凝胶-plga双相梯度过渡的软骨-骨修复材料及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种凝胶-聚(丙交酯-co-乙交酯)(PLGA)双相梯度过渡的软骨-骨修复材料及制备。该材料为圆柱体，由上下两种材料构成，其中上部为甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖和明胶，下部为多孔的PLGA。其制备过程：以明胶微球为致孔剂制备为一端面为锥形凹面的PLGA多孔支架；以改性壳聚糖和改性明胶配制凝胶溶液；在锥形凹面的PLGA多孔支架上滴加凝胶溶液，倒置，经紫外光交联得到凝胶-PLGA双相梯度过渡的软骨-骨修复材料。该材料具有良好的生物相容和可降解性，材质为两相梯度过渡结构，结合紧密不脱落，制备过程简单。
【专利说明】凝胶-PLGA双相梯度过渡的软骨-骨修复材料及制备
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种凝胶-聚(丙交酯-CO-乙交酯)(PLGA)双相梯度过渡的软骨-骨修复支架材料及制备方法，属于软骨-骨界面组织修复生物材料领域。
【背景技术】
[0002]软骨-骨、肌腱-骨、韧带-骨等骨界面组织在解剖结构和组织成分上是不均一的，而具备结构和组成连续梯度变化的特征，所以为了实现界面组织的良好修复，需要设计理想的功能化梯度的支架(Leong K F，Chua C K, Sudarmadji N, Yeong W Y, Journalof the Mechanical Behavior of Biomedical Materials, 2008, 1(2): 140-152)。
[0003]针对于软骨-骨界面，其在组成、结构和力学性能具有显著的差异，目前，有报道已经制备了组成、结构、生物活性因子含量的梯度支架。Tempieri等人通过生物诱导矿化法制备了组成和形貌梯度分布的透明质酸镁-胶原复合支架，此支架不同的区域可以选择性地诱导细胞向成骨或者软骨分化(Tampieri A, Sandri M, Landi E, Pressato D,Francioli S， Quarto R, Martin I, Biomaterials, 2008, 29 (26): 3539-3546)。 Kon等人分别制备不同I型胶原和羟基磷灰石含量的支架层，然后得到组成不同的三层支架，对梯度支架进行关节软骨修复的临床实验表明梯度支架比较安全稳定，病人得到了较满意的治疗效果(Kon E, Delcogliano M, Filardo G, Pressato D, Busacca M, Grigolo B,Desando G, Marcacci M, Injury-1nternational Journal of the Care of the Injured,2010，41(7): 778-786)。为了更好的模拟软骨-骨界面的力学性能，并分别支持软骨和成骨细胞的生长和分化，研究者制备出了结合凝胶与多孔支架的多相支架。Rodrigues等人制备出上层为琼脂糖凝胶，下层为淀粉/聚己内酯的双相支架，分别支持羊水干细胞向软骨及成骨分化(Rodrigues M T, Lee S J, Gomes M E, Reis R L, Atala A, Yoo J J, ActaBiomaterialia, 2012，8 (7): 2795-2806)。双相支架中凝胶相可以很好的模拟软骨细胞的体内生长环境，支持干细胞向软骨方向分化；而硬的部分可以提供相当骨的力学性能，促进干细胞向骨分化。
[0004]针对软骨- 骨界面组成及性质的梯度过渡特征，需要连续梯度组成和生物活性信号的诱导来加强软骨-骨界面的修复，因此研究者提出制备具有连续梯度物理及化学性质的支架(Mohan N, Dormer N H, Caldwell K L, Key V H, Berkland C J, Detamore M S,Tissue Engineering Part A, 2011, 17(21/22): 2845-2855)。目前，利用微流体设备和静电纺丝设备已经能够制备出连续梯度的电纺膜支架(Zhang X，Gao XH, Jiang L, Qin JH, Langmuir, 2012，28(26)，10026-10032 ； Li XR, MacEwan M R, Xie J ff, Siewe D,Yuan X Y, Xia Y N, Advance Functional Materials, 2010, 20 (10): 1632-1637)。
[0005]现有的用于软骨-骨修复的多相梯度支架的制备大都不能实现过渡区组分的连续梯度，并且各层间容易脱落分离，采用锥形结构实现上下两相间的连续梯度过渡，同时凝胶相部分渗透到PLGA多孔支架使两相紧密结合的制备方法未见文献报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种凝胶-聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)双相梯度过渡的软骨-骨修复材料及制备方法。该材料具有良好的生物相容和可降解性，材质为两相梯度过渡结构，结合紧密不脱落，而且制备过程简单。
[0007]为达到上述目的，本发明是通过下述技术方案加以实现的:一种凝胶-聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)双相梯度过渡的软骨-骨修复材料，其特征在于，该软骨-骨修复材料其形状为圆柱体，由上下两种不同材料及两部分材料之间以凹锥嵌入结合而成，其中下部材料为孔径为350-450 μ m的聚(丙交酯_co_乙交酯)(PLGA)材料，上部材料为由甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖和甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的明胶按质量比为1: (8~10)组成。
[0008]上述的聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)的数均分子量为(5~12)' 104 ；甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的明胶的分子量为0-7)'104 ;甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖的重均分子量为(0.8~1.2)' 104。
[0009]上述的凝胶-聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)双相梯度过渡的软骨-骨修复材料的制备方法，其特征在于包括以下过程:
1)将直径为350-450μ m的明胶微球放于圆柱模板中，并使明胶微球上表面形成到圆锥面，向明胶层滴入乙醇与水比例为8/2的溶液，在37°C下交联l0-30min，得到明胶骨架；
2)将步骤I)制得的明胶骨架浸入质量浓度为5~9%的聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)的二氯甲烷溶液中，使溶液充分进入明胶间隙中，形成明胶圆柱体。将明胶圆柱体取出，在-20°C下进行相分离12h，在乙醇中置换二氯甲烷溶剂，最后在37°C的水中洗去明胶，得到一端为倒圆锥口的孔径为350-450 μ m的聚(丙交酯_co-乙交酯)(PLGA)材料的圆柱体，将其在_20°C存放备用；
3)按质量比1:(6~10)将甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖和甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的明胶，在40°C下溶于浓度为0.1M、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中，配制成质量浓度为9%的溶液，再向溶液中加入与改性羧甲基壳聚糖和改性的明胶质量之和的1-2倍的分子量为875的聚乙二醇，然后加入按改性羧甲基壳聚糖和改性明胶总质量的1- 5%的光交联剂2959，得到凝胶前驱体溶液；
4)将步骤2)制得的多孔的聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)材料的圆柱体以倒圆锥口朝上放入等直径的一端封闭的圆管内，再向圆管内滴加步骤3)制得的凝胶前驱体溶液，滴加高度与多孔的聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)圆柱体等高，然后立刻将该圆管倒置，放入紫外交联箱中，在波长为365nm的紫外光下照射交联5~10min，得到凝胶-聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)双相梯度过渡的软骨-骨修复材料。
[0010]本发明的优点在于，聚(丙交酯-CO-乙交酯)(PLGA)相与改性壳聚糖和改性明胶的凝胶相以凹锥嵌入结构实现连续梯度过渡，且两相间紧密结合不易分离脱落，其制备过程简单。同时，该软骨-骨修复材料具有良好的生物相容性、生物可降解性，可用于软骨-骨界面组织修复生物材料领域。
【具体实施方式】
[0011]实施例11.称取0.1lg直径为350~450 μ m的明胶微球放于直径为6mm的柱状模板中，然后压入尖端为锥形的玻璃模具(直径为5mm，锥形高度为2mm)，滴入100 μ L乙醇与水比例为8/2的溶液，在37°C下交联15min，得到明胶骨架。
[0012]2.将明胶骨架浸入浓度为7%的聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)的二氯甲烷溶液中，浸泡12h，在真空烘箱中抽去孔中气体，保证溶液完全进入。取出支架，吸干表面溶液，在冰箱中(_20°C)相分离12h，乙醇置换12h。最后在37°C的水中洗去明胶骨架，得到高度为4mm,直径为5mm, —端面为锥形凹面的聚(丙交酯_co_乙交酯)(PLGA)多孔支架。将支架在真空烘箱中干燥，_20°C存放。
[0013]3.称取8.9mg甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖和71.1mg甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的明胶，在40°C下溶于ImL浓度为0.1M, pH为7.4的磷酸盐缓冲液中，加入80 μ L分子量为875的聚乙二醇，然后加入16 μ L的浓度为100mg/mL的光交联剂2959的乙醇溶液，得到凝胶溶液。
[0014]4.将步骤2制得的聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)支架以锥形凹面向上放于一端封闭的直径为5mm的玻璃管中，然后再向玻璃管中滴加步骤3所制得的凝胶溶液，滴加高度为4_，迅速将玻璃管倒置，然后将其放入紫外交联箱中，在365nm波长紫外光下交联7min，得到凝胶-聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)双相梯度过渡的软骨-骨修复材料。
[0015]实施例2
1.称取0.15g直径为350~450 μ m的明胶微球放于直径为6mm的柱状模板中，然后压入尖端为锥形的玻璃模具(直径为5mm，锥形高度为3mm)，滴入100 μ L乙醇与水比例为8/2的溶液，在37°C下交联30min，得到明胶骨架。
[0016]2.将明胶骨架浸入浓度为6%的聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)的二氯甲烷溶液中，浸泡12h，在真空烘箱中抽 去孔中气体，保证溶液完全进入。取出支架，吸干表面溶液，在冰箱中(_20°C)相分离12h，乙醇置换12h。最后在37°C的水中洗去明胶骨架，得到高度为6mm,直径为5mm, —端面为锥形凹面的聚(丙交酯_co_乙交酯)(PLGA)多孔支架。将支架在真空烘箱中干燥，_20°C存放。
[0017]3.称取5.6mg甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖和50mg甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的明胶，在40°C下溶于ImL浓度为0.1M, pH为7.4的磷酸盐缓冲液中，加入70 μ L分子量为875的聚乙二醇，然后加入10 μ L的浓度为100mg/mL的光交联剂2959的乙醇溶液，得到凝胶溶液。
[0018]4.将步骤2制得的聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)支架以锥形凹面向上放于一端封闭的直径为5mm的玻璃管中，然后再向玻璃管中滴加步骤3所制得的凝胶溶液，滴加高度为6_，迅速将玻璃管倒置，然后将其放入紫外交联箱中，在365nm波长紫外光下交联lOmin，得到凝胶-聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)双相梯度过渡的软骨-骨修复材料。
[0019]实施例3:
1.称取0.1lg直径为350~450 μ m的明胶微球放于直径为6mm的柱状模板中，然后压入尖端为锥形的玻璃模具(直径为5mm，锥形高度为2mm)，滴入100 μ L乙醇与水比例为8/2的溶液，在37°C下交联15min，得到明胶骨架。
[0020]2.将明胶骨架浸入浓度为9%的聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)的二氯甲烷溶液中，浸泡12h，在真空烘箱中抽去孔中气体，保证溶液完全进入。取出支架，吸干表面溶液，在冰箱中(_20°C)相分离12h，乙醇置换12h。最后在37°C的水中洗去明胶骨架，得到高度为4mm,直径为5mm, —端面为锥形凹面的聚(丙交酯_co_乙交酯)(PLGA)多孔支架。将支架在真空烘箱中干燥，_20°C存放。
[0021]3.称取12mg甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖和90mg甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的明胶，在40°C下溶于ImL浓度为0.1M, pH为7.4的磷酸盐缓冲液中，加入100 μ L分子量为875的聚乙二醇，然后加入30 μ L的浓度为100mg/mL的光交联剂2959的乙醇溶液，得到凝胶溶液。 [0022]4.将步骤2制得的聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)支架以锥形凹面向上放于一端封闭的直径为5mm的玻璃管中，然后再向玻璃管中滴加步骤3所制得的凝胶溶液，滴加高度为6_，迅速将玻璃管倒置，然后将其放入紫外交联箱中，在365nm波长紫外光下交联5min，得到凝胶-聚(丙交酯-Co-乙交酯)(PLGA)双相梯度过渡的软骨-骨修复材料。
【权利要求】
1.一种凝胶-聚(丙交酯-CO-乙交酯)双相梯度过渡的软骨-骨修复材料，其特征在于，该软骨-骨修复材料其形状为圆柱体，由上下两种不同材料及两部分材料之间以凹锥嵌入结合而成，其中下部材料为孔径为350-450μπι的聚(丙交酯-Co-乙交酯)材料，上部材料为由甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖和甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的明胶按质量比为1: (8~10)组成。
2.按权利要求1所述的凝胶-聚(丙交酯-Co-乙交酯)双相梯度过渡的软骨-骨修复材料，其特征在于，聚(丙交酯-Co-乙交酯)的数均分子量为(5~12厂104;甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的明胶的分子量为0-7)'IO4 ;甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖的重均分子量为(0.8~1.2广104。
3.一种按权利要求1所述的凝胶-聚(丙交酯-Co-乙交酯)双相梯度过渡的软骨-骨修复材料的制备方法，其特征在于包括以下过程: 1)将直径为350-450μ m的明胶微球放于圆柱模板中，并使明胶微球上表面形成到圆锥面，向明胶层滴入乙醇与水比例为8/2的溶液，在37°C下交联l(T30min，得到明胶骨架； 2)将步骤I)制得的明胶骨架浸入质量浓度为5~9%的聚(丙交酯-Co-乙交酯)的二氯甲烷溶液中，使溶液充分进入明胶间隙中，形成明胶圆柱体，将明胶圆柱体取出，在_20°C下进行相分离12h，在乙醇中置换二氯甲烷溶剂，最后在37°C的水中洗去明胶，得到一端为倒圆锥口的孔径为350-450μπι的聚(丙交酯-Co-乙交酯)材料的圆柱体，将其在-20°C存放备用； 3)按质量比1:(6~10)将甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的羧甲基壳聚糖和甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的明胶，在40°C下溶于浓度为0.1M、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中，配制成质量浓度为9%的溶液，再向溶液中加入与改性羧甲基壳聚糖和改性的明胶质量之和的1~2倍的分子量为875的聚乙二醇，然后加入按改性羧甲基壳聚糖和改性明胶总质量的广5%的光交联剂2959，得到凝胶前驱体溶液； 4)将步骤2)制得的多孔的聚(丙交酯-Co-乙交酯)材料的圆柱体以倒圆锥口朝上放入等直径的一端封闭的圆管内，再向圆管内滴加步骤3)制得的凝胶前驱体溶液，滴加高度与多孔的聚(丙交酯-Co-乙交酯)圆柱体等高，然后立刻将该圆管倒置，放入紫外交联箱中，在波长为365nm的紫外光下照射交联5~10min，得到凝胶-聚(丙交酯-co_乙交酯)双相梯度过渡的软骨-骨修复材料。
【文档编号】A61L27/26GK103656745SQ201310673227
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】袁晓燕, 韩凤选, 赵蕴慧, 杨晓玲 申请人:天津大学