猪a型产气荚膜梭菌氢氧化铝灭活疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种猪A型产气荚膜梭菌氢氧化铝灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：1）刮取因梭菌胀气而死亡的病猪的肠内容物；2）高压灭菌牛奶作为培养基，待牛奶培养基冷却到80℃将病料倒入培养基中，继续厌氧培养；3）离心过滤沉淀，得到澄清的毒素液；4）加入毒素液总重0.4%的甲醛，灭活脱毒；5）将灭活脱毒的毒素液与氢氧化铝佐剂按照4：1的重量比混合，高速搅拌合成疫苗。本发明的有益效果为：以牛奶作为培养基生产A型梭菌疫苗，成本低廉，培养过程简单、方便、快速；以氢氧化铝作为佐剂，加强灭活苗的作用，并能减少注射疫苗后的不良反应；本灭活疫苗免疫保护率高，因此，是安全、有效的猪A型魏氏梭菌氢氧化铝灭活疫苗。
【专利说明】猪A型产气荚膜梭菌氢氧化铝灭活疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种猪A型产气荚膜梭菌氢氧化铝灭活疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002]产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium Perfringens),又称魏氏梭菌(Clostridium welchii)，本菌可产生多种外毒素及酶类。根据魏氏梭菌所合成分泌的主要毒素，可以将其分为A，B，C，D，E型，其中A型能够感染到人，形成气肿疽，死亡率不一，B、C、D型特别与动物的肠道感染关系密切。该菌株各种普通培养基中均能迅速生长，最突出的生化特性是对石蕊牛乳培养基的“爆裂发酵”，可用于快速诊断。该菌在体内能形成明显的荚膜，无鞭毛，不能运动。在自然界常以芽孢形式存在，但芽孢形成较困难。芽孢的抵抗力非常强，10%福尔马林10分钟才能将其致死。该菌广泛分布于自然界，遍布世界各地，同时也是肠道中常在的菌群之一，在一定条件下，可引起各种严重疾病。该菌能产生多种强烈的外毒素，目前发现的有 12 种(α，β，Y，η , δ , ε , θ , ι，κ，λ，μ，ν )，其中，α，β，ε和ι是主要的致死毒素。依据主要致死毒素与其抗毒素的中和试验，可将此菌分为Α，B，C，D，E五个型。
[0003]A型产气荚膜梭菌主要引起胃肠道的病变，是人畜气性坏疽病，兔梭菌性下痢，马坏死性肠炎及人食物中毒的主要致病菌，也是引起鹿出血性肠炎的主要致病菌。该型菌产生的多种外毒素中，最主要的是α毒素。
[0004]为了控制产气荚膜梭菌病毒流行，许多学者曾在细胞水平上研究过产气荚膜梭菌的单联和多联灭活菌苗用于预防。陈锡全等进行了 “兔病毒性出血症”和A型产气荚膜梭菌联苗的研究；姚湘燕等采用三个不同地方的牛源产气荚膜梭菌研制过牛产气荚膜梭菌浓缩氢氧化铝灭活苗，证实该苗安全性好，免疫后30天以2个致死量强毒攻击，可获100%保护,免疫后200天内以同样剂量攻击仍可获90%保护；阎喜军等对吉林鹿出血性肠炎流行情况进行了调查，之后研制了鹿魏氏梭菌单价灭活苗，疫苗使用安全，免疫效果可靠；谭诗文等曾经进行了羔羊痢疾，大肠杆菌病，羊猝疽，羊肠毒血症四联油佐剂灭活苗的研制；屠伟英等研制了仔猪产气荚膜梭菌肠毒血症疫苗；徐为中等研制了兔病毒性出血症，多杀性巴氏杆菌病，A型产气荚膜梭菌病三联浓缩灭活苗，对产气荚膜梭菌的保护率达8 O %以上；宁玉容等研制了羊四种梭菌病疫苗，该苗的免疫期限为一年，肠毒血症暂定为半年。
[0005]已研制出的疫苗在使用中尚存在一些需要进一步解决的问题:1.家畜接种反应较重；2.注射剂量大，使用多有不便；3.制备过程繁琐，时间较长。因此，需要改进制备过程和筛选培养基和佐剂，以快速制备出高效的疫苗，来提高疫苗免疫原性和集体免疫应答水平。 [0006]佐剂的种类很多，按其作用机理分为吸附佐剂，颗粒佐剂，免疫调节因子等；也可按其来源分为植物来源，微生物及生物来源，人工合成有机物和无机盐等。有些是由不同来源的物质配制而成的。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种猪A型产气荚膜梭菌氢氧化铝灭活疫苗的制备方法，以克服现有技术存在的上述不足。
[0008]本发明的目的是通过以下技术方案来实现:
一种猪A型产气荚膜梭菌氢氧化铝灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤:
1)将由梭菌致死的病猪挑选病料，刮取肠道内容物，冷藏或冷冻；
2)用纯牛奶作为培养基，高压锅内121°C高压灭菌，待到温度降到80°C时，把病料倒入高压锅内，厌氧培养；
3)将步骤2)中高压厌氧培养的菌液过滤离心，得到上清液为毒素液；
4)在步骤3)中得到的毒素液中加入0.4%的甲醛，充分振摇，灭活脱毒；以及
5)将灭活脱毒的毒素液与氢氧化铝佐剂按照4:1的重量比混合，高速搅拌后合成疫苗。
[0009]进一步的，所述步骤I)中，冷冻温度为_20°C。
[0010]进一步的，所述步骤2)中，厌氧培养条件为在37°C下培养10-18 h。
[0011]进一步的,所述步骤3)中，过滤离心条件为在3000 r/min下离心20min。
[0012]进一步的，所述步骤4)中，灭活脱毒条件是37 °C下灭活脱毒3-5天。
[0013]进一步的，所述步骤4)`中，灭活脱毒期间每隔4小时间断振摇。
[0014]本发明的有益效果为:1、刮取肠道内容物为病原，以优势牛奶爆裂发酵而产生多量的毒素液。
[0015]2、以牛奶为培养基和以氢氧化铝为佐剂，成品低廉，用料方便，生产快速，疫苗刺激性小，不影响精神，食欲，注射局部无肿胀，无坏死。
[0016]3、该疫苗可在较大的温度范围下保存运输，0-30°C环境中保存6个月不变色，不分层，不影响免疫期。
[0017]4、本发明在疫苗制备工艺中选用纯牛奶做为培养基，用高压锅进行高压灭菌，厌氧培养和爆裂发酵，培养出来的菌苗质量好，保护率高。
【具体实施方式】
[0018]本发明实施例所述的一种猪A型产气荚膜梭菌氢氧化铝灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤:
1)将由梭菌致死的病猪挑选病料，刮取肠道内容物，冷藏或冷冻；
2)用纯牛奶作为培养基，高压锅内121°C高压灭菌，待到温度降到80°C时，把病料倒入高压锅内，厌氧培养；
3)将步骤2)中高压厌氧培养的菌液过滤离心，得到上清液为毒素液；
4)在步骤3)中得到的毒素液中加入0.4%的甲醛，充分振摇，灭活脱毒；以及
5)将灭活脱毒的毒素液与氢氧化铝佐剂按照4:1的重量比混合，高速搅拌后合成疫
苗；
所述步骤I)中，冷冻温度为-20°C ;所述步骤2)中，厌氧培养条件为在37°C下培养10-18 h ;所述步骤3)中，过滤离心条件为在3000 r/min下离心20min ;所述步骤4)中，灭活脱毒条件是37°C下灭活脱毒3-5天；所述步骤4)中，灭活脱毒期间每隔4小时间断振摇。
[0019]猪A型魏氏梭菌疫苗的检验方法
I)本品静置后，上层为无色液体，下层为乳白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。
[0020]2)无菌检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，应无菌生长。
[0021]3)安全检验用2-6月龄健康易感猪5只，各皮下注射疫苗6ml，连续观察10日，应全部健活。
[0022]4)效力检验用2-6月龄健康易感猪5只，各皮下注射疫苗2ml,同时设不接种对照猪5只。免疫后14天采血，分离血清，分别测定抗梭菌HI抗体，免疫猪抗梭菌HI抗体均应^ 1:32，对照猪抗梭菌HI抗体均应< 1:4。
[0023]甲醛残留量测定
按《中国兽药典》附录进行测定，应符合兽用生物制品通则的规定。
[0024]猪A型魏氏梭菌灭活疫苗安全性试验
(I)最小使用日龄猪一次单剂量接种疫苗的安全性试验取30日龄健康易感猪20只，随机分成4组，5只/组。前3组分别脖子肌肉注射按本发明提供的方法制备的3个批次的疫苗(第I批、第2批和第3批)，2ml/只；第4组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察犬精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应。
[0025]结果:经肌肉注射一次单剂量后，猪精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身未见不良反应，所有猪均健活。
[0026](2)单剂量重复接种 疫苗的安全性试验取30日龄健康易感猪20只，随机分成4组，5只/组。前3组分别肌肉接种以上制备的3个批次的疫苗，2ml/只，14日后加强免疫一次，2ml/只；第4组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察猪精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应。
[0027]结果:经肌肉途径重复接种疫苗后，猪精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身未见不良反应，所有猪均健活。
[0028](3)—次超剂量接种疫苗的安全性试验取30日龄健康易感猪20只，随机分成4组，5只/组。前3组分别肌肉接种3个批次疫苗，6ml/只；第4组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察猪精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应。
[0029](4)疫苗对怀孕母猪的安全性试验取怀孕母猪10只，随机分成2组，5只/组。第I组于产前20日肌肉接种疫苗，8ml/只；第2组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察猪精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应，并跟踪观察其产仔情况。
[0030]结果:怀孕母猪于产前20龄经肌肉超剂量接种后，母猪精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身未见不良反应，所有猪均健活，且产仔正常。
[0031](5)结论用3批猪A型魏氏梭菌灭活苗进行了一次单剂量接种的安全试验、单剂量重复接种的安全性试验、一次超剂量接种的安全试验，结果均是安全的。表明该疫苗用于免疫接种猪是安全的。
[0032]猪A型魏氏梭菌灭活疫苗效力试验
取以上本发明人制备的3批猪A型魏氏梭菌灭活疫苗，取健康易感猪20只，随机分为4组，5只/组。1、2、3组猪分别肌肉接种3批疫苗2ml/只，对照组不进行免疫。3个免疫组合对照组在免疫后14日口服梭菌活培养液15ml攻毒，观察10日，记录发病情况。
[0033]结果:3批疫苗试验结果无明显差异。疫苗免疫后14日，对梭菌活培养液攻毒的保护率均为100%。
[0034]本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形 状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种猪A型产气荚膜梭菌氢氧化铝灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将由梭菌致死的病猪挑选病料，刮取肠道内容物，冷藏或冷冻； 2)用纯牛奶作为培养基，高压锅内121°C高压灭菌，待到温度降到80°C时，把病料倒入高压锅内，厌氧培养； 3)将步骤2)中高压厌氧培养的菌液过滤离心，得到上清液为毒素液； 4)在步骤3)中得到的毒素液中加入0.4%的甲醛，充分振摇，灭活脱毒；以及 5)将灭活脱毒的毒素液与氢氧化铝佐剂按照4:1的重量比混合，高速搅拌后合成疫 苗。
2.根据权利要求1所述的猪A型产气荚膜梭菌氢氧化铝灭活疫苗的制备方法，其特征在于:所述步骤I)中，冷冻温度为-20°C。
3.根据权利要求1所述的猪A型产气荚膜梭菌氢氧化铝灭活疫苗的制备方法，其特征在于:所述步骤2)中，厌氧培养条件为在37°C下培养10-18 h。
4.根据权利要求1所述的猪A型产气荚膜梭菌氢氧化铝灭活疫苗的制备方法，其特征在于:所述步骤3)中，过滤离心条件为在3000转/分钟下离心20分钟。
5.根据权利要求1所述的猪A型产气荚膜梭菌氢氧化铝灭活疫苗的制备方法，其特征在于:所述步骤4)中，灭活脱毒条件是37°C下灭活脱毒3-5天。
6.根据权利要求5所述的猪A型产气荚膜梭菌氢氧化铝灭活疫苗的制备方法，其特征在于:所述步骤4)中，灭活脱毒期间每隔4小时间断振摇。
【文档编号】A61K39/08GK103721254SQ201310749053
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】杨耀光, 张俊清, 高志勇, 郝俊飞, 黄建华, 赵建红 申请人:鄂尔多斯市旭和畜牧有限责任公司, 内蒙古中草药防治动物疾病研究院