一种天然抗菌肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物医学【技术领域】，具体的说是一种天然抗菌肽QHA及其应用。天然抗菌肽QHA由30个氨基酸残基组成，为直链多肽，分子量3628.5Da，等电点12.61。本发明所述抗菌肽QHA具有分子量小、化学合成方法简单、抗菌作用广谱高效、稳定性好等有益特点，具有广泛的应用前景。此外本发明还涉及抗菌肽QHA的编码基因和应用。
【专利说明】一种天然抗菌肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学【技术领域】，具体的说是一种天然抗菌肽QHA及其应用。
【背景技术】
[0002] 近年来传统抗生素的大规模滥用导致越来越严重的病原微生物耐药问题，给人类 健康带来巨大的威胁。临床上应对耐药微生物感染的措施是使用对耐药微生物尚未使用过 的新的或者替代性的抗生素，因此这就需要持续开发新的抗微生物药物。
[0003] 抗菌肽是生物体基因编码的一种天然小分子多肽，是生物体免疫系统的一种重要 分子，对细菌、真菌、病毒甚至原虫均具有直接的杀灭作用。抗菌肽具有分子量小、结构简 单、抗菌活性强、杀菌机制独特、毒性低和不易引起耐药性等优点，因此自发现之日起就被 认为是具有极大开发潜力的新一代抗生素。到目前为止，已从不同生物体中发现超过1500 多种不同的抗菌肽，而且其数目还在增加。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种天然抗菌肽QHA及其基因和应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0006] -种天然抗菌肽QHA，天然抗菌肽QHA由30个氨基酸残基组成，为直链多肽，分子 量3628. 5Da，等电点12. 61，其氨基酸序列由SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 所述编码天然抗菌肽QHA的前体的基因自5'端至3'端的碱基序列由SEQ ID N0.2 所示。
[0008] 所述SEQ ID NO. 2所示碱基序列可应用于多肽重组表达，转基因动物、植物、植物 部分、动物细胞或植物细胞中。
[0009] -种天然抗菌肽QHA的应用，所述天然抗菌肽QHA可制备抗菌药物、抑制细菌生长 药物、防腐剂、动物饲料或化妆品前体。
[0010] 所述天然抗菌肽QHA可用于制备抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或真菌的药 物或组合物。
[0011] 本发明所具有的优点：
[0012] 本发明所述天然抗菌肽QHA具有分子量小、化学合成方法简单、抗菌作用广谱高 效、稳定性好等有益特点，具有广泛的应用前景。
【具体实施方式】
[0013] 下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容,但本发明的内容并不局限于 此。
[0014] 实施例1
[0015] 天然抗菌肽QHA编码基因的克隆：
[0016] 1)青环海蛇毒腺总RNA提取：
[0017] ①取250mg青环海蛇毒腺组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中， 加入Iml总RNA提取试剂（Trizol，美国Invitrogen公司产品），充分混勻，而后于4?, 12000rpm 离心 lOmin。
[0018] ②离心取上清，加入0. 2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4°C， 12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。
[0019] ③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4°C，12000rpm离心10分钟，收 集沉淀用75% (V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为青环海蛇毒腺总RNA。
[0020] 2)青环海蛇毒腺cDNA文库构建：采用CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit 构建。
[0021] (I) cDNA第一链合成（mRNA反转录）：
[0022] ①经DEPC处理（DEPC处理是在含0· 1%( V/V)DEPC的水浸泡过夜，高压灭菌，烘干） 的离心管中加入1 μ 1青环海蛇毒腺总RNAU μ 13'端一链合成引物（3'In-Fusion SMRTer CDS Primer)和2. 5 μ 1经DEPC处理（DEPC处理是将含0. 1% (V/V) DEPC的水，放置过夜， 高压灭菌）的水使总体积达到4. 5μ 1，混匀后短暂离心（2000rpm，30s)，离心后于72°C保温 3分钟；保温后再将离心管在42°C孵育2分钟。
[0023] ②在上述离心管中加入以下试剂（均为CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit 建库试剂盒中配备），2. 0 μ 15 X 第一链缓 冲液、0·25μ IlOOmM DTT、1.0y IlOmM dNTP Mix、Ι.ΟμΙ SMARTer V Oligonucleotide、 0·25μ I RNase Inhibitor 和 1. Ομ I SMARTScribe Reverse Transcriptase 反转录酶，混 合离心管中试剂并短暂离心（2000rpm，30s)，在42°C保温90min，然后68°C保温lOmin。保 温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2 μ 1所合成的cDNA第一链备 用。
[0024] (2)采用长末端聚合酶链式反应（LD-PCR)方法扩增第二链(所用试剂均为 CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit 建 库试剂盒中配备）
[0025] ①将 2μ1 cDNA 第一链（mRNA 反转录)、80 μ 1 去离子水、10 μ 110 X Advantage2PCR 缓冲液、2 μ 150XdNTP混合物、2 μ 15' PCR引物、2 μ I CDS 111/3' PCR引物以及 2μ 150XAdvantage2Polymerase Mix 在 95°C预热的 PCR 管中进行混合。
[0026] ②在 PCR 仪中按以下程序扩增：95°C，lmin ;18 个循环：95°C，15sec，65°C，30sec， 68°C，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链一 80°C保存。
[0027] (3)抗菌肽QHA编码基因克隆筛选：
[0028] 人工设计合成正向引物进行PCR扩增，其序列为 5'-GAGGATGGAAGGGTTCTTCTGG-3' ， PCR 另一扩增引物为 CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit 中的 3' -PCR 引物，其序列 为 5' -CGGGGTACGATGAGACACCAT-3'。PCR 反应在如下条件下进行：94°C 5min，94°C 30sec， 58°C 3〇sec和72°C lmin，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物）进行目的片 段回收。将回收的目的片段连接到PMD19-T载体（Takara，大连），转化进CaCl 2-MgCldi 制备好的DH5 α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素和蓝白斑双重筛选，挑取单菌落用M13 引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer，model ABI PRISM377 进行核苷酸测序。
[0029] 测定结果：
[0030] SEQ ID NO. 2所示的编码抗菌肽QHA前体的基因自5'端至3'端序列为：
[0031] atgcaagggttcttctggaagaccttgctggtggttgcagctctcaccatcggtgggacc tcctccct tccacacaaacccctgacctatgaggaggccgtggaccttgcagtgagcatc tacaacagcaaatctagggaagag ttcctgtaccgtgtcctggatgctgttcctccaccc aagtgggatcctctttctgaaagcaaccaagagctgaact tcactatcaaggagacggtg tgcccggtggccgaagaacggtccttggaggaatgcggcttccaggaagacggggc cgtc atgggatgcacaggctactttttctttggcgagtcgcccccggtgctggttctcacctgc gagcctttggt tgaagaagagcagcagaagcaggaggaggggaacgaggaggagaaggag gaaaaggaggaagacgagaaggatcag cccaggagggtcaagaggttcaggaaatttttc aaaaggctgctgaagagcgtgaggcgtgcagtcaagaaattca ggaagaagccgaggctc atcgggctctccaccctcctctaagagagggactcggaaggaccggcagcctccactct c tgatcccaggaaaaccggtagagaaaatgaggccggctgctccagtccgtcagatcattt cccgataggatgct
[0032] 其中编码抗菌肽QHA为第472-561位核苷酸。
[0033] 抗菌肽QHA前体的编码基因核苷酸序列表为：序列长度为732个碱基，序列类型： 核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：青环海蛇毒腺。
[0034] 实施例2
[0035] 抗菌肽QHA的化学合成：
[0036] I、抗菌肽QHA的化学合成方法：根据基因推导的成熟肽氨基酸序列，用自动多肽 合成仪（433A, Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐。
[0037] II、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-T0F)。
[0038] III、纯化的抗菌肽QHA用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基 质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-T0F)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸 测序仪测定氨基酸序列结构。
[0039] 抗菌肽QHA是抗菌肽QHA编码基因编码的一种直链多肽，含有三十个氨基酸残基， 分子量3628. 5Da，等电点12. 61。其SEQ ID NO. 1氨基酸序列为：
[0040] LyslPhe2Phe3Lys4Arg 5Leu6Leu7Lys8Ser9Val i0ArgllArgi2Alai3Vali4Lys 15Lys16Phe17Arg1 8Lys19Lys2°Pro21Arg22Leu 23Ile24Gly25Leu26Ser27Thr 28Leu29Leu30。
[0041] 实施例3
[0042] 抗菌肽QHA抗菌活性检测：
[0043] (1)分别挑取保存于斜面上的试验菌株均匀涂布于MH固体培养基(购自青岛海博 生物技术有限公司）平板上，将经过灭菌的〇. 5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解 于灭菌去离子水的2mg/ml的抗菌肽QHA样品溶液10 μ 1，于37°C倒置培养18 - 20小时， 观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑 菌圈越大表明样品抗菌活性越强。
[0044] (2)抗菌肤 QHA 最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration)测定（2 倍 稀释法）：
[0045] 选择上步实验中具有抑菌圈的菌株进行MIC测定实验。试验菌株接种到MH液体 培养基(青岛海博生物技术有限公司）中，37°C振荡培养到对数生长期，而后用新鲜MH液体 培养基将培养至对数生长期的培养液稀释到2X 105cfu/ml待用。
[0046] 在无菌96孔板各孔中预先加入100 μ I MH液体培养基，然后在第一孔中加入 100 μ 1用MH液体培养基稀释到一定浓度的经0. 22mm孔滤膜过滤的的抗菌肽QHA样品溶 液，混匀后取100 μ 1加入第2孔，依次倍比稀释(参见表1 )，自第9孔吸出100 μ 1弃去，第 10孔系对照管。
[0047] 表· 1稀释方法
【权利要求】
1. 一种天然抗菌肽QHA，其特征在于：天然抗菌肽QHA由30个氨基酸残基组成，为直链 多肽，分子量3628. 5Da，等电点12. 61，其氨基酸序列由SEQ ID NO. 1所示。
2. 按权利要求1所述抗菌肽QHA，其特征在于：所述编码抗菌肽QHA的前体的基因自5' 端至3'端的碱基序列由SEQ ID NO. 2所示。
3. 按权利要求3所述的抗菌肽QHA，其特征在于： 所述SEQ ID NO. 2所示碱基序列可应用于多肽重组表达，转基因动物、植物、植物部分、 动物细胞或植物细胞中。
4. 一种按权利要求1所述的抗菌肽QHA的应用，其特征在于：所述抗菌肽QHA可制备 抗菌药物、抑制细菌生长药物、防腐剂、动物饲料或化妆品前体。
5. 按权利要求4所述的抗菌肽QHA的应用，其特征在于：所述抗菌肽QHA可用于制备 抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或真菌的药物或组合物。
【文档编号】A61K8/64GK104497119SQ201310660578
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】王义鹏 申请人:王义鹏