酰化水平的能力不同。IFN- Y能将TAP缺陷型细胞TAP-1启动子中组蛋白H3乙酰化的水平增强至远高于TSA所能达成者(图3和6)，高至与TAP表达细胞TAP-1启动子中乙酰基-组蛋白H3类似的水平或甚至更高水平。IFN- Y处理可潜在地导致TAP-1基因座周围核小体结构的最大松弛状态，由此使得可`达成足够高的通用转录因子和RNA pol II结合至TAP-1启动子的水平以及基因的有效转录活性。
[0092]此外，人们发现在TAP表达细胞和TAP缺陷型前列腺癌细胞中，TAP-1启动子中负责不同启动子活性的区域位于启动子5'末端区域的第-557号和大约第-401号碱基之间(图7)，并且CREB蛋白结合基元位于其中(图7A)。人们发现TAP缺陷型细胞中结合至此TAP-1启动子区域的CBP水平低于表达较高TAP-1的细胞(图8)，此表明由熟知转录辅激活因子所发挥的组蛋白乙酰基转移酶活性的缺乏在癌细胞TAP-1缺陷中具有一定作用。
[0093]人们发现IFN- Y处理可将TAP缺陷型细胞中CBP与TAP-1启动子的连接增强至与TAP表达细胞中类似的水平(图8)。此效应可归因于IFN- Y诱导的STAT-1a与CBP的连接(参见马(Ma)，Z.等人，白血球生物学杂志(J.Leukoc Biol) 78，515-523)，此可在所述因子与启动子连接后调整TAP-1启动子活性。或者，IFN-Y也可通过STAT-1独立性途径来作用，例如通过IFN-Y活化的新颖转录元件或通过即刻早期蛋白和转录因子来作用(参见勒马纳(Ramana)，C.V.等人，免疫学趋势(Trends Immol.) 23，96-101)。通过同时与基本转录机构和一个或多个上游转录因子交互作用，CBP可用作稳定转录复合物的物理桥梁。
[0094]本文所示结果显示，TAP-1启动子中组蛋白H3乙酰化的缺乏至少部分导致癌细胞抗原加工能力和免疫逃避机制的缺陷。[0095]【参考文献】
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[0107]图9提供以下证据:在C57B1/6小鼠而非免疫缺陷型Ragl+小鼠中，体内TSA处理可抑制源自TAP缺陷型细胞的肿瘤生长，此表明组蛋白脱乙酰酶抑制剂的抗肿瘤效应是由免疫反应所介导，而不是由抑制肿瘤生长或促进肿瘤细胞凋亡的效应所介导。与用DMSO媒剂对照(白条)处理的小鼠相比，在经20天每天用500 μ g/kg TSA (黑条)处理的C57B1/6小鼠中A9肿瘤生长受到抑制。然而，在Ragl+小鼠中TSA处理对A9肿瘤生长无影响。
[0108]在本发明所选实施例中提供对细胞处理方案的分析，所述处理可在细胞中诱发组蛋白脱乙酰酶抑制剂活性并且不诱发促细胞凋亡活性。所述分析可涉及使细胞暴露于一种或多种测试浓度的一种或多种测试化合物；以及对细胞中组蛋白脱乙酰酶活性水平进行分析和对细胞中的细胞凋亡活性水平进行分析。例如，细胞凋亡活性可使用膜联蛋白V分析(例如克隆技术(Clonete c)出售的ApoAlert膜联蛋白V分析)或对纯化半胱天冬酶(例如半胱天冬酶-3/7酶)的活性或抑制的分析来测量。细胞凋亡分析可测量反映磷脂酰丝氨酸(PS;l-3)自质膜的内(细胞质)微区易位至外(细胞表面)微区的特征，所述易位在细胞凋亡诱导后立刻发生(膜联蛋白V蛋白与磷脂酰丝氨酸具有特异性强亲和性，从而使得经标记膜联蛋白V结合提供此一分析的基础)。
[0109]在替代性实施例中，组蛋白脱乙酰酶抑制剂可选自(例如)由以下组成的群组:曲古抑菌素A、缩酚酸肽、辛二酰苯胺异羟肟酸、曲古抑菌素A的酰胺类似物、曲破辛(Trapoxin)、曲破辛的异轻月亏酸类似物、斯瑞普肽(Scriptaid) (6-(1,3- 二氧-1H,3H_苯并[de]异喹啉-2-基)-己酸羟基酰胺)、斯瑞普肽类似物、或其他组蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如道克曼诺维克(Dokmanovic)等人,组蛋白脱乙酰酶抑制剂:综述和展望(HistoneDeacetylase Inhibitors:0verview and Perspectives.),分子癌症石开究(Mol CancerRes)2007 ;5:981-989(以引用方式并入本文中)中所揭示。在某些实施例中，组蛋白脱乙酰酶抑制剂也可为组蛋白甲基化抑制剂(奥(Ou)等人，生化药理学(BiochemicalPharmacology) 73 (2007) 1297-1307，以引用方式并入本文中)，并且也可包括(例如)丁酸钠、4-苯基丁酸酯、和DADS (来自大蒜)。
【权利要求】
1.一种组合物，用于治疗TAP-ι缺陷型癌症，所述组合物包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂和适宜佐剂或载剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述TAP-1缺陷型癌症为黑色素瘤、肺癌、前列腺癌或宫颈癌。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述TAP-1缺陷型癌症表达疱疹病毒抗原。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述TAP-1缺陷型癌症表达乳头状瘤病毒抗原。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述乳头状瘤病毒抗原为E-6和/或E-7。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂为组蛋白H3脱乙酰酶抑制剂。
7.如权利要求1所述的组合物，进一步包含疫苗调配物。
8.一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂在制备用于治疗TAP-1缺陷型癌症的药物的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述TAP-1缺陷型癌症为黑色素瘤、肺癌、前列腺癌或宫颈癌。
10.如权利要求8所述的用途，其中所述TAP-1缺陷型癌症表达疱疹病毒抗原。
11.如权利要求8所述的用途，其中所述TAP-1缺陷型癌症表达乳头状瘤病毒抗原，任选为E-6和/或E-7。
12.如权利要 求11所述的用途，其中所述乳头状瘤病毒抗原为E-6和/或E-7。
13.如权利要求8所述的用途，其中所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂为组蛋白H3脱乙酰酶抑制剂。
【文档编号】A61K45/00GK103800904SQ201310661056
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2008年1月21日 优先权日:2007年1月19日
【发明者】阿尔韦里娜·F·赛蒂亚迪, 米里埃尔·D·戴维, 罗宾·P·塞普, 珍妮弗·哈尔蒂凯琳, 雷沙德·戈保罗, 威尔弗雷德·A·杰弗里斯 申请人:生物防护科技公司